CN106834538A - 一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法rt‑pcr诊断试剂盒 - Google Patents

一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法rt‑pcr诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT‑PCR诊断试剂盒，包括20μL RT‑PCR一步法酶、250μL酶缓冲液、300μL RNase Free dH2O、40μL混合引物、20μL阳性对照、20μL阴性对照、80μL DL2000及25μL 6×Loading Buffer；该试剂盒，与现有技术相比，具有操作简单，反转录与PCR扩增一步完成，减少了反应时间，避免了模板RNA的降解，提高了检测的敏感性等优点。该引物对猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒和猪捷申病毒的扩增结果均为阴性，该方法最低能检出1pg的猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和1pg的流行毒株模板，本试剂盒能广泛应用于基层检测机构，对猪场流行性腹泻病毒病的早期鉴别诊断、防控及净化有重要意义。

Description

一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步 法RT-PCR诊断试剂盒
技术领域
本发明专利涉及兽医生物学技术领域的诊断技术，具体是一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒。
背景技术
腹泻是当前威胁养猪业的一类重要疾病，导致猪腹泻的原因很多，包括营养性、细菌性、病毒性和寄生虫等因素。其中，病毒性因素是非常重要的一种因素，近年来，引起猪腹泻最主要病毒为猪流行性腹泻病毒(PEDV)，它能引起猪的猪流行性腹泻(PED)，PED是猪的一种高度接触性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为主要特征，发生与流行呈现逐年上升的趋势，多发生于冬季12月至次年2月寒冬季节，也可发生于其它季节，各日龄猪均可感染发病，哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪的感染发病率可达100％，尤其哺乳仔猪受害最严重，母猪发病率为15-90%，给我国养猪业造成严重的经济损失。1978年，比利时和英国首次报道了猪流行性腹泻，此后在世界多国均见有PEDV感染的报道。1976年，中国首次出现PEDV感染的报道，自1980年后期呈现大面积流行。
目前尚无有效的药物治疗猪流行性腹泻，该病一旦爆发，给猪场造成毁灭性的打击，采用疫苗进行预防是控制该病的最有效的手段，弱毒活疫苗与灭活疫苗相比具有免疫作用时间长，免疫效果牢固，可形成局部和全身免疫等优点，
ORF3基因是PEDV的一个附属基因，编码码一种离子通道蛋白，与病毒的毒力有关，是造成强弱毒差异的主要基因，是弱毒株重要的分子标记。
目前国内外商品化的PEDV弱毒疫苗株均为ORF3基因缺失毒株，如我国的CV777株，日本的P-5V株和韩国的KPED-9和DR13株等，这些毒株的ORF3基因在245-294bp均存在核苷酸缺失，而缺失区域周围的序列却相对保守，不同毒株的 ORF3 基因相似性达到97.8%，在临床上如何区分疫苗免疫与流行毒株，对仔猪腹泻疫情的预警及猪场流行性腹病毒的净化具有重要意义。
目前，在国内有学者尝试建立相关的鉴别诊断方法，如修金生等建立了鉴别猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒的荧光定量 RT-PCR 检测方法，对操作人员要求高，且成本较高，目前只应用于实验室检测，不适合基层兽医部门应用。李长龙、朱海侠等建立了鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与野毒株的 RT-PCR 检测方法，均为两步法RT-PCR检测方法，且没检测的敏感性进行研究，操作烦琐，扩增反应时间长，模板RNA的易降解。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的是目的在于提供一种用于鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，该试剂盒操作简便、灵敏度高、特异性好可快速、准确地区分猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和流行毒株，对猪场流行性腹泻病毒病的早期鉴别诊断、防控及净化有重要意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，该试剂盒包括20μL RT-PCR一步法酶、250μL 酶缓冲液、300μL RNaseFreedH2O、40μL 混合引物、20μL阳性对照、20μL阴性对照、80μLDL2000及25μL6×LoadingBuff，
所述的引物 P1 序列为 ：5'-AGTCTGCCAACTTGTCTT-3'
所述的引物 P2 序列为 ：5'-AGTAAAAGCAGACTAAACAAAGCCT-3'
所述的阴性对照为灭菌的DEPC水。
所述的阳性对照为猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和流行毒株RNA。
所述混合引物中各条引物的浓度均为15μmo1/L。
所述的RT-PCR一步法酶由PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNaseInhibitor组成，所述PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor的体积比为1:1:1。
所述的酶缓冲液由dNTP Mixture和One Step Enhancer Solution组成，所述dNTPMixture的浓度为400μmo1/L。
所述RT-PCR反应体系为：反应在25 μL体系中进行，P1、P2引物各1μL，PrimeScript1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、两种病毒RNA混合物各0.5μL，，加RNase Freed H2O至25μL。
所述RT-PCR扩增反应条件为：50℃ 20 min；95℃ 3 min；94℃ 20s；退火温度 52℃ 20s；72℃ 20s；40个循环；最后72℃延伸10 min。
本发明的有益效果是：本发明根据GenBank中的猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和流行毒株的ORF3基因序列设计特异性引物P1/P2，提取病毒RNA，利用一步法RT-PCR方法检测猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株，扩增疫苗弱毒株预计扩增片段大小为233bp，扩增流行毒株预计扩增片断为282bp；本发明反转录步骤PCR 扩增同时进行，具有操作简单，减少的繁琐的反转录加样的过程，不需要单独做反转录，反转录与PCR扩增一步完成，减少了反应时间，检测总时间控制在3小时左右，达到了快速检测的目的，避免了模板RNA的降解，且目的片段较小，进一步提高了检测的敏感性，更加方便、实用，适合基层兽医工作者使用，本发明能彻底解决猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和流行毒株鉴别诊断问题，快速、灵敏，特异性好，非常适合猪流行性腹泻疫情的大面积快速检测普查，适用于基层兽医检测实验室及条件具备的大中型养殖场。
附图说明
图1为本发明试剂盒一步法RT-PCR扩增电泳图；
图1中：M：DL2000 MarKer，1：疫苗毒PEDV +流行毒PEDV扩增结果，2：疫苗毒PEDV 扩增结果，3：流行毒PEDV扩增结果，4：空白对照；
图2为本发明试剂盒的敏感性试验电泳图；
图2中：M：DL2000 MarKer，1：1mg疫苗毒PEDV +1mg流行毒PEDV ，2：100ng 疫苗毒PEDV+100ng流行毒PEDV，3：10ng 疫苗毒PEDV +10ng流行毒PEDV，4：1ng 疫苗毒PEDV +1ng流行毒PEDV，5：100pg 疫苗毒PEDV +100pg流行毒PEDV，6：10pg 疫苗毒PEDV +10pg流行毒PEDV，7：1pg 疫苗毒PEDV +1pg流行毒PEDV，8：0.1pg 疫苗毒PEDV +0.1pg流行毒PEDV；
图3为本发明试剂盒特异性试验电泳图；
图3中：M：DL2000 MarKer，1：疫苗毒PEDV +流行毒PEDV扩增结果，2：疫苗毒PEDV 扩增结果，3：流行毒PEDV扩增结果，4：猪传染性胃肠炎病毒扩增结果，5：猪A群轮状病毒扩增结果，6：猪瘟病毒扩增结果，7：猪繁殖与呼吸综合症病毒扩增结果，8：猪捷申病毒扩增结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，一边本领域技术人员可以更好的了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，其包括20μLRT-PCR一步法酶、250μL酶缓冲液、300μL RNase Freed H2O、40μL混合引物、20μL阳性对照、20μL阴性对照、80μL DL2000 25μL 6×Loading Buff，混合引物包括上游引物P1：5'-AGTCTGCCAACTTGTCTT-3'，下游引物P2：5'-AGTAAAAGCAGACTAAACAAAGCCT-3'。阴性对照为灭菌的DEPC水，阳性对照为猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株RNA。所述的酶缓冲液由dNTP Mixture和One Step EnhancerSolution组成，所述dNTP Mixture的浓度为400μmo1/L，所述的RT-PCR一步法酶由体积比为1：1：1的PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor组成。一步法RT-PCR反应在25 μL体系中进行，P1、P2引物各1μL (15μmol/L)，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、2种RNA混合物1μL，加RNase FreedH20至25μL，扩增反应测程序为：50℃ 20 min；95℃ 3 min；94℃ 20s，退火温度 52℃ 20s；72℃ 1 min，40个循环；最后72℃延伸10 min。用于检测样品时扩增猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株预计扩增片段大小为233bp，扩增猪流行性腹泻流行毒株预计扩增片断为282bp。
实施例2
将采集的粪便样品、肠道内容物用PBS（0.01 mol/L， pH7.2）制成10%的悬液，涡旋震荡后，4℃条件下12 000 r/min离心10分钟，取上清，用于病毒核酸的提取。病毒RNA的提取参照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒（康宁生命科学（吴江）有限公司）说明书进行，将提取的RNA于-70℃保存。
单一病毒一步法RT-PCR扩增及条件优化。
RT-PCR反应在25 μL体系中进行，P1、P2引物各1μL (10μmol/L)，PrimeScript 1step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、模板1μL（猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株或流行毒株的RNA），加RNase Free dH2O至25μL，反应程序为：50℃ 20 min；95℃ 3 min；94℃ 20s；退火温度 50℃ 20s；72℃ 20s；40个循环；最后72℃延伸10 min。取5μLPCR扩增产物于15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
两种病毒一步法RT-PCR扩增及条件优化
RT-PCR反应在25 μL体系中进行，P1、P2引物各1μL (15μmol/L)，PrimeScript 1 stepEnzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、2种RNA混合物1μL，加RNase Free dH2O至25μL，优化一步法RT-PCR反应条件，包括退火温度(46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃)，引物浓度(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L)，进行优化，以确定最佳反应条件，同时以RNase Free dH2O作为空白对照。两种病毒一步法RT-PCR反应在25μL反应体系中进行。确定的最佳引物浓度为15μmol/L，反应程序为：50℃ 20 min；95℃ 3 min；94℃ 20s；退火温度 52℃ 20s；72℃ 1 min；40个循环；最后72℃延伸10 min。取5μLPCR扩增产物于15g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
结果判定
阴性对照不出条带，阳性对照出 223bp、282bp 两个条带，说明对照成立，样品中出现223bp一个条带，即为猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株，样品中出现282bp一个条带，即为猪流行性腹泻病毒流行毒株，样品出223bp、282bp两个条带，即为猪流行性腹泻病毒流行毒株，见图1。
试剂盒的验证性试验
①敏感性试验
分别提取猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和流行毒株的RNA，定量后，分别作10倍梯度稀释提取的病毒基因组RNA，每个稀释度取l µL为模板，采用一步法RT-PCR扩增，反应结束后进行凝胶电泳检测，结果显示，该试剂盒最低能检出1pg的猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和1pg的流行毒株RNA量，见图2。
②特异性试验
分别提取猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒和猪捷申病毒的核酸，分别进行一步法RT-PCR反应，均未扩增出条带，而猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和流行毒株RNA混合物和单一RNA均扩增出各病毒的特异性条带，见图3。
③重复性试验
应用建立一步法RT-PCR方法，重复检测猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和流行毒株单一病毒RNA或混合RNA样品3次，经过3次重复操作，结果一致。
④稳定性试验
本发明提供的诊断试剂盒保存条件为-20℃，每月 1 次用对照样品进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定性。结果显示，6个月内试剂盒检测结果完全一致，说明试剂盒有良好的稳定性。
⑤一步法RT-PCR试剂盒对临床样品的检测
应用研制的一步法RT-PCR试剂盒对2015年山东、安徽、河南和江苏等省等几个规模化养猪场和养猪专业户采集的32份疑似病料进行一步法RT-PCR检测，结果32份样品中有21份能检测到PEDV，其中猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株疫苗毒感染2份猪流行性腹泻病毒流行毒株感染18份，疫苗毒与野毒共感染的为1份。

Claims (8)

1.一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：其包括20μL RT-PCR一步法酶、250μL酶缓冲液、300μL Rnase Freed H2O、40μL混合引物、20μL 阳性对照、20μL阴性对照、80μL DL2000及25μL 6×Loading Buffer，所述混合引物包括上游引物P1：5'-AGTCTGCCAACTTGTCTT-3'，下游引物P2：5'-AGTAAAAGCAGACTAAACAAAGCCT-3'。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为灭菌的DEPC水。
3.根据权利要求1所述的一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和流行毒株RNA。
4.根据权利要求1所述的一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：所述混合引物中各条引物的浓度均为15μmo1/L。
5.根据权利要求1所述的一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR一步法酶由PrimeScript Rtase、DNAPolymerase和RNase Inhibitor组成，所述PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNaseInhibitor的体积比为1:1:1。
6.根据权利要求1所述的一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：所述的酶缓冲液由dNTP Mixture和One Step EnhancerSolution组成，所述dNTP Mixture的浓度为400μmo1/L。
7.根据权利要求1所述的一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR反应体系为：反应在25 μL体系中进行，P1、P2引物各1μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、两种病毒RNA混合物各0.5μL，加RNase Freed H2O至25μL。
8.根据权利要求7所述的一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR扩增反应条件为：50℃ 20 min；95℃ 3min；94℃ 20s；退火温度 52℃ 20s；72℃ 20s；40个循环；最后72℃延伸10 min。
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