CN1560274A - 海洋水产动物及人类病原菌－副溶血弧菌基因诊断试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种海洋水产动物(如中华鳖、罗非鱼，鳗鲡和三角帆蚌等)及人类病原菌—副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以副溶血弧菌基因保守区序列设计的一对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对水产动物(如中华鳖、罗非鱼，鳗鲡和三角帆蚌等)及人类的病原菌—副溶血弧菌的特异性DNA片断进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于水产动物各时期养殖过程中的细菌跟踪检测，也可用于人类肠道急性传染病的临床检测，还可以用于环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及海洋水生经济动物和人类病原菌的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)基因诊断的试剂盒及检测方法。
背景技术
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种广布于世界各地的海湾和海岸线区域以及海产品中的嗜盐菌。此菌是一种条件致病菌，在一定条件下可暴发流行。近年来，随着养殖环境的日益恶化，我国沿海地区因副溶血性弧菌引起海产品发病或大面积死亡以及人类食物中毒的报道日益增多。目前已知副溶血弧菌可引起中国对虾红腿病，大黄鱼、石斑鱼败血症，牡蛎、杂色鲍肌肉萎缩症而且还能感染养殖蟹类，导致养殖蟹类的大量死亡；同时可通过受污染的海产品感染人类，引发人类肠道急性传染病。因此，可以说副溶血弧菌是海洋水生经济动物弧菌病主要病原菌，也是人类食品安全的敌人。副溶血弧菌病具有暴发快、流行广、死亡率高等特点，由于细菌极易对抗生素产生抗药性，因此目前对副溶血弧菌病还未有特效的治疗方法，推行海洋水产品的健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对弧菌的检测技术主要包括传统的TCBS培养及进一步的形态及生理生化鉴定法、免疫学方法(主要有单克隆抗体技术、酶联免疫检测法(ELISA))、免疫电镜技术、分子生物学方法(主要有分子杂交技术、限制性内切酶长度多态(RELP))等。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长。有些所需的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大水产养殖业主和医生掌握的技术难度很大，很难推广，限制了这些技术的应用和发展。
早期快速诊断海洋水产动物和人类病原菌—副溶血弧菌是目前海洋经济动物养殖的主要措施和减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大水产养殖者急切盼望的。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是上世纪80年代发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快就被应用于实践中。
发明内容
本发明的目的是利用副溶血弧菌基因保守序列设计的一对引物，建立副溶血弧菌PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供海洋水产动物和人类病原菌副溶血弧菌的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于海洋水产动物各时期养殖过程细菌中的细菌跟踪检测，也可用于人类肠道急性传染病的临床检测，还可以用于环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。
本发明的海洋水产动物和人类病原菌—副溶血弧菌的基因诊断试剂盒包括下列部件：
1).样品稀释液A液，1管，内装1×PBS，pH7.4；
2).PCR.反应液B液，1管，内装PCR扩增反应液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物VpF、引物VpR和TaqE；
3).阳性对照液C液，1管，内装副溶血弧菌的总DNA，作为阳性模板；
4).盒子；
5).一块泡沫板，其大小与盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
上述海洋水产动物和人类病原菌—副溶血弧菌的基因诊断试剂盒中所述的一对引物VpF和VpR是根据副溶血弧菌基因保守区序列设计的，其DNA序列分别如下：
VpF：5’-TGG GGT GAA GTC GTA ACA AGG
VpR：5’-TCA CCA AAG TTG TCT GC
用本发明上述试剂盒检测海洋水产动物和人类病原菌—副溶血弧菌的方法，按下列步骤进行：
1).取新鲜待检样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于无菌匀浆器中冰浴匀浆；待检样品可以是直接取自待检动物的任何部位组织，最好是消化道或肌肉组织；对于人，可取粪便或伤口脓液作为待检样品。
2).6000～8000r/min离心5～10min；
3).取上清200μl，煮沸15min，立刻放于冰上5～10min；
4).6000～8000r/min离心10min，上清作PCR模板；
5).分别取模板和C液，加入到PCR反应液B液中，混匀后离心数秒(通常为500～1000r/min离心5～10sec)，置于PCR仪上；
6).按下列条件扩增：
95℃3min预变性→94℃1min 34个循环→72℃10min→4℃保存
62℃45sec
72℃1min
7).反应结束后取5～10μl加2μl溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察，若在551bp和306bp处各出现明亮的反应条带，则为副溶血弧菌阳性；
若无反应条带显示，则为阴性。
本发明的有益效果：
本发明的海洋水产动物和人类病原菌—副溶血弧菌的基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据副溶血弧菌基因保守区序列设计的一对引物为主体而设计的。利用该对引物，可以特异性地扩增携带副溶血弧菌的待测样品的有关基因片断，所建立的优化的PCR体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此，使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异的地检测感染副溶血弧菌的海洋水产动物及人类肠道内容物，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于海洋水产动物各时期养殖过程细菌中的细菌跟踪检测，也可用于人类肠道急性传染病的临床检测，还可以用于环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。
附图说明
图1是感染副溶血弧菌的杂色鲍肝脏组织样品的PCR扩增结果。其中M：DNA分子量标准；1：副溶血弧菌阳性对照；2：副溶血弧菌阴性对照；3：检测样品；
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：副溶血弧菌的基因诊断试剂盒
该试剂盒由下列部分构成(10样份)：
1).样品稀释液(A液)，1管，5ml/管，内装1×PBS，pH7.4。
2).PCR.反应液(B液)，1管，250μl/管，内装PCR扩增反应液(25μl体系)，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物VpF、VpR和TaqE。
3).阳性对照液(C液)，1管，20μl/管，内装副溶血弧菌总DNA，作为阳性模板；
4).长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm3。
5).一块泡沫板，其大小与盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
该试剂盒中的一对引物的DNA序列如下：
VpF：5’-TGG GGT GAA GTC GTA ACA AGG
VpR：5’-TCA CCA AAG TTG TCT GC
PCR扩增反应液体系(25μl体系)如下：
ddH2O 21μl
10×Buffer 1.8μl
dNTP 0.4μl
引物VpF 0.3μl
引物VpR 0.3μl
TaqE 0.2μl
实施例2：海洋水产动物和人类病原菌—副溶血弧菌的检测方法
使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行：
1).用无菌操作方法，取新鲜杂色鲍肝脏组织0.05g，加入样品稀释液(A液)500μl稀释10倍，于无菌匀浆器中冰浴匀浆；
2).6000r/min离心5min
3).取上清100μl，煮沸15min，立刻放于冰上5min；
4).6000r/min离心10min，上清作为PCR模板；
5).分别取模板和C液1μl，加入到PCR反应液(B液)中，混匀后，1000r/min离心10sec，置于PCR仪上；
6).按下列条件扩增：
95℃3min预变性→94℃1min 34个循环→72℃10min→4℃保存
62℃45sec
72℃1min
7).反应结束后取5～10μl加2μl溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察，若在551bp和306bp处各出现一明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为副溶血弧菌阳性，说明检测样品中携带副溶血弧菌；若无反应条带显示，则为阴性，表明检测样品中不含副溶血弧菌(见图1)。
Claims (2)
1.海洋水产动物及人类病原菌-副溶血弧菌的基因诊断试剂盒，其特征是该试剂盒包括下列部件：
1).样品稀释液A液，1管，内装1×PBS，pH7.4；
2).PCR反应液B液，1管，内装PCR扩增反应液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物VpF、引物VpR和TaqE；VpF为：5’-TGG GGT GAA GTC GTA ACA AGG-3’，VpR为：5’-TCA CCA AAG TTG TCT GC-3’；
3).阳性对照液C液，1管，内装副溶血弧菌的总DNA；
4).盒子；
5).一块泡沫板，其大小与盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
2.一种检测海洋水产动物及人类病原菌-副溶血弧菌的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行：
1).取新鲜待检样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于无菌匀浆器中冰浴匀浆；
2).6000～8000r/min离心5～10min；
3).取上清200μl，煮沸15min，立刻放于冰上5～10min；
4).6000～8000r/min离心10min，上清作PCR模板；
5).分别取模板和C液，加入到PCR反应液B液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；
6).按下列条件扩增：
95℃ 3min预变性→94℃ 1min 34个循环→72℃ 10min→4℃保存
62℃ 45sec
72℃ 1min
7).反应结束后取5～10μl加2μl溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察，若在551bp和306bp处各出现明亮的反应条带，则为副溶血弧菌阳性；
若无反应条带显示则为阴性。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |