CN101509044A - 日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒 - Google Patents

日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN101509044A
CN101509044A CNA2009100614341A CN200910061434A CN101509044A CN 101509044 A CN101509044 A CN 101509044A CN A2009100614341 A CNA2009100614341 A CN A2009100614341A CN 200910061434 A CN200910061434 A CN 200910061434A CN 101509044 A CN101509044 A CN 101509044A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reagent
mnrv
reovirus
macrobrachium nipponensis
pondcrayfish
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2009100614341A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101509044B (zh
Inventor
张叔勇
周丽荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Institute of Virology of CAS
Original Assignee
Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Institute of Virology of CAS filed Critical Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority to CN2009100614341A priority Critical patent/CN101509044B/zh
Publication of CN101509044A publication Critical patent/CN101509044A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101509044B publication Critical patent/CN101509044B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，涉及一种病毒基因诊断试剂盒。本试剂盒由以下试剂组成：试剂A是组织匀浆缓冲液，为Tris－NaCl－EDTA缓冲液；试剂B是RNA提取液，为Trizol液；试剂C是日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录反应液，其中含有特定引物MnRV－325R；试剂D是PCR反应液，其中含有特定引物MnRV 325R及MnRV 325F；试剂E液是阳性对照，为MnRV阳性DNA模板。本发明能快速、灵敏、准确地检测出日本沼虾苗种、虾、成虾及亲虾是否携带日本沼虾呼肠孤病毒。

Description

日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种病毒基因诊断试剂盒，尤其涉及一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒。
背景技术
河虾(Macrobrachium nipponensede Haan)，又名青虾，学名为日本沼虾，为日本和我国所特有淡水虾类。它营养丰富，肉嫩味美，是一种深受人们喜爱的名贵水产品。在研究河虾病害的过程中，从湖北省某养殖场分离到一株呼肠孤病毒(命名为MnRV，Macrobrachium nipponensede Reovirus)。目前对病毒病尚无治疗办法。因此，建立灵敏准确的早期检测技术对于预防疾病，减少经济损失具有重要意义。目前没有关于此种病毒检测技术的专利和报道。
发明内容
本发明的目的是填补现有技术的空白，提供一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒。
本发明的目的是这样实现的：
根据日本沼虾呼肠孤病毒的基因组序列设计一对特异性引物，采用RT-PCR的方法，可以对日本沼虾是否感染呼肠孤病毒进行检测。
1、一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒(简称本试剂盒)
试剂A：组织匀浆缓冲液，为Tris-NaCl-EDTA缓冲液；
试剂B：RNA提取液，为Trizol液；
试剂C：日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录反应液，其中含有特定引物MnRV-325R，其序列为：5′-TCGTAAGGTGTAGGTTGTGAT-3′；
试剂D：PCR反应液，其中含有特定引物MnRV 325R及MnRV 325F，其序列为：
MnRV-325R 5′-TCGTAAGGTGTAGGTTGTGAT-3′；
MnRV-325F 5′-CAAACGAATTAAATGATGATG-3′；
试剂E液：阳性对照，为MnRV阳性DNA模板。
2、本试剂盒的获得方法
本试剂盒的所有试剂均购自商业化公司。
3、本试剂盒的用途
本试剂盒的用途就在于能检测出日本沼虾苗种、虾、成虾及亲虾是否携带日本沼虾呼肠孤病毒。
本发明具有下列优点和积极效果：
1、本发明能快速、灵敏、准确地检测出日本沼虾苗种、虾、成虾及亲虾是否携带日本沼虾呼肠孤病毒；
2、本发明适用于检测日本沼虾呼肠孤病毒。
附图说明
图1是PGR产物电泳结果图。
具体实施方式
一、本试剂盒的几种试剂的组成
1、试剂A液、试剂B液为常用试剂。
2、试剂C液
试剂C液是含有日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录反应液，每管组成为：
4μl 5×RNA反转录缓冲液，
2μl 10mM MgCl2，
8μl RNase Free H2O，
1μl 10mM dNTP Mixture，
1μl 1u RNsin，
1μl 1u M-MLV ReverseTranscriptase，
1μl 10pM MnRV-325R。
3、试剂D液
试剂D液是PCR反应液，每管组成为：
2mM MgCl2，
5μl 10×PCR缓冲液，
41μl ddH2O，
2U Taq酶，
10pM MnRV-325R及MnRV-325F。
二、本试剂盒的使用方法如下：
①日本沼虾组织的匀浆
待检日本沼虾组织100-200mg加入100μl试剂A在冰上混匀，捣碎匀浆；冰上静置15分钟。
②日本沼虾呼肠孤病毒RNA的提取
在4℃以12000g离心5分钟；将水相(上层)转至一个新的1.5ml离心管中；加入1ml试剂B，混匀，冰上静置15分钟；加入200μl氯仿，振摇15秒，静置10分钟；在4℃以12000g离心15分钟；将水相(上层)转至一个新的1.5ml离心管中。
加入500μl异丙醇后-20℃沉淀30分钟。12000g离心10分钟；用75％乙醇淋洗RNA沉淀然后离心5分钟，晾干；用10μl无RNA酶的水溶解，得到日本沼虾呼肠孤病毒RNA溶液。
③日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录
取2μl病毒RNA溶液95℃变性3分钟；加入含试剂C的反应管，在PCR仪或者恒温水浴锅中进行以下反应：
42℃  60分钟；
80℃  5分钟；
0℃   5分钟。
④PCR反应
在以上反应管中取4μl加入试剂D，混匀后在PCR仪中进行以下反应：
94℃    4分钟
Figure A200910061434D00051
55℃  45秒；循环30次
72℃  2分钟；
72℃  7分钟；
15℃  停止。
反应结束后取10μl加2μl 6×DNA加样缓冲液(含溴酚蓝)混匀后在1％琼脂糖凝胶进行电泳，确定扩增产物。如出现约325bp的反应产物，说明待检样品携带日本沼虾呼肠孤病毒。
三、试验结果
已经用本发明对日本沼虾是否被病毒感染进行检测，得出有效、可靠的检测结果。
如图1，PCR产物电泳结果是：
右200bp ladder DNA分子量Marker；
中阴性对照；
左PCR产物。
序列表
<110>中国科学院武汉病毒研究所
<120>日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒
<140>
<141>
<160>1
<210>1
<211>111
<212>DNA
<213>日本沼虾呼肠孤病毒(MnRV，Macrobrachiumni pponensede Reovirus)
<400>
Figure A200910061434D00071

Claims (3)

1、一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：
试剂A：组织匀浆缓冲液，为Tris-NaCl-EDTA缓冲液；
试剂B：RNA提取液，为Trizol液；
试剂C：日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录反应液，其中含有特定引物MnRV-325R，其序列为：5′-TCGTAAGGTGTAGGTTGTGAT-3′；
试剂D：PCR反应液，其中含有特定引物MnRV 325R及MnRV 325F，其序列为：
MnRV-325R 5′-TCGTAAGGTGTAGGTTGTGAT-3′；
MnRV-325F 5′-CAAACGAATTAAATGATGATG-3′；
试剂E液：阳性对照，为MnRV阳性DNA模板。
2、根据权利要求1所述的一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂C：其中含有日本沼虾呼肠孤病毒RNA反转录反应液，每管组成为：
4μl 5×RNA反转录缓冲液，
2μl 10mM MgCl2，
8μl RNase Free H2O，
1μl 10mM dNTP Mixture，
1μl 1u RNsin，
1μl 1u M-MLV ReverseTranscriptase，
1μl 10pM MnRV-325R。
3、根据权利要求1所述的一种日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂D：PCR反应液，每管组成为：
2mM MgCl2，
5μl 10×PCR缓冲液，
41μl ddH20，
2U Taq酶，
10pM MnRV-325R及MnRV-325F。
CN2009100614341A 2009-04-07 2009-04-07 日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒 Expired - Fee Related CN101509044B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009100614341A CN101509044B (zh) 2009-04-07 2009-04-07 日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009100614341A CN101509044B (zh) 2009-04-07 2009-04-07 日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101509044A true CN101509044A (zh) 2009-08-19
CN101509044B CN101509044B (zh) 2011-07-20

Family

ID=41001576

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009100614341A Expired - Fee Related CN101509044B (zh) 2009-04-07 2009-04-07 日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101509044B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846441A (zh) * 2019-12-20 2020-02-28 浙江省淡水水产研究所 检测沼虾黄病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1186460C (zh) * 2003-05-06 2005-01-26 中山大学 蛙病毒基因诊断试剂盒及检测方法
CN1180092C (zh) * 2003-05-06 2004-12-15 中山大学 石斑鱼病毒性神经坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846441A (zh) * 2019-12-20 2020-02-28 浙江省淡水水产研究所 检测沼虾黄病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒
CN110846441B (zh) * 2019-12-20 2023-04-11 浙江省淡水水产研究所 检测沼虾黄病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN101509044B (zh) 2011-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106636471B (zh) 同时检测对虾wssv、ahpnd、ehp、ihhnv的多重pcr检测试剂盒
CN107385111A (zh) 一种鹅星状病毒的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒
CN104032038B (zh) 鳜鱼弹状病毒的检测试剂盒及检测方法
CN109554507B (zh) 一种h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒的检测方法
CN103981289B (zh) 同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片
CN105886667A (zh) 猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN102876810A (zh) 一种鲤春病毒血症病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN103882153B (zh) 一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物
CN103031386A (zh) 一种检测人杯状病毒的三重荧光定量rt-pcr试剂盒
CN101220397B (zh) 一种检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株专用试剂盒
CN102071263B (zh) 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测试剂及检测试剂盒
CN102719566A (zh) 检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒
CN102337356B (zh) 猪盖塔病病毒rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN101509044B (zh) 日本沼虾呼肠孤病毒基因诊断试剂盒
CN104946798A (zh) 烟草花叶病毒lamp检测用的引物及方法
CN104328223A (zh) 同时检测四种猪rna病毒的rt-pcr引物组及试剂盒
CN104946747A (zh) 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用
CN103215389B (zh) 猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法rt-pcr诊断试剂盒
CN104164515B (zh) 一种洪湖碘泡虫特异性pcr检测引物及其检测方法
CN104388574A (zh) 一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重pcr检测方法
CN109628643B (zh) 一种h5亚型禽流感病毒的快速检测方法
CN101538617B (zh) 中华绒螯蟹蟹瘟病毒基因诊断试剂盒
CN106834538A (zh) 一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法rt‑pcr诊断试剂盒
CN102071264A (zh) 禽流感病毒通用型套式荧光rt-pcr检测方法及检测试剂盒
CN103602760A (zh) 病毒样颗粒内标实时荧光rt-pcr检测新城疫病毒的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20110720

Termination date: 20120407