CN100575954C - 一种光电化学检测核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明“一种光电化学检测核酸碱基的方法”,该方法包括:(a)将待测样品与具有光电化学活性的物质进行接触;(b)评价上述样品中核酸碱基与所述光电化学物质之间的氧化还原反应,即在电极存在的情况下用光将光电化学物质转化成激发态,被激发的物质失去电子后,与核酸碱基进行氧化还原反应,评价氧化还原反应所产生的电流;(c)根据氧化还原反应所产生的电流,对样品进行定性或定量分析。该方法可以应用于生物检测的许多领域,例如:核酸杂交检测、核酸损伤检测和化学物质基因毒性的检测。
Description
技术领域
本发明涉及核酸的检测技术领域,特别是涉及用光电化学定性定量的检测核酸杂交和损伤的方法。
技术背景
现知人类的疾病都与基因有着直接或间接的关系,因此,对核酸的高灵敏、高选择性的快速检测方法存在着越来越迫切的需求,这对于基因研究、药物筛选、临床诊断以及生态毒理学研究、新化合物的毒性筛选、环境中生物污染物的监控都具有现实意义。
许多检测方法已被用来检测核酸,例如,目前核酸检测常用的DNA印迹、RNA印迹和PCR技术,这些方法操作中的一个共同点是必须把未杂交的探针和引物与杂交体分离后才能借助其他信号对靶核酸进行检测,操作繁琐复杂,费时,技术难度大,而且难以对核酸进行准确定量检测。
核酸杂交是建立最早、最基本的核酸检测技术,这一分析方法一般需要附着在靶核酸链上的标记物来检测目标核酸,这些标记物最早采用的是放射性核素,后有生物素、荧光素。放射性核素标记灵敏度高,然而比较昂贵、危险。生物素和荧光素使用安全,但灵敏度较差,尤其对核酸中碱基的损伤和单个碱基对的错配无法进行灵敏的检测,例如:美国专利5,143,854和5,405,783。
对利用核酸碱基的催化作用直接检测核酸已有描述,例如,美国专利6,361,951描述了一种用循环伏安法直接检测核酸杂交的方法,该方法用核酸的碱基催化电流信号,根据催化电流的强度来检测核酸杂交。尽管所述方法可以直接检测核酸碱基的氧化还原反应,不需要标记,但该方法的检测范围有限,而且该方法是在电极上用电压来激发信号分子的,使信号分子的选择范围受到限制。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种简便、有效、快捷的光电化学检测核酸的方法。
为达到上述目的,本发明的技术解决方案是提供一种光电化学检测核酸碱基的方法,包括:
(a)将待测样品在合适的条件下与具有光电化学活性的物质进行接触;
(b)在电极存在的情况下用光将光电化学活性物质转化成激发态,被激发的物质失去电子后,与核酸碱基进行氧化还原反应,评价氧化还原反应所产生的电流;
(c)根据氧化还原反应所产生的电流,对样品进行定性或定量分析。
所述的方法,其所述待测样品中的分析物是核苷酸、寡核苷酸或核酸。
所述的方法,其所述样品中的核酸碱基为鸟嘌呤、腺嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、8-氧化鸟嘌呤或8-氧化腺嘌呤。
所述的方法,其所述的光电化学活性物质为无机分子、有机分子、无机/有机复合分子、无机聚合物、有机聚合物、无机/有机复合聚合物、无机颗粒物、有机颗粒物或无机/有机复合颗粒物。
所述的方法,其所述光电化学活性物质,其物质为金属/有机配体络合物。
所述的方法,其所述金属/有机配体络合物,其金属为钌或锇。
所述的方法,其所述金属/有机配体络合物,其有机配体为含氮的芳香族杂环。
所述的的方法,其所述有机配体为联吡啶、连吡嗪、联三吡啶、菲酚、酞氰染料、取代的联吡啶、取代的连吡嗪、取代的联三吡啶、取代的菲酚、二吡啶并[3,2-a;2’,3’-c]吩嗪或邻二单氮杂菲。
所述的方法,其所述电极为金属氧化物电极。
所述的方法,其所述金属氧化物电极材料,为二氧化锡。
所述的方法,其所述金属氧化物电极,是由纳米颗粒二氧化锡在导电基质上制备。
所述的方法,其所述光来自以下光源:中空的阴极灯、氙弧灯、氙汞灯、金属卤化物灯、发光二级管或激光。
所述的方法,其所述(a)步中待测样品,包括核酸杂交样品或受损伤的核酸样品。
所述的方法,其所述核酸杂交样品的光电化学检测方法,包括:
(a)将核酸杂交样品在合适的条件下与具有光电化学活性的物质进行接触;
(b)在电极存在的情况下用光将光电化学物质转化成激发态,被激发的物质失去电子后,与核酸碱基进行氧化还原反应,评价杂交前后氧化还原反应所产生的电流的变化;
(c)根据杂交前后氧化还原反应所产生的电流变化,对样品进行定性或定量分析。
所述的万法,其所述受损伤的核酸样品的光电化学检测方法,包括:
(a)将受损伤的核酸样品在合适的条件下与具有光电化学活性的物质进行接触;
(b)在电极存在的情况下用光将光电化学物质转化成激发态,被激发的物质失去电子后,与核酸碱基进行氧化还原反应,评价核酸损伤前后氧化还原反应所产生的电流的变化;
(c)根据核酸损伤前后氧化还原反应所产生的电流的变化,对样品进行定性或定量分析。
所述的方法,其所述受损伤的核酸样品是化学因素引起的损伤,为烷基化试剂所引起的碱基脱落、碱基烷基化、DNA链断裂、DNA链交联,或是亚硝酸盐与碱基形成重氮盐引起的损伤,或是嵌入剂因插入DNA链而引起的损伤,或是由于碱基类似物进入细胞代替正常的碱基参入DNA链干扰DNA复制合成而引起的损伤。
所述的方法,其所述受损伤的核酸样品是物理因素引起的损伤,为紫外线、高能射线或电离辐射引起的损伤;
所述的方法,其所述DNA分子自身因素引起的损伤,或为DNA复制中的错误。
所述的方法,用于化学物质基因毒性的检测,其包括:
(a)将待测化学物质与核酸探针进行损伤反应;
(b)将上述反应产物在合适的条件下与具有光电化学活性的物质进行接触;
(c)在电极存在的情况下用光将光电化学物质转化成激发态,被激发的物质失去电子后,与核酸碱基进行氧化还原反应,评价核酸损伤前后氧化还原反应所产生的电流的变化;
(d)根据核酸损伤前后氧化还原反应所产生的电流的变化,对所述化学物质的基因毒性进行定性或定量分析。
所述的方法,其所述化学物质,为环境污染物或其代谢物。
所述的方法,其所述环境污染物,为多环芳烃或其代谢物。
附图说明
图1为吸附在氧化锡纳米电极上的钌二(2,2’-二吡啶)(4’-甲基-4-羧基-2,2’-二吡啶)的光电流。
图2为吸附在纳米氧化锡半导体电极上的钌二(2,2’-二吡啶)(4’-甲基-4-羧基-2,2’-二吡啶)的光谱。
图3为不同浓度鸟苷酸催化的光电流。
图4为光电化学检测核酸损伤原理图。
图5为光电化学检测损伤DNA的光电流。
图6为不同浓度损伤DNA的光电流。
具体实施方式
本发明提供一种光电化学检测核酸碱基的方法,包括:(a)将待测样品在合适的条件下与具有光电化学活性的物质进行接触;(b)在电极存在的情况下,用光将光电化学活性物质转化成激发态。被激发的物质失去电子后,与核酸碱基进行氧化还原反应,评价氧化还原反应所产生的电流。(c)根据氧化还原反应所产生的电流,对样品进行定性或定量分析。
本发明的方法中,当用光激发具有光电化学活性的物质时,基态电子会因吸收光子能量而从基态L(G)跃迁至激发态L(E),如式1所示。
光激发:L(G)+hv----→L(E) (1)
处于激发态的电子有很强的活性,可以很容易的失去,迁移至具有较低能量水平的电极上,产生背景光电流,如式2所示。
光电流产生:L(E)+电极-----→L(O)+电极(e) (2)
光电化学物质因失去一个电子变为氧化态L(O)。核酸的特定碱基鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、6-巯基鸟嘌呤、8-oxo-鸟嘌呤和8-oxo-腺嘌呤的氧化还原电势比较低,可以作为还原剂使用。如果溶液中存在这些碱基,光电化学物质将回到原始还原基态,而进入到新一轮的氧化还原反应中,如式3所示,这样这些特定碱基就催化了光电流信号。
光电流催化:L(O)+特定碱基----→L(G) (3)
核酸分子的结构和碱基序列不同它的催化能力也就不同,因此,在其上面所检测出的最终光电流强度也就不同,这就为核酸的定性定量检测提供了理论基础。
本发明提供一种光电化学检测装置,包括:(a)样品池,该池的壁能够透过激发光电化学物质的光;(b)电极,适合分析光电化学物质和电极之间的电子转移所产生的电流;(c)具有光电活性的光电化学物质;(d)光源,能够激发光电化学物质;(e)氧化还原反应检测仪,能够分析检测碱基催化的光电流信号。
所述核酸样品池可以按各种具体实验需要加工成任意形状。
所述电极为可以是金属氧化物电极,电流可以通过它们进入或是离开介质。
所述光电化学物质为所述光电化学活性物质为无机分子、有机分子、无机/有机复合分子、无机聚合物、有机聚合物、无机/有机复合聚合物、无机颗粒物、有机颗粒物或无机/有机复合颗粒物。所述光电化学物质有以下特征:在可见波长范围内有较强的吸收;激发态的能量水平高于电极的能量水平,确保电子转移可以发生;激发态的寿命足够长,可以使电子转移优于发光;光电化学物质的氧化态和还原态是稳定的。
所述的光电化学物质可以固定在电极上、标记到上述核酸上或溶于介质中。
依据不同的试验目的,可以随意设计本发明的具体实施步骤。比如,检测目的可为:A.光电化学检测核酸杂交;B.光电化学检测核酸损伤;C.光电化学检测化学物质基因毒性等。
检测前的器件准备:
1.纳米二氧化锡半导体电极的制备
将氧化铟锡导电玻璃分别用洗涤剂(15分钟)、纯水(2分钟,两次)、丙酮(5分钟)、异丙醇(5分钟)和纯水(10分钟,两次)超声洗涤,吹干,取15nm粒径的二氧化锡胶体溶液均匀铺展在ITO电极板上。干燥后,450℃烧结1小时后,裁成0.5cm×2.5cm的小电极片,即获得纳米二氧化锡半导体电极。
2.钌络合物标记抗生素蛋白的制备
将2mg抗生素蛋白avidin(浓度为10mg/mL,体积为200uL,溶剂为30mM的磷酸缓冲液,PH 8.0),投入30uL含有0.7mg钌二(2,2’-二吡啶)(4’-甲基-4-羧基-2,2’-二吡啶)-琥珀酰胺酯的无水N,N-二甲基酰胺溶液中,并且在黑暗中摇动反应90分钟。未标记上的钌络合物经离心分离出去,得经钌络合物标记好的生物素蛋白(Ru-Avidin)。蛋白的浓度测定采用BCA法,钌的含量用紫外可见分光光度计测定其在470nm处的吸收值。将标记好的蛋白溶于20mM磷酸缓冲液PH 7.3,配成0.2mg/mL的溶液。
3.Ru-Avidin修饰纳米二氧化锡半导体电极
取10uL上述Ru-Avidin溶液均匀铺展到上述实施例2中制备好的纳米二氧化锡电极进行吸附,接触面积为0.5平方厘米,吸附1小时后,用水摇洗5分钟,凉干,即获得修饰好的半导体工作电极。
实施例1
光电流测量
在基于时间的模式下,在CHI 630电化学分析仪上测量光电流。光源为一个20mW的470nm波长的激光。微光电化学池是由磨光的玻璃制成,参比电极为Ag/AgCl,对电极为铂电极。光束垂直射入池中,在其背面作用于二氧化锡电极。手工移动不透光的硬纸板,使光束有规律的间歇照射电极。钌联吡啶络合物在470nm有最大吸收。
如图1所示,吸附了Ru-Avidin的纳米氧化锡电极被放置在20mM的磷酸缓冲液中的光电化学池中,PH 5.5。测量开始时用硬纸板将光束遮住,在每隔10秒将硬纸板抽开一下。可以看出光电化学物质钌的络合物可以在光的激发下产生光电流,但是因为没有催化剂存在,光电流是不稳定的,随着钌络合物的消耗,光电流持续的下降。
如图2所示,吸附了Ru-Avidin的纳米氧化锡电极被放置在20mM的磷酸缓冲液的光电化学池中,PH 5.5。光源为一个500W的氙灯,用单色仪选择需要的波长,将单色仪选择器转到450nm和650nm之间,并检测相应的光电流。这样得到的光谱图类似于钌的吸附光谱,表明光电流是由钌络合物的激发产生的。
实施例2
鸟嘌呤催化光电流的检测
用20mM的磷酸缓冲液PH 5.5将鸟嘌呤核苷酸稀释成如下几个浓度梯度:1μg/mL,5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL和50μg/mL。将稀释好的鸟苷酸溶液加入光电化学池中进行光电检测,得不同浓度鸟苷酸催化的光电流。结果如图3所示(a是0μg/mL;b是1μg/mL;c是5μg/mL;d是10μg/mL;e是20μg/mL;f是50μg/mL)。此实验结果显示,碱基鸟嘌呤对光电化学物质产生的光电流有很强的催化作用,其浓度越高催化作用也就越强。
实施例3
DNA损伤实验
使用氧化苯乙烯作为损伤试剂,氧化苯乙烯是苯乙烯经肝脏中细胞色素P450酶催化后产生的代谢产物,苯乙烯是一种重要的工业化学品,由于工业工程中的散发而广泛存在于环境中,是环境中的一种普遍存在的有毒污染物。小牛雄腺DNA的损伤反应在20mM磷酸缓冲液PH 5.5中进行,反应温度为37℃,反应时间为30分钟,如此获得经氧化苯乙烯损伤的DNA。氧化苯乙烯为致癌物质,实验操作应该尽可能在通风橱里和密闭容器进行,防止吸入或人体接触。
实施例4
光电化学检测DNA损伤
光电化学检测DNA损伤的原理如图4所示,DNA损伤后部分碱基被氧化,导致DNA双链结构的破坏,双链保护下的碱基被不同程度的释放出来,使其更加容易的参与反应,发挥其催化作用,因此,和未损伤的DNA相比,能更大程度的增强光电信号,DNA损伤的程度不同其光电信号的强度也就不同,因此这种光电化学系统能够灵敏的检测出损伤的DNA。
具体检测实验:将一片吸附了Ru-Avidin的纳米氧化锡电极放置于光电化学池中,取600uL,PH 5.5,20mM的磷酸缓冲液加入到光电化学池中,调激光强度到10mW,在没有任何物质催化下得到磷酸缓冲液的背景光电流。取0.05mg/mL的未损伤的小牛雄腺DNA(CT-DNA)溶液(600uL,溶在20mM的磷酸缓冲液中,PH 5.5)加入到光电化学池中,打开激光,CT-DNA的光电流,CT-DNA的光电流要强于背景电流值,说明DNA对光电化学反应具有催化作用。取600uL经实施例6步骤损伤的CT-DNA溶液(浓度为0.05mg/mL,溶在20mM的磷酸缓冲液中,PH 5.5)加入到电解池中,打开激光,得损伤的CT-DNA的光电流,和未损伤CT-DNA A的光电流相比,损伤CT-DNA的光电流值进一步增强,说明DNA被损伤后,其双链结构遭到破坏,双链保护下的碱基被不同程度的释放出来,催化作用增强。结果如图5所示(a是磷酸背景;b是未损伤CT-DNA的光电流;c是损伤CT-DNA的光电流;激光每隔10秒开关一次)。
实施例5
光电化学检测不同浓度的损伤DNA
用20mM的磷酸缓冲液PH 5.5将损伤的CT-DNA配成如下几个浓度梯度:0.15mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.02mg/mL和0.005mg/mL。将5种配好的损伤的CT-DNA溶液加入光电化学池中,按照实施例7的方式进行光电检测,得不同浓度损伤CT-DNA的光电流,结果如图6所示(a是0.15mg/mL;b是0.1mg/mL;c是0.05mg/mL;d是0.02mg/mL;e是0.005mg/mL;f是0mg/mL)。此实验结果显示,光电化学系统对损伤DNA的检测非常的灵敏,即使当其浓度只有0.005mg/mL时,和背景电流相比其光电流值仍有很明显的增强。
Claims (21)
1、一种光电化学检测核酸碱基的方法,其特征在于,包括:
(a)将待测样品与具有光电化学活性的物质进行接触;
(b)在电极存在的情况下用光将光电化学活性物质转化成激发态,被激发的物质失去电子后,与核酸碱基进行氧化还原反应,评价氧化还原反应所产生的电流;
(c)根据氧化还原反应所产生的电流,对样品进行定性或定量分析。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测样品中的分析物是核苷酸、寡核苷酸或核酸。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样品中的核酸碱基为鸟嘌呤、腺嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、8-氧化鸟嘌呤或8-氧化腺嘌呤。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的光电化学活性物质为无机分子、有机分子、无机/有机复合分子、无机聚合物、有机聚合物、无机/有机复合聚合物、无机颗粒物、有机颗粒物或无机/有机复合颗粒物。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述光电化学活性物质,其物质为金属/有机配体络合物。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述金属/有机配体络合物,其金属为钌或锇。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述金属/有机配体络合物,其有机配体为含氮的芳香族杂环。
8.根据权利要求7所述的的方法,其特征在于,所述有机配体为联吡啶、连吡嗪、联三吡啶、菲酚、酞氰染料、取代的联吡啶、取代的连吡嗪、取代的联三吡啶、取代的菲酚、二吡啶并[3,2-a;2’,3’-c]吩嗪或邻二单氮杂菲。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述电极为金属氧化物电极。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述金属氧化物电极材料,为二氧化锡。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述金属氧化物电极,是由纳米颗粒二氧化锡在导电基质上制备。
12.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述(a)步中待测样品,包括核酸杂交样品或受损伤的核酸样品。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述核酸杂交样品的光电化学检测方法,包括:
(a)将核酸杂交样品与具有光电化学活性的物质进行接触;
(b)在电极存在的情况下用光将光电化学物质转化成激发态,被激发的物质失去电子后,与核酸碱基进行氧化还原反应,评价杂交前后氧化还原反应所产生的电流的变化;
(c)根据杂交前后氧化还原反应所产生的电流变化,对样品进行定性或定量分析。
14.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述受损伤的核酸样品的光电化学检测方法,包括:
(a)将受损伤的核酸样品与具有光电化学活性的物质进行接触;
(b)在电极存在的情况下用光将光电化学物质转化成激发态,被激发的物质失去电子后,与核酸碱基进行氧化还原反应,评价核酸损伤前后氧化还原反应所产生的电流的变化;
(c)根据核酸损伤前后氧化还原反应所产生的电流的变化,对样品进行定性或定量分析。
15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述受损伤的核酸样品是化学因素引起的损伤,为烷基化试剂所引起的碱基脱落、碱基烷基化、DNA链断裂、DNA链交联,或是亚硝酸盐与碱基形成重氮盐引起的损伤,或是嵌入剂因插入DNA链而引起的损伤,或是由于碱基类似物进入细胞代替正常的碱基参入DNA链干扰DNA复制合成而引起的损伤。
16.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述受损伤的核酸样品是物理因素引起的损伤,为紫外线、高能射线或电离辐射引起的损伤。
17.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述DNA分子自身因素引起的损伤,或为DNA复制中的错误。
18.根据权利要求1所述的方法,用于化学物质基因毒性的检测,其特征在于,包括:
(a)将待测化学物质与核酸探针进行损伤反应;
(b)将上述反应产物与具有光电化学活性的物质进行接触;
(c)在电极存在的情况下用光将光电化学物质转化成激发态,被激发的物质失去电子后,与核酸碱基进行氧化还原反应,评价核酸损伤前后氧化还原反应所产生的电流的变化;
(d)根据核酸损伤前后氧化还原反应所产生的电流的变化,对所述化学物质的基因毒性进行定性或定量分析。
19.根据权利要求18所述的方法,其特征在于,所述化学物质,为环境污染物或其代谢物。
20.根据权利要求19所述的方法,其特征在于,所述环境污染物,为多环芳烃或其代谢物。
21.根据权利要求1、13、14或18所述的方法,其特征在于,所述用光激发光电化学物质,其发光光源为:中空的阴极灯、氙弧灯、氙汞灯、金属卤化物灯、发光二极管或激光。
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