CN101509044B - 日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，涉及一种病毒基因诊断试剂盒。本试剂盒由以下试剂组成：试剂A是组织匀浆缓冲液，为Tris-NaCl-EDTA缓冲液；试剂B是RNA提取液，为Trizol液；试剂C是日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录反应液，其中含有特定引物MnRV-325R；试剂D是PCR反应液，其中含有特定引物MnRV 325R及MnRV 325F；试剂E液是阳性对照，为MnRV阳性DNA模板。本发明能快速、灵敏、准确地检测出日本沼虾苗种、虾、成虾及亲虾是否携带日本沼虾呼肠孤病毒。

Description

日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种病毒基因诊断试剂盒，尤其涉及一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒。

背景技术

河虾(Macrobrachium nipponensede Haan)，又名青虾，学名为日本沼虾，为日本和我国所特有淡水虾类。它营养丰富，肉嫩味美，是一种深受人们喜爱的名贵水产品。在研究河虾病害的过程中，从湖北省某养殖场分离到一株呼肠孤病毒(命名为MnRV，Macrobrachium nipponensede Reovirus)。目前对病毒病尚无治疗办法。因此，建立灵敏准确的早期检测技术对于预防疾病，减少经济损失具有重要意义。目前没有关于此种病毒检测技术的专利和报道。

发明内容

本发明的目的是填补现有技术的空白，提供一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

根据日本沼虾呼肠孤病毒的基因组序列设计一对特异性引物，采用RT-PCR的方法，可以对日本沼虾是否感染呼肠孤病毒进行检测。

1、一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒(简称本试剂盒)

试剂A：组织匀浆缓冲液，为Tris-NaCl-EDTA缓冲液；

试剂B：RNA提取液，为Trizol液；

试剂C：日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录反应液，其中含有特定引物MnRV-325R，其序列为：5′-TCGTAAGGTGTAGGTTGTGAT-3′；

试剂D：PCR反应液，其中含有特定引物MnRV 325R及MnRV 325F，其序列为：

MnRV-325R 5′-TCGTAAGGTGTAGGTTGTGAT-3′；

MnRV-325F 5′-CAAACGAATTAAATGATGATG-3′；

试剂E液：阳性对照，为MnRV阳性DNA模板。

2、本试剂盒的获得方法

本试剂盒的所有试剂均购自商业化公司。

3、本试剂盒的用途

本试剂盒的用途就在于能检测出日本沼虾苗种、虾、成虾及亲虾是否携带日本沼虾呼肠孤病毒。

本发明具有下列优点和积极效果：

1、本发明能快速、灵敏、准确地检测出日本沼虾苗种、虾、成虾及亲虾是否携带日本沼虾呼肠孤病毒；

2、本发明适用于检测日本沼虾呼肠孤病毒。

附图说明

图1是PCR产物电泳结果图。

具体实施方式

一、本试剂盒的几种试剂的组成

1、试剂A液、试剂B液为常用试剂。

2、试剂C液

试剂C液是含有日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录反应液，每管组成为：

4μl 5×RNA反转录缓冲液，

2μl l0mM MgCl₂，

8μl  RNase Free H₂O，

1μl l0mM dNTP Mixture，

lμl 1u RNsin，

1μl 1u M-MLV ReverseTranscriptase，

1μl 10pM MnRV-325R。

3、试剂D液

试剂D液是PCR反应液，每管组成为：

2mM MgCl₂，

5μl 10×PCR缓冲液，

41μl ddH₂O，

2U Taq酶，

10pM MnRV-325R及MnRV-325F。

二、本试剂盒的使用方法如下：

①日本沼虾组织的匀浆

待检日本沼虾组织100-200mg加入100μl试剂A在冰上混匀，捣碎匀浆；冰上静置15分钟。

②日本沼虾呼肠孤病毒RNA的提取

在4℃以12000g离心5分钟；将水相(上层)转至一个新的1.5ml离心管中；加入1ml试剂B，混匀，冰上静置15分钟；加入200μl氯仿，振摇15秒，静置10分钟；在4℃以12000g离心15分钟；将水相(上层)转至一个新的1.5ml离心管中。

加入500μl异丙醇后-20℃沉淀30分钟。12000g离心10分钟；用75％乙醇淋洗RNA沉淀然后离心5分钟，晾干；用10μl无RNA酶的水溶解，得到日本沼虾呼肠孤病毒RNA溶液。

③日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录

取2μl病毒RNA溶液95℃变性3分钟；加入含试剂C的反应管，在PCR仪或者恒温水浴锅中进行以下反应：

42℃    60分钟；

80℃    5分钟；

0℃     5分钟。

④PCR反应

在以上反应管中取4μl加入试剂D，混匀后在PCR仪中进行以下反应：

94℃    4分钟

55℃    45秒；循环30次

72℃    2分钟；

72℃    7分钟；

15℃    停止。

反应结束后取10μl加2μl 6×DNA加样缓冲液(含溴酚蓝)混匀后在1％琼脂糖凝胶进行电泳，确定扩增产物。如出现约325bp的反应产物，说明待检样品携带日本沼虾呼肠孤病毒。

三、试验结果

已经用本发明对日本沼虾是否被病毒感染进行检测，得出有效、可靠的检测结果。

如图1，PCR产物电泳结果是：

右 200bp ladder DNA分子量Marker；

中 阴性对照；

左 PCR产物。

序列表

<110>中国科学院武汉病毒研究所

<120>日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒

<140>

<141>

<160>1

<210>1

<211>111

<212>DNA

<213>日本沼虾呼肠孤病毒(MnRV，Macrobrachium nipponensede Reovirus)

<400>

CAAACGAATT AAATGATGAT GAATACGACG CTGTAATCAA ATATCTGTTT  50

CCAGATGAAG AGCCAAATCC TGATGTGCTT AACGAAATGG AAGTTATTAA  100

CATATGGTCG CTAACTCACA AAATGATGAA GGAACAGATT GAACGTCCAA  150

CTGCTCTGAA TTCATGGAAA TTGTACGTGA TTTGGGTTAT CGCAATGAAA  200

TACTTCCAAT ATGACTTGAA AGGAGAAGGA ACAGCTTATT ACCAGTCCAG  250

ATTATTAGCC AGTAATTGCT GTATTTTAAC AGCTCTAGCT GATAAATTTC  300

ATCCATCACA ACCTACACCT TACGA                             325

Claims (3)

1.一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：

试剂A：组织匀浆缓冲液，为Tris-NaCl-EDTA缓冲液；

试剂B：RNA提取液，为Trizol液；

试剂C：日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录反应液，其中含有特定引物MnRV-325R，其序列为：5′-TCGTAAGGTGTAGGTTGTGAT-3′；

试剂D：PCR反应液，其中含有特定引物MnRV 325R及MnRV 325F，其序列为：

MnRV-325R 5′-TCGTAAGGTGTAGGTTGTGAT-3′；

MnRV-325F 5′-CAAACGAATTAAATGATGATG-3′；

试剂E液：阳性对照，为日本沼虾呼肠孤病毒阳性DNA模板。

2.根据权利要求1所述的一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂C，每管组成为：

4μl 5×RNA反转录缓冲液，

2μl 10mM MgCl₂，

8μl RNase Free H₂O，

1μl 10mM dNTP Mixture，

1μl 1u RNsin，

1μl 1u M-MLV ReverseTranscriptase，

1μl 10pM MnRV-325R。

3.根据权利要求1所述的一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂D：PCR反应液，每管组成为：

2mM MgCl₂，

5μl 10×PCR缓冲液，

41μl ddH₂O，

2U Taq酶，

10pM MnRV-325R及MnRV-325F。

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