CN1831143A - 一种用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列 - Google Patents

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Abstract

一种用于霍乱弧菌核苷酸片段的PCR扩增引物和探针序列。引物序列包括：由上游引物F1253序列为GCTTTATTGTTCGATGCGTTAAAC和下游引物R1089序列为GATGCCAAAATTGTGCGTATCA组成的引物对，以及该引物对的上游引物F1253位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物R1089位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括：由探针Pb1218序列为TCTTGGGCAATCGCATCGGTTGA向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。

Description

一种用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列
技术领域
本发明涉及一种用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列。
背景技术
霍乱弧菌是食品中常见的致病菌，是导致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌。霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性传染病，其发病急，传播快，波及面广，危害严重。它被世界卫生组织确定为必须国际检疫的传染病之一，我国传染病防治法中心将其列为应实施“强制管理”的甲类传染病，也是当前三种国际检疫传染病中最严重的一种。霍乱是经口感染的肠道传染病，常经水、食物、生活接触和苍蝇等而传播。经水传播是最主要的传播途径，历次较广泛的流行或暴发多与水体被污染有关。经水传播的特点是常呈现暴发，病人多沿被污染的水体分布。重症霍乱病人的主要临床表现为剧烈腹泻、呕吐、脱水、循环衰竭及代谢性酸中毒等。如抢救不及时或不得当，可于发病后数小时至十多个小时内死亡。在自然情况下，人类是霍乱弧菌的唯一易感者。在地方性流行区，除病人外，无症状感染者也是重要传染源。传播途径主要是通过污染的水源或食物经口摄入，人与人之间的直接传播不常见。国家质量监督检验检疫总局的2002年第25和26号令中明确规定霍乱弧菌为必检项目。目前对该菌的检测，国标和行标多采用传统的平板培养或酶联反应(ELISA)的方法，这些方法步骤烦琐，费时费力，一般至少要耗时4-6天，且由于多种干扰因素的影响，检测结果的准确性容易降低，给食品的进出口带来了非常不利的影响。因此，建立一种更加快速、准确、操作简便的致病菌检测方法势在必行。
目前国内外应用于食源性病原菌检测的分子生物学技术，主要分为三类：普通PCR技术、荧光PCR技术和基因芯片技术。基因芯片方法检测效率高，但技术还不成熟，假阳性率和假阴性率都很难控制，而且成本较高，目前还处于研究阶段。普通PCR方法技术成熟，也最早用于食源性病原菌的检测，但需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染，而且也有一定的非特异性扩增。荧光PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：
(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度。(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性。(3)数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠。(4)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰。(5)不接触有毒试剂，操作安全。(6)有利于规模化、自动化及联网管理。(7)适用范围更广，理论上可检测任何细菌的核酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列包括：
由上游引物F1253序列为GCTTTATTGTTCGATGCGTTAAAC和下游引物R1089序列为GATGCCAAAATTGTGCGTATCA组成的引物对，以及该引物对的上游引物F1253位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物R1089位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括：由探针Pb1218序列为TCTTGGGCAATCGCATCGGTTGA向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。
本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。
附图说明
图1利用引物对F1253/R1089和探针Pb1218检测霍乱弧菌阳性样品的荧光PCR扩增图。
具体实施方式
1.引物和探针设计：通过分别对所有已知的霍乱弧菌基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(霍乱弧菌hlyA基因，其序列见附录)，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：
上游引物F1253：GCTTTATTGTTCGATGCGTTAAAC
下游引物R1089：GATGCCAAAATTGTGCGTATCA。
探针Pb1218：TCTTGGGCAATCGCATCGGTTGA
2.反应体系的建立和优化：反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：取霍乱弧菌标准菌株复苏后培养48小时，取培养液1ml进行10倍梯度稀释，选取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6个稀释度作为系列阳性模板，分别提取基因组核酸，再分别用上述检测序列区域中的最长的扩增片段的引物和探针进行PCR扩增，并取其中Ct值24-27之间者作为以后反应体系优化时的模板。
2.1  引物浓度的优化  在反应体系中，将霍乱弧菌的引物浓度分别从0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.2μmol/L。
2.2  镁离子浓度的优化  在反应体系中其它条件不变的前提下，将MgCl2的浓度从1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复实验选定2.5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。
2.3  Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化  通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。
2.4  dNTPs浓度的优化  通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选0.2mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。
2.5  探针浓度的优化  在反应体系中，将霍乱弧菌的探针浓度分别从0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.1μmol/L。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR反应体系为40μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。
表1  优化后的PCR反应体系
  组分   终浓度
  10×PCR反应缓冲液   1×
  Mg2+浓度   2.5mmol/L
  dNTPs(含dUTP)   0.2mmol/L
  Taq酶   2U
  引物(上游)   0.2μmol/L
  引物(下游)   0.2μmol/L
  探针   0.1μmol/L
  模板   2μl
  补水至   40μl
注：a.在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。
    b.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。
3.仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
4.PCR条件选择如下：
95℃2min，1个循环；
95℃5sec，60℃40sec，40个循环。
5.检测步骤：
(1)选取引物和探针；
(2)制备待测模板，可采用酚-氯仿法提取各种来源样品中霍乱弧菌的基因组DNA；
(3)反应体系的建立：a、确定最佳引物浓度；b、确定镁离子浓度；c、确定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；d、确定dNTPs浓度；e、确定探针浓度；
(4)选择仪器的检测通道；
(5)上机检测。
6.实施例
选取引物对F1253/R1089和探针Pb1218，将待检的霍乱弧菌培养液用酚-氯仿法抽提基因组DNA。具体步骤如下：
(1)将待检的霍乱弧菌增菌液(约1ml)加入1.5ml的离心管中，12000rpm离心5分钟，去上清。
(2)加入DNA裂解液700ul，充分混匀重悬，水浴煮沸5分钟。
(3)加入等体积的酚-氯仿(V/V＝1∶1)溶液，充分混匀后离心，13000rpm离心5分钟。
(4)将上清液移入另一个1.5ml的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，13000rpm离心5分钟。
(5)将上清液移入另一个1.5ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心5分钟。
(6)弃上清后用70％乙醇冲洗，13000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，倒置晾干。
(7)在干燥后的离心管中加入50ul DNA溶解液充分混匀，作为DNA模板待用。
在40ul荧光PCR反应体系中，加入以上提取的霍乱弧菌基因组DNA 2ul，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。经检测，若待检培养液中含有霍乱弧菌则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达到1000个拷贝/ml；若待检培养液中不含有霍乱弧菌则无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度和特异性。
7.本发明的优点：
(1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。
(2)本发明提供的引物和探针对于不含有霍乱弧菌的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。
(3)由于本发明采用霍乱弧菌的内源基因hlyA作为扩增的目的基因，避免了假阴性结果的产生。
(4)由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。
附录
霍乱弧菌hlyA基因
tatgccaaaa ctcaatcgtt gcgcaatcgc gatattcaca atattaagcg caatatccag 60
tccaaccctg ttggcaaata tcaatgaacc aagtggtgaa gcggcggata ttattagtca 120
agtcgctgat agtcatgcaa taaaatatta caatgctgct gattggcaag ccgaagacaa 180
cgcattaccg agcttagctg agctgcgcga tttggtgatt aaccagcaaa aacgcgtttt 240
ggttgatttc agtcagatca gtgatgctga aggtcaagca gagatgcaag cccaattcag 300
aaaggcttat ggggtgggtt ttgctaatca atttattgtc atcactgaac ataaagggga 360
actgctgttt acaccttttg atcaggcaga agaggttgac cctcaattac tcgaagcgcc 420
gcgtaccgct cgcttattag cgcgctctgg ttttgcaagt ccggcaccgg caaacagcga 480
aacaaatacc ttgccgcatg tggcttttta catcagtgtc aaccgtgcga tcagcgatga 540
agagtgtacc tttaacaact cttggttgtg gaaaaacgaa aagggcagtc gtccgttctg 600
taaagatgcc aatatctcat tgatttatcg agttaaccta gagcgttcat tgcaatacgg 660
cattgtgggt tccgcgacac cggatgccaa aattgtgcgt atcagcctag atgatgacag 720
cacgggagcc ggcattcatc tgaatgatca actcggttat cgtcagtttg gagccagtta 780
tacgacgtta gatgcctatt tccgtgagtg gtcaaccgat gcgattgccc aagattatcg 840
cttcgtgttt aacgcatcga acaataaagc gcagatcctg aaaacctttc ctgtcgataa 900
cattaacgag aaatttgagc gcaaagaggt ttcaggtttt gagcttgggg tgactggtgg 960
ggtggaagtc agtggagatg gcccgaaagc caaactagag gcgagagcaa gttataccca 1020
gagtcgctgg ttaacctaca acacacaaga ctatcgtatt gagcgtaatg cgaagaatgc 1080
gcaagcggtt agctttacat ggaatcgtca acaatacgcg acagcagaat cgctactcaa 1140
tcgttcgacc gatgctttgt gggtgaatac ctacccggta gatgtaaacc gtattagccc 1200
gctgagctac gcgagttttg tgccgaaaat ggatgtgatt tataaagcct cagccacaga 1260
gacaggcagt acggatttta tcatcgactc ttcggtcaat atccgcccaa tctataacgg 1320
tgcttataag cactactatg tggtcggtgc tcatcagtcc taccatggct ttgaagatac 1380
cccacgtcgt cgaatcacga aatcggcaag ctttacggtc gattgggatc acccagtatt 1440
cacgggtggc cgcccggtca acctacaact tgccagcttt aacaaccgct gtattcaagt 1500
cgatgctcaa ggtcgcttgg cggccaatac gtgcgatagc cagcaatcag cgcaatcgtt 1560
catctatgat cagcttggtc gttatgtgag tgcgagtaac accaagctct gtcttgatgg 1620
tgaggcatta gacgcattgc aaccctgtaa ccaaaacctg actcagcgtt gggagtggcg 1680
taaaggcaca gatgaattga ccaatgtcta cagcggcgag tcccttggac atgacaaaca 1740
aaccggtgag cttggtttgt atgcgagcag caacgatgcg gtaagtttac gtaccatcac 1800
cgcttatacc gatgtgttta atgcgcaaga aagttcgccg attctgggtt acacacaagg 1860
gaaaatgaat cagcagcgtg tgggacaaga tcatcgtttg tatgtgcgag cgggtgctgc 1920
cattgatgca ttagggtccg cctccgattt attggttggt ggcaatggtg gtagcttgag 1980
ttcggtggat ctgtccggcg tgaaatccat cacggcaacc tctggtgatt tccaatatgg 2040
cggtcagcag ttggtggcgc tgacattcac ctaccaagat ggacgtcagc aaacggtagg 2100
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gatcactcaa ctgaaaattt ggtctgacga ttggttggtg aaaggggttc aatttgattt 2220
gaac taaaaa 2230
                            序列表
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tcttgggcaa tcgcatcggt tga                                   23

Claims (4)

1.一种用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：由上游引物F1253序列为GCTTTATTGTTCGATGCGTTAAAC和下游引物R1089序列为GATGCCAAAATTGTGCGTATCA组成的引物对，以及该引物对的上游引物F1253位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物R1089位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：上游引物F1253序列为GCTTTATTGTTCGATGCGTTAAAC和下游引物R1089序列为GATGCCAAAATTGTGCGTATCA。
3.一种用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的探针序列，其特征在于所述的探针序列包括：由探针Pb1218序列为TCTTGGGCAATCGCATCGGTTGA向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。
4.根据权利要求3所述的用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的探针序列，其特征在于所述的探针Pb1218序列为TCTTGGGCAATCGCATCGGTTGA。
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