KR101277799B1 - 식품원료 내 가금류 원료의 혼입여부를 판별하는 방법 - Google Patents

식품원료 내 가금류 원료의 혼입여부를 판별하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가짜식품의 유통 차단을 위한 과학적인 식품감시를 위한 것으로, 보다 상세하게는 특정 서열의 정방향 프라이머(forward primer)와 특정서열의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진 PCR 프라이머 세트를 이용하여 식품원료 내 특정 가금류 원료의 혼입여부를 판별하는 방법에 관한 기술이다.
본 발명에 따르면, 가짜식품의 유통 차단을 위한 과학적인 식품감시가 가능해지므로 유리한 효과가 인정된다고 할 것이다. 나아가 식품 중 허위표시로 소비자의 신뢰에 반하는 가짜식품을 판별할 수 있는 유전자분석법의 도입은 안전한 식품의 유통 관리에 크게 기여할 수 있는바, 궁국에는 식품산업 발전에 초석(礎石)을 다질 수 있을 것으로 기대된다.

Description

식품원료 내 가금류 원료의 혼입여부를 판별하는 방법{Development of PCR Primers for Species Identification of poultry}
본 발명은 가짜식품의 유통 차단을 위한 과학적인 식품감시를 위한 기술이다. 보다 상세하게는 특정 서열의 정방향 프라이머(forward primer)와 특정서열의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진 PCR(Polymerase Chain Reaction) 프라이머 세트를 이용하여 식품원료 내 특정 가금류 원료의 혼입여부를 판별하는 방법에 관한 기술이다.
최근 EMA(Economically Motivated Adulteration)식품은 원산지를 속이거나, 비용을 줄이기 위해 가짜원료 또는 식품에 사용이 허가되지 않은 원료를 사용하거나, 표기사항을 허위로 표기하는 등의 형태로 발생하고 있으며, 그 수법이 다양해지고 있다. 대표적인 예로, 중국에서는 전 세계를 경악하게 만든 멜라민 첨가 유아용 분유 사건을 비롯하여, 포름알데히드를 희석시켜 만든 가짜 술(2004), 종이로 만든 무(2008), 저질 포도주에 식품첨가물과 표백제를 넣어 제조한 포도주(2004), 화학약품으로 만든 계란(2007)과 오리알(2010), 머리카락이나 유해물질 등으로 만든 간장(2008), 폐기 유지를 정제한 식용유(2010, 2011) 등이 제조·유통되는 사례가 증가하고 있어 사회적 문제가 되고 있다. 그리고 유럽에서 헤이즐넛 오일을 첨가한 올리브 오일(2000), 양과 염소 및 버펄로의 젖을 첨가한 우유(2004), 설탕이나 시럽을 첨가한 꿀(2007, 2008), 가짜원료를 첨가한 과즙음료(2008) 등이 적발되고, 미국에서 저가의 옥수수시럽이 첨가된 꿀과 백돔으로 허위 표기한 농어(2007), 콩기름이나 저급 식용유에 클로로필을 섞어 색을 위조한 올리브오일(2008) 등이 적발되는 등 EMA식품이 증가하고 있다
국내에서 원산지를 속이는 사건은 보통 저가의 외국산 원료 또는 식품을 신고 또는 표기하지 않거나 고가의 지방 특산식품으로 둔갑되어 유통되는 등의 형태로 적발된다. 실제로 최근 국내에서는 국산으로 허위 표기된 중국산 산약과 쌀(2007), ‘경기미’로 판매되는 원산지가 불분명한 쌀(2007), 국산으로 판매되는 중국산 배추와 김치(2007), 중국산을 인위적으로 혼합한 녹두(2007), 국산 대추로 판매되는 중국산 대추(2007), 국산으로 허위 표기한 중국산 고춧가루(2009), ‘안동참마’로 판매되는 원산지 불명의 참마(2009), 국산으로 판되는 중국산 참깨를 사용한 참기름(2009) 등의 사건들이 적발된 사례가 있다. 비용을 줄이기 위해 가짜원료 또는 해당식품에 사용이 허가되지 않은 식품첨가물 등의 원료를 사용하는 형태가 주로 발생한다. 실제로 최근 중국산 메기 내장을 사용한 가짜 창란젓(2009), 깻묵과 콩기름을 섞어 제조한 가짜 참기름(2009), 중국산 들기름과 콩기름을 섞어 제조한 들기름(2009), 원료를 확인할 수 없는 100% 포도씨기름(2009), 지하수에 설탕과 효소제(인베르타제)를 첨가한 가짜벌꿀(2009), 에탄올과 캐러멜 색소 등을 섞은 가짜 양주(2009), 향미유를 참기름으로 유통(2009, 2010) 등이 유통되다가 적발된 사례가 있다. 표기사항을 위반하는 경우는 사용 원료의 함량을 허위로 표기하거나, 사용하지 않은 원료가 표기되는 등의 형태로 적발된다. 실제로 최근 중국산 가공용 쌀과 저가의 국산 쌀로 누룽지를 만들어 원산지를 국산으로 허위 표기하고(2009), 중국산과 국산 양파를 깐 양파로 가공하고 혼합하여 국산으로 허위표시하고(2009), 가공용 수입쌀과 전분 및 국산 찹쌀 등으로 가공하거나 찹쌀을 사용하지 않고 만든 떡의 원산지를 ‘찹쌀(국산), 멥쌀(국산)’으로 허위 표시하고(2009), 가공용 국산 고추씨를 중국산 고추씨와 혼합, 고춧가루로 가공한 후 원산지를 국내산 또는 혼합비율을 허위로 표시하는(2009) 등의 형태로 적발된 사례가 있다. 이들 중 대부분은 중국 등 해외에서 수입한 저가의 원료 및 식품들로 인하여 문제가 발생하였으며, 제조 수법이 다양해지고 여러 방법들이 병행되어 사용되면서 진위여부 판별이 어려워지고 있는 실정이다.
이하, 본 발명과 관련하여 국내외 연구개별 현황을 개시한다.
첫째, 국내 연구개발 현황을 살피면, 현재 품종, 원산지 및 다른 원료의 혼입여부를 판별하기 위한 연구는 대체사용이 가능하고, 유사한 형태를 가진 원료, 상대적으로 가격차이가 많은 대두, 참깨, 들깨, 쌀, 육류, 식용유지, 특용작물 등 일부의 식품을 중심으로 이루어지고 있다. 하지만, EMA식품의 수가 증가하고 제조방법이 다양해지면서 다양한 연구가 진행되고 있다. 전자코를 이용한 연구는 향기 성분을 함유하고 있는 식품의 휘발성 성분을 감지하여 판별 및 분석을 하는데, 이를 이용하여 식품의 종류, 원산지 및 혼입여부를 판단하는 데 사용하고 있다. 현재 국내에서는 영지, 참깨, 칡 등의 특용작물과 참기름, 육류 및 참깨 등의 원산지 및 저가 원료의 사용여부를 확인하는데 주로 사용하고 있다. 전자코는 향기가 약한 시료보다 향기가 강한 시료의 분석정확도가 상대적으로 높지만 완벽하게 판별하는 것은 어렵고, 향기패턴이 유사한 시료간의 구별은 어렵지만, GC, SPME-GC/MS 등의 기존 분석방법 보다는 그 활용도가 높다는 연구보고가 있다. 이와 같이 분석값의 오차범위가 넓어서 100%의 활용은 어렵지만, 전처리가 필요 없고 분석시간이 짧으며, 휘발성 향기성분을 가진 모든 식품에 적용할 수 있는 장점을 가지고 있기 때문에 전자코에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 모세관 내에서 시행하는 전기영동법의 일종으로 미량의 시료를 단시간에 분리, 분석하는 데 사용하는 CE(Capillary Electrophoresis)는 보통 품종 및 원산지를 판별하는 데 사용하고 있다. 선행된 연구에서는 동진벼 group(동진벼, 계화벼, 영남벼), 추청벼 group(추청벼, 오대벼, 만금벼 및 봉광벼) 및 일품벼 group(일품벼, 화성벼, 화영벼) 등 3group의 구분이 가능하고, 율무와 황기의 원산지를 비교적 높은 비율로 구분할 수 있다고 한다. 일반성분분석 결과 유의적인 차이를 보이지 않는 참깨 및 콩 등의 시료의 원산지는 NMR(Nuclear Magnetic Resonance)로 정확한 판별이 가능하고, 토종꿀과 양봉꿀은 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)로 구분이 가능하다. 이밖에도 DNA분석법, NIR(Near Infrared Ray)로 EDXRF(Energy Dispersive X-Ray Fluorescence spectrometer), ICP-AES(Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectrometer), ICP-MS(Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometer) 및 색소판별법 등을 이용하여 원산지와 품종을 판별하는 방법도 있지만 판별 정확성이 높지 않아 꾸준한 연구가 필요한 실정이다. 특히 가공식품의 경우 제조공정 중에 가열처리, 산처리, 고압 등의 과정을 거치면서 식품원료에서 기인하는 단백질의 변성도가 높아 단백질 분석법이나 이화학적인 성분 분석법은 실효성이 높지 않다. 따라서 모든 생물체가 공통으로 보유하고 있는 유전자를 분석하는 방법으로 접근하는 연구가 활발히 이루어지고 있다.
둘째, 국외 연구개발 현황을 살피면, 영국 FSA(Food Standard Agency)의 FARSP(Food Authenticity Research and Surveillance Programmes)에서는 식품군별 EMA식품 동향 및 판별법에 관한 연구를 수행하고 있다. 또한, 여러 지역의 기후요인과 지질학적 데이터베이스를 바탕으로, 특정 동위원소 및 무기질 등의 정보를 이용하여 식품의 원산지를 판별, 예측할 수 있는 연구를 수행하고 있다. 이러한 연구를 수행 중인 식품군은 유제품 및 난류, 식용유지류, 수산물 및 수산물가공품, 과일주스, 식초, 차 및 주류, 야채류, 꿀, 잼 및 초콜릿, 육류 및 육류가공품), 쌀, 파스타 및 씨리얼 및 채소류 등이 있다. FSA의 EMA 식품 주요 연구 결과로는 IRMS, deuterium SNIF-NMR 및 PCR을 이용하여 헤이즐넛 오일을 첨가한 올리브 오일을 판별, ELISA & PCR 및 ELISA & NMR을 이용하여 양, 염소 및 버팔로의 젖을 첨가한 우유의 판별, IRMS, NMR 및 ICP-MS를 이용한 와인의 성분 분석, PCR-RFLP를 이용한 과일주스의 진위여부 판별, IRMS를 이용한 유기농산물의 진위여부 판별, DNA분석법을 이용한 잼과 요거트 중 과일 첨가 여부 확인, DNA분석법을 이용한 가공품 중 흰살 생선의 함량 측정, DNA분석법을 이용한 육류가공품 중 사용된 육류의 종류 확인, ELISA를 이용한 육류가공품 중 육류의 함량 측정 등이 있다. 미국의 FDA(Food and Drug Administration)는 EMA식품이 급속도로 늘어나고는 있지만 식품의 안전성에는 크게 문제가 없다는 견해를 보여 왔다. 하지만 2008년 발생한 멜라민 분유 사건을 계기로 인체에 치명적인 위해를 불러올 수도 있는 EMA식품으로부터 발생하는 피해를 인식하고 이를 사전에 예방하기 위한 정책을 추진 중이다. 현재 미국에서는 한번이상 적발된 EMA식품의 동향 및 판별법에 대한 연구를 수행하고 있으며 주류, 음료, 해산물, 올리브 오일, 벌꿀, 메이플 시럽 및 바닐라 등을 위조한 사례 및 주의사항을 배포하고 있다. 일본은 유통되고 있는 식품의 원산지 및 원료 진위여부 및 안전성에 대한 모니터링을 실시하고 정보를 공유하고 있다. 이와 같이 전 세계적으로 EMA식품에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있지만, 국내에서는 예방 및 사후대책은 미비한 실정이므로 지속적인 연구가 필요하다고 판단된다. 하단의 표에서는 국내외에서 진행되고있는 EMA 분석법에 대한 주요 연구현황을 정리하였다.
Figure 112012044221561-pat00001
최근 가짜식품(부정식품)은 원산지를 속이거나, 저가의 원료를 사용하거나, 또는 식품에 사용이 허가되지 않은 원료를 사용하거나, 표기사항을 허위로 표기하는 등의 형태로 발생하고 있으며, 그 수법이 다양해지고 있다. 대표적인 예로, 전 세계를 경악하게 만든 멜라민 첨가 분유 사건을 비롯하여, 메기내장을 창란젓으로 둔갑하여 유통시키고 깻묵과 콩기름을 섞어 만든 참기름 등의 제조·유통 사례가 있다.
최근 경제적 이득을 취하기 위한 가짜식품의 제조 수법이 다양해지고 발생건수가 증가하고 있기 때문에 우리나라를 포함한 미국, 영국 등의 여러 나라에서 가짜식품에 대한 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구는 원료 및 완제품의 특성에 맞게 다양한 기기 및 분석법을 이용하여 식품의 진위여부를 판별하는 방법으로 이루어지고 있다.
Figure 112012044221561-pat00002

현재 우리나라에서는 농·축산물 등 원료 식품에 대한 원산지 및 가짜원료 사용여부 판별에 대한 연구는 수행되고 있으나, 가공식품에 대한 판별 연구는 초기 수행단계이고, 가짜식품의 예방 및 사후대책은 미비한 실정이다.
중국 및 동남아시아 등으로부터 가짜식품으로 의심되는 식품의 수입이 증가하고 있고, 그 제조 수법이 다양해지면서 국민의 건강이 위협받고 있으며, 관련정보가 부족하여 식품에 대한 국민의 불안감이 커지고 있다.
따라서, 본 연구에서는 가짜식품의 제조·유통을 사전에 차단할 수 있도록 유전자분석법을 통한 가짜식품의 판별법을 개발하고 관련 자료의 DB를 구축하여 가짜식품에 대한 관리 대책의 기초 자료를 제공하고자 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
식품 중 허위표시로 소비자의 신뢰에 반하는 가짜식품을 판별할 수 있는 유전자분석법의 도입을 위해, 본 발명에서는 서열번호 1의 정방향 프라이머(forward primer) 및 서열번호 2의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진 PCR 프라이머 세트를 이용하여 식품원료 내 닭(Gallus gallus) 고기(meat)의 혼입여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 세트를 이용하여 식품원료 내 오리(Anas platyrhynchos) 고기의 혼입여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 세트를 이용하여 식품원료 내 칠면조 (Meleagris gallopago) 고기의 혼입여부를 판별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 세트를 이용하여 식품원료 내 타조(Struthio camelus) 고기의 혼입여부를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 가짜식품의 유통 차단을 위한 과학적인 식품감시가 가능해지므로 유리한 효과가 인정된다고 할 것이다. 나아가 식품 중 허위표시로 소비자의 신뢰에 반하는 가짜식품을 판별할 수 있는 유전자분석법의 도입은 안전한 식품의 유통 관리에 크게 기여할 수 있는바, 궁국에는 식품산업 발전에 초석(礎石)을 다질 수 있을 것으로 기대된다.
제1절 시료전처리, 유전자 추출, 유전자 증폭 및 확인
1. 시료전처리
시료채취는 식품원료(농축수산물)의 경우 어느 부분을 취하여도 유전자 추출에 큰 영향이 없지만 가공식품의 경우 식품 유형에 따라 유전자 추출 효율이 달라질 수 있다. 또한 유전자가 다량 추출되었다하더라도 식품구성성분으로부터 유래한 단백질, 지방, 탄수화물 등이 존재하면 유전자 증폭시 반응억제제(PCR inhibitor)로 작용하여 최종목표를 달성하기 어려운 경우가 있어 식품유형별로 시료채취 또는 시료전처리를 아래와 같이 권장한다.
가) 건어포류 : 식품 중 어육, 패육 등의 판별법을 적용하기위한 북어채 등의 경우에는 소량의 혼입량도 확인하여야하기 때문에 가급적 많은 양의 시료를 유전자추출에 사용한다. 또한 염농도가 높은 제품은 일정시간동안 멸균증류수에 침지하여 탈염과정을 반복하면 효율적이다.
나) 떡류 : 식품 중 곡류 등의 판별법을 적용하기위한 떡국떡 등의 경우에는 유전자추출의 효율을 높이기 위하여 아밀라제(amylase) 등의 효소를 이용할 수 있다.
다) 분말류 : 원료 중 근채류 등의 판별법을 적용하기 위한 인홍삼분말 등의 경우에는 모든 내용물을 시료로 선택하여야한다.
라) 전류 : 식품 중 어류판별법을 적용하기 위한 대구전, 동태전 등의 경우 밀가루 부분을 제거하고 내부의 어육부분만을 시료로 선택할 수 있다.
마) 젓갈류 : 원료 중 어류, 패류 등의 판별법을 적용하는 경우 젓갈류에 사용된 고춧가루 등의 양념류는 증류수로 세척하여 내용물 만을 시료로 선택할 수 있다.
바) 죽류 : 전복죽 중 패류 등의 판별법을 적용하는 경우 육안판별이 가능한 경우 전복 등의 내용물 만을 시료로 선택할 수 있다. 다만, 육안판별이 어렵거나 미세하게 분쇄된 경우에는 전체를 시료로 선택하여야한다.
사) 기타 유전자추출 효율을 높이기 위하여 식품유형별 전처리 조건 등에 대하여 다양하게 할 수 있다.
2. 유전자 추출
유전자추출은 크게 두 가지로 나눌 수 있으며, 첫째, 실험실내에서 시약을 직접 제조하여 사용하는 일반적인 방법, 둘째, 상업적으로 판매되고 있는 키트를 사용하는 방법으로 나눌 수 있다. 본 연구에서는 두 가지 방법을 모두 병행하여 사용하였으며 추출방법은 아래와 같이하였다.
2.1. 유전자 추출 Ⅰ(CTAB 완충용액 사용법)
가) 균질하게 분쇄된 검체 2 g을 폴리프로필렌 튜브(50 mL용)에 넣고, CTAB 완충액 15 mL를 가하여 교반기(vortex mixer)로 잘 섞은 후 추가로 CTAB 완충액 30 mL를 가하고 55℃에서 30분간 반응시킨다(10분마다 10초간 교반기를 사용하여 충분히 혼합한다).
나) 균질화한 용액 600 μL를 1.5 mL 튜브에 넣고 P:C:I 용액 500 μL를 가하여 잘 혼합한 후 원심분리(12,000 rpm, 15분, 실온)한다.
다) 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮긴 후 C:I 용액 500 μL를 가하여 교반기를 이용하여 잘 혼합한 후 원심분리(12,000 rpm, 15분, 실온)한다.
라) 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮기고 동량의 이소프로판올을 가하여 혼합 후 원심분리(12,000 rpm, 10분, 실온)한다.
마) 상층액을 버리고, 침전물에 500 μL의 70% 에탄올을 벽면으로 천천히 가한 후 원심분리(12,000 rpm, 1분, 실온)한 후 상층액을 제거한 후 건조시킨다.
바) TE 완충액(pH 8.0) 50 μL를 가하여 잘 녹인다. 단, 추출된 DNA를 정제하기 위하여 바)의 용액에 RNase A (10 ㎎/mL) 1 μL를 가하여 37℃에서 30분간 정치한 경우에는 나)~바) 항을 할 수 있다
※ 상기시험법에 사용된 시액의 조성은 아래와 같다.
- CTAB 완충액 : 0.5 M EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic acid, pH 8.0) 8 mL, 1 M Tris-Cl(pH 8.0) 20 mL, 5 M NaCl 56 mL를 넣고 증류수로 약 150 mL가 되도록 한 후, CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 4 g을 가하여 완전히 용해시킨다. 그리고 증류수를 넣어 전체 양을 200 mL로 조정한 후 멸균한다.
- TE buffer : 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA
- P:C:I 용액 : Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol=25:24:1
- C:I 용액 : Chloroform:Isoamylalcohol=24:1
2.2. 유전자 추출 Ⅱ(Lysis 완충용액 사용법)
가) 시료를 액체질소나 드라이아이스를 이용하여 잘 갈아준다.(파쇄 입자가 적을수록 DNA 추출 수율이 좋다.)
나) DNA Extraction buffer를 첨가(1g:1ml)하여 잘 섞어준다.
다) 65℃ 항온수조에서 60분간 처리한다 (5분 간격으로 흔들어준다).
라) 튜브를 항온수조에서 꺼내어 첨가한 DNA Extraction buffer와 동량의 P:C:I 용액을 넣어준 후 잘 섞어준 후 원심분리(13,000rpm, 20분, 4℃) 한다.
마) 상층액을 새 튜브에 옮긴 후 동량의 C:I 용액을 넣고 원심분리(13,000rpm, 15분, 4℃)한다
바) 상층액을 새 튜브에 옮겨준 후 동량의 isopropanol을 첨가한 후 잘 섞어준 후 원심분리(13,000rpm, 15분, 4℃)한다.
사) 상층액을 버리고 1 ml 70% 에탄올을 넣고 10~15초 동안 잘 섞고 원심분리(13,000rpm, 10분)한다.
아) 상층액을 버리고 침전물(pellet)을 상온에서 하룻밤 방치하거나 건조기기를 이용하여 완전히 건조시킨다 (Pellet에 알코올이 완전히 제거될 때까지 건조시킨다).
자) 건조가 끝나면 100ul의 TE buffer를 첨가 후 pellet을 완전히 녹인다.
차) RNase A (10 ㎎/mL) 1 μL를 첨가하여 잘 섞어준 후 37℃ 배양기에서 30분 반응시킨다.(필요시)
※ 상기시험법에 사용된 시액은 아래와 같다.
- DNA Extraction buffer : 100mM Tris(pH 8.0), 500mM NaCl, 50mM EDTA, 1.2% SDS (w/v), β-mercaptoethanol 0.2% (w/v)(단, β-mercaptoethanol은 사용하기 전에 첨가)
2.3. 유전자 추출 Ⅲ(DNeasy Plant mini Kit)
가) 분쇄된 시료 약 0.1g에 AP1 400ul 및 RNase A(100mg/ml) 4ul를 넣어 혼합한 후 65℃에서 10분간 반응시킨다(반응 중에는 2-3번 혼합함)
나) AP2 130ul를 넣어 혼합하여 얼음에 5분간 반응 후 원심분리한다(14,000 rpm, 5분)
다) 상층액을 QIAshredder mini spin 칼럼에 넣고 원심분리한다(14,000 rpm, 2분)
라) 용출액의 1.5배에 해당되는 AP3/E를 넣고 혼합 후 DNeasy Mini spin 컬럼에넣고 원심분리한다(8,000 rpm, 1분)
마) AW 용액 500ul로 2회 세척하고 AE 용액 100ul를 넣고 상온에서 5분간 반응시킨다
바) 반응 후 원심분리하여(8,000 rpm, 1분) 최종 용출한다
2.4. 유전자 추출 Ⅳ(DNeasy Blood & Tissue Kit)
가) 분쇄된 시료 약 0.1g에 ATL 180ul 및 proteinase K 20ul를 넣어 혼합한 후 56℃에서 충분히 반응시킨다(반응 중에 여러번 혼합하며, 8시간정도 반응시킴)
나) 시료에 AL 200ul를 넣어 혼합하고 에탄올 200ul를 넣고 잘 혼합한다
다) 반응액은 DNeasy Mini spin 컬럼에 넣고 원심분리한다(8,000 rpm, 1분)
라) spin 컬럼에 AW1 500ul을 넣고 원심분리한다(8,000 rpm, 1분)
마) spin 컬럼에 AW2 500ul을 넣고 원심분리한다(14,000 rpm, 3분)
바) spin 컬럼을 Eppen tube에 옮기고 AE 200ul를 넣어 원심분리하여(8,000 rpm, 1분) 유전자를 회수한다
3. 유전자 추출 확인
3.1. DNA의 농도 및 순도 확인
DNA 원액의 농도는 TE 완충액(pH 8.0) 또는 멸균증류수로 적절히 희석한 후 분광광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하고, 그 값이 1일 때 DNA 농도가 50 ng/μL인 것으로 하여 계산한다. 한편, 추출된 DNA의 순도를 확인하기 위하여 230, 260, 280 nm에서 흡광도를 각각 측정한다. A260/A280과 A260/A230이 1.7～2.0일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판단한다. 다만, 가공식품의 경우 이러한 순도 적용이 어려운 경우가 있으므로 반드시 적용되는 것은 아니다. 만일 A260/A280이 낮아 단백질 유래 불순물의 혼입이 우려되는 경우 단백질 분해효소(protease)로 처리한 후 DNA를 회수하며, A260/A230이 낮을 경우 전분 분해효소(amylase)로 처리한 후 DNA를 회수하여 PCR에 사용할 수 있다.
DNA 원액에 대한 DNA 농도로부터 PCR에 필요한 DNA 농도가 되도록 TE 완충액(pH 8.0) 또는 멸균증류수로 희석하여 PCR용 DNA로 하고, 20 μL씩 0.5 mL 튜브에 분주하여 -20℃ 이하에서 냉동 보존한다. 소분 보관 중인 PCR용 DNA는 사용 전 실온에서 서서히 녹여 사용하였다.
3.2. 추출 DNA의 농축
DNA 원액의 농도가 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우 재 추출하고, 그래도 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우 원액을 PCR용 DNA로 사용하거나 다음과 같은 농축과정을 실시하여 사용할 수 있다.
추출 DNA 원액의 농축은 시중에 판매되고 있는 DNA 농축키트를 사용하거나, 다음과 같은 방법에 의한다. 3 M 초산나트륨 (pH 5.2)을 DNA 용액량의 1/10배 (10 M 초산암모늄을 사용할 경우에는 1/5배를 첨가)를 첨가하고 차게 한 에탄올을 2배량 가한 후 12,000 rpm에서 15분간 원심분리한다(이소프로판올을 사용할 경우에는 1배량을 첨가한 후 상온에서 원심분리한다). 원심분리 후 상층액은 버리고 염(salt)을 제거하기 위하여 침전물을 70% 에탄올로 세척하고, TE 완충액(pH 8.0) 또는 멸균증류수 적당량으로 녹인 후 사용한다(최초의 DNA 원액이 소량일 경우에는 멸균증류수를 사용하여 시작량을 300～400 μL로 한 후 농축할 수 있다).
4. 유전자 증폭 및 확인
유전자증폭 후 결과 확인은 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 젤을 통하여 확인할 수 있으며 본 연구에서는 아가로스 젤을 이용하였으며 단계별로는 아래와 같다.
4.1. 유전자증폭 반응액 조성 및 조건
4.1.1. 반응액 조성
PCR을 위한 반응액의 조성은 아래 표 - 1과 같으며, 경우에 따라 MgCl2의 농도를 1.5~2.5mM로 조정할 수 있다
성 분 Stock 용액 농도 최종 농도(튜브) 1회 분량
DNA polymerase 5 U/μL 1.0 U 0.2 μL
완충액 10 x 1 × 2.5 μL
MgCl2 25 mM 2.5 mM 2.5 μL
dNTPs 2.5 mM 200 μM 2.0 μL
프라이머 각 25 μM 각 0.5 μM 0.5 μL
주형DNA 50 ng/μL 50 ng 1.0 μL
멸균증류수 15.8 μL
전체량 25.0 μL
4.1.2. 반응조건
PCR을 위한 반응조건은 식품원료별로 조건을 다르게 하여 실시하였으며 아래 표 - 2부터 11까지 명시되어있다.
하기 표 - 2는 PCR 반응 조건(소, 돼지, 양, 염소, 사슴, 말)에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 95℃ 10분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 95℃
59℃
72℃		 30초
10초
40초		 40
최종신장(elongation) 72℃ 5분 1
보존 4℃ - - -
하기 표 - 3은 PCR 반응 조건(닭)에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 95℃ 10분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 95℃
62℃
72℃		 30초
5초
30초		 40
최종신장(elongation) 72℃ 5분 1
보존 4℃ - - -
하기 표 - 4는 PCR 반응 조건(오리, 칠면조, 타조)에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 95℃ 10분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 95℃
63℃
72℃		 30초
7초
30초		 40
최종신장(elongation) 72℃ 5분 1
보존 4℃ - - -
하기 표 - 5는 PCR 반응 조건(마늘, 양파)에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수
초기변성(Initial denaturation) 94℃ 10분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 94℃
50℃
72℃		 30초
30초
30초		 40
최종신장(elongation) 72℃ 5분 1
보존 4℃ - -
하기 표 - 6는 PCR 반응 조건(무)에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 95℃ 4분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 95℃
67℃
72℃		 30초
30초
2분		 10 결합cycle은 0.8℃씩 감소
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 95℃
59℃
72℃		 30초
30초
2분		 30
최종신장(elongation) 72℃ 7분 1
보존 4℃ - - -
하기 표 - 7는 PCR 반응 조건(쌀)에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 94℃ 2분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 94℃
60℃
72℃		 10초
10초
30초		 32
최종신장(elongation) 72℃ 3분 1
보존 4℃ - - -
하기 표 - 8는 PCR 반응 조건(밀)에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 94℃ 12분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 94℃
60℃
72℃		 30초
20초
30초		 35
최종신장(elongation) 72℃ 2분 1
보존 4℃ - - -
하기 표 - 9는 PCR 반응 조건(메밀)에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 94℃ 12분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 94℃
55℃
72℃		 30초
20초
30초		 35
최종신장(elongation) 72℃ 2분 1
보존 4℃ - - -
하기 표 - 10는 PCR 반응 조건(인삼, 마)에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 95℃ 10분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 95℃
55℃
72℃		 30초
15초
30초		 40
최종신장(elongation) 72℃ 3분 1
보존 4℃ - - -
하기 표 - 11는 PCR 반응 조건(더덕, 도라지)에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 95℃ 10분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 95℃
57℃
72℃		 30초
15초
30초		 40
최종신장(elongation) 72℃ 3분 1
보존 4℃ - - -
4.2. PCR 증폭산물 확인
4.2.1. 영동조의 준비
겔의 농도는 전기영동할 DNA의 길이와 아가로스 겔의 종류에 따라 결정한다. 본 실험에서는 전기영동하고자 하는 대상이 검체에서 추출한 DNA와 크기가 200 bp 전후의 PCR 증폭산물이므로 이에 적합한 아가로스 겔을 제조사의 설명서를 참고하여 사용한다. 필요량의 아가로스를 칭량하여, 전기영동 완충액을 넣고 가열하여 아가로스를 녹여 사용한다. 전기영동 완충액으로는 0.5배 또는 1배의 TAE (Tris-acetate/EDTA) 완충액 또는 TBE (Tris-borate/EDTA) 완충액을 사용할 수 있으나, 아가로스 겔의 제조 시 사용된 완충액과 같은 것을 전기영동과정 및 겔의 염색과정에서도 사용하여야 한다. 또한 200 bp 이하의 작은 크기의 PCR 증폭산물을 전기영동하므로 아가로스는 겔 농도가 높은 것을 사용한다(PCR산물의 크기에 따라 1.5~2.5% 사용). 아가로스가 충분히 녹아 겔이 균일하게 되면 55℃ 정도로 식혀서 겔 조제용 틀에 넣고 콤(comb)을 끼운 후 30분 가량 방치하여 충분히 겔을 굳힌다. 전(前)염색법의 경우 겔 조제용 틀에 넣기 전에 아가로스겔 100 mL당 5 μL의 에티디움 브로마이드(EtBr) 용액(10 ㎎/mL)을 넣고 잘 혼합한다. 겔이 굳으면 겔이 잠기도록 전기영동 완충액을 부어 콤을 조심스럽게 뺀다. 겔을 전기영동조에 장착하고, 겔의 윗면이 충분히 잠길 정도로 전기영동 완충액을 채운다.
4.2.2. 전기영동
PCR 증폭산물에 1/6배의 염색액(gel loading buffer)을 혼합 후 겔의 각 홈에 시료를 조심스럽게 넣으며, 양끝의 각 홈에는 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA (Marker DNA)을 넣는다. 시료를 주입 후, 사용하는 전기영동조의 규격에 맞는 전압에서 전기영동한다. 염색액에 함유된 BPB (Bromophenol Blue)가 겔의 1/2에서 2/3가량 진행하면 전기영동을 멈추고 화상분석기 등을 이용하여 전기영동 결과를 확인한다.
4.2.3. 겔의 염색
후(後)염색법의 경우 전기영동 완충액 100 mL당 5 μL의 에티디움 브로마이드(EtBr)용액(10 ㎎/mL)을 넣은 염색액에 영동이 끝난 겔을 즉시 넣은 후, 용기를 진탕기(shaker)에 올려놓고 가볍게 진동시키면서 20～30분 정도 염색한 후 다시 30분 정도 전기영동 완충액에 넣어 탈색시킨다.(단, 전염색법의 경우 이 조작은 불필요하며 바로 결과를 확인할 수 있다)
4.2.4. 결과 확인
화상분석기나 Trans-illuminator에 랩을 깔고, 그 위에 염색이 끝난 겔을 올려놓고 자외선을 조사한다. CCD 카메라에 의한 촬영으로 유형을 확인하며, 목적하는 위치에서 밴드(band)가 얻어졌는지를 확인한 후 결과는 화상데이터로 보존해둔다. 폴라로이드 카메라를 사용할 경우 겔의 사진을 촬영하여 보관한다.
5. 염기서열 결정 및 분석
5.1 PCR 산물 확인
종 특이 프라이머(Species-specific primer)를 사용한 PCR 결과 산물의 생성유무 및 크기를 확인하여 종을 판별을 한다. 다만 필요시에는 PCR 산물에 대하여 염기서열을 결정하고 유전자 DB를 이용하여 종 동정을 할 수 있다. 또한, 일반 프라이머(universal primer)를 사용한 경우 PCR 산물은 염기서열 결정을 통하여 최종 동정을 실시한다.
5.2. 염기서열 분석
염기서열은 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov), Barcode of Life Systems ver 2.5(www.boldsystems.org) 등 유전자 DB를 사용하여 최종 동정을 실시한다.
예시) CO1 부위를 증폭할 수 있는 일반프라이머(LCO1490/HCO2198)를 이용하여 육류를 대상으로 PCR 후 염기서열을 결정하고 아래의 방법으로 수행한다
가) BioEdit 등의 프로그램을 이용하여 염기서열을 편집한다
Figure 112012044221561-pat00003

나) Blastn 등의 프로그램을 이용하여 염기서열을 입력한다
Figure 112012044221561-pat00004

다) 입력된 자료는 DB내의 염기서열 자료와 비교분석한다
Figure 112012044221561-pat00005

라) 염기서열을 분석하여 가장 근접한 종과의 일치도를 확인하고 동정을 실시한다. 동정 일치도는 일반적으로 97% 이상 되었을 경우에 동일 종으로 판단한다[본 데이터는 소고기(학명 : Bos taurus)로 판명됨]
Figure 112012044221561-pat00006

제2절 종 특이 프라이머를 이용한 개별 식품원료의 진위여부 판별법
1. 대상식품 선정 및 시험법 개발 흐름도
1) 대상식품 선정
본 연구에서는 국내외 식품관련 정보, 언론매체, 식약청 위해사범중앙조사단 등으로부터 가짜식품 제조유통사례 가능성이 높은 품목을 우선선정 하였다. 세부적으로는 육류 10종(소, 돼지, 염소, 사슴, 양, 말, 닭, 오리, 칠면조 및 타조), 근채류 4종(인삼, 마, 더덕 및 도라지), 곡류 3종(쌀, 밀 및 메밀), 기타 4종(마늘, 양파, 무, 틸라피아) 등 총 21종이며, 표 - 12에 요약하였다.
하기 표 - 12는 본 연구에서 사용된 식품원료 목록에 관한 것이다.
순번 종류 학명)
1 식육
(가축류 및 가금류)		 소(Bos taurus)
2 돼지(Sus scrofa)
3 염소(Capra hircus)
4 사슴(Cervus elaphus , Cervus nippon)
5 양(Ovis aries)
6 말(Equus caballus)
7 닭(Gallus gallus)
8 오리(Anas platyrhynchos)
9 칠면조(Meleagris gallopago)
10 타조(Struthio camelus)
11 근채류 인삼(Panax schinseng)
12 마(Dioscorea batatas)
13 더덕(Nopsis lanceolata)
14 도라지(Platycodon grandiflorum)
15 곡류 쌀(Oryza sativa)
16 밀(Triticum aestivum)
17 메밀(Fagopyrum esculentum)
18 기타 양파(Allium cepa)
19 마늘(Allium sativum)
20 무(Raphanus sativus L.)
21 틸라피아(Oreochromis niloticus)
2) 대상식품 구입
검체로 사용된 소고기, 돼지고기, 닭고기, 오리고기, 인삼, 마, 더덕, 도라지, 쌀, 밀, 메밀, 양파, 마늘은 대형마트에서 염소고기, 양고기, 말고기, 칠면조고기, 타조고기는 사육농장에 의뢰하여 가공되지 않은 상태의 축산물 형태로, 사슴은 녹각형태로, 틸라피아는 양식장에서 구매하여 사용하였다. 가공식품인 축산물가공품 및 복합조미식품 등은 대형마트에서 구매하였다.
3) 시험법 개발 흐름도
종 특이 프라이머(specise-specific primer)를 설계하기 위하여 GeneBank에서 미토콘드리아, 엽록체 등의 염기서열을 확보하고 비교분석을 통하여 일차적으로 프라이머를 제작한다. 제작된 프라이머를 이용하여 식품원료에 대하여 일부의 유전자를 증폭시킨다. 증폭된 유전자는 염기서열을 결정하고 등록되어있는 동종 또는 유사종에 대한 염기서열과 비교분석한다. 분석결과 종 특이로 활용가능성이 있으면 유사종을 대상으로 유전자증폭을 실험적으로 실시하여 최종적으로 종 특이 프라이머로 확정한다, 유사종의 경우 별도로 집단을 구성하여 총 21종의 특이적 프라이머를 제작하였다. 전체적인 흐름도는 아래 그림에 명시하였다(그림 - 1).
Figure 112012044221561-pat00007

그림 - 1. 종 특이 프라이머 제작을 위한 흐름도
2. 프라이머 설계
1) 식육(소, 돼지, 양, 염소, 사슴, 말, 닭, 오리, 칠면조 및 타조)
(1) Sequence 정보수집
NCBI databse(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용하여 소(Bos taurus), 돼지(Sus scrofa), 염소(Capra hircus), 사슴(Cervus elaphus, Cervus nippon), 양(Ovis aries), 말(Equus caballus), 닭(Gallus gallus), 오리(Anas platyrhynchos), 칠면조(Meleagris gallopago), 타조(Struthio camelus)의 mitochondrial DNA 서열의 정보를 수집하였다. 지금까지 알려진 서열자료에서 등록된 것 중 많은 비중을 차지하는 것은 단연 16s ribosomal RNA gene, cytB (cytochrome b), CO1(cytochrome oxidase subunit 1), CO2(cytochrome oxidase subunit 2) 정도이며, 그 중 보존된 지역과 변화된 지역을 모두 찾을 수 있는 부위가 12s~16s ribosomal RNA gene 지역이다. 또한 12s와 16s ribosomal RNA gene 부위는 종별 특이도 조사하는데 많이 이용되고 있어서 이 지역에서 primer를 설계하였다.
(2) 종 특이적인 primer 개발
본 연구에서 유전자 검사법에 이용되는 축산물 6종과 가금류 4종의 동물에서 미토콘드리아내의 12s 부터 16s ribosomal RNA gene 지역에서 종간의 특이성을 확인 하였다. 그림 - 2는 10종의 미토콘드리아 내의 12s부터 16s ribosomal RNA gene의 염기서열을 비교 분석한 그림이다. 그림 -2와 같이 굵고, 밑줄로 표기된 지역이 본 연구에서 개발된 종간 특이 프라이머의 위치를 표기한 결과이다. 그림에서 F는 정방향 프라이머 위치를 표지하고, R은 역방향 프라이머 위치를 표지한다. 또한 그림 내의 숫자는 각 동물마다 이용되는 프라이머를 표지한 것이다.
종 특이적 프라이머 제작에는 다음과 같은 방법을 기초로 하여 제작 하였으며, PCR 반응의 정확성과 반응성을 증가시키기 위해 소, 돼지 그리고 염소는 인위적으로 염기서열을 바꾸어서 제작하였다. 아래의 개발조건을 최대한 만족시킬 수 있도록 하였으며, 아래의 사항에서 벗어나는 경우 프라이머의 결합 온도 값을 최우선적으로 고려하여 종 특이적 프라이머를 제작하였다.
※ 종 특이프라이머 개발 조건
① 각 프라이머의 길이는 18~30 뉴클레로타이드로 설정하였다.
② 최적의 annealing 온도는 60 ℃ 내외로 설정하였다.
③ GC:AT의 비율은 50:50으로 가능한 설정하였으며, GC의 비율이 40~65 %가 되게 제작하였다.
④ 내부에 secondary structure를 갖지 않게 하였다.
⑤ PCR 반응에서 non-specific 반응이 생기지 않도록 제작하였다.
⑥ PCR 산물의 크기는 100~300bp가 되도록 하였다.
⑦ primer의 이론적인 평가와 실험적인 평가 진행
110 120 130 140 150
HM045018 AACTCTTAAT AAACTTACAC ATGCAAGCAT CTACACCCCA GTGAG-AATG
GU147934 AATTCTTAAT AAAATTACAC ATGCAAGTAT CCGCGCCCCG GTGAG-AATG
EU939445 AGTTATTAAT AGAATTACAC ATGCAAGTAT CCGCACCCCA GTGAG-AATG
GU068049 AACTCTCAAC AGACTTACAC ATGCAAGCAT CCACGCCCCG GTGAGTAACG
HM236175 AACTTTCAAT AGACTTATAC ATGCAAGCAT CCACGCCCCG GTGAGTAACG
NC_013834 GACCCTTAAT AGACTTACAC ATGCAAGCAT CCACACCCCA GTGAA-AATG
NC_007704 AACCCTTAAT AAACTTACAC ATGCAAGCAT CCGCACCCCG GTGAA-AATG
EF153719 GATTTTTGCT AAACATATAC ATGCAAGTAT CCGCATGCCA GTGAA-AA TG ⑦F
NC_002785 AATTTTCGCT AGACATATAC ATGCAAGTAT CCGCACCCCA GTGTA-AATG
AY235571 GGTTTTTGCT AGACATATAC ATGCAAGTAT CCGCATCCCA GTGAA-AATG
EU009397 GGTTTTTGCT AGACATATAC ATGCAAGTAT CCGCGCCCCA GTGTA-AATG
160 170 180 190 200
HM045018 CCCTCTAGGT TA-T----TA AAACTAAGAG GAGCTGGCA- -TCAAGCACA
GU147934 CCCTCCAGAT CCTA-----A AGATCAAAAG GAGCAGGTA- -TCAAGCACA
EU939445 CCCTCTAAAT CGCGTCTCTA CGATTAAAAG GAGCAGGTA- -TCAAGCACA
GU068049 CCCTCCAAAT CA-A----TA AGACTAAGAG GAGCAGTTGG TTCAAGCACA
HM236175 CCCTTCGAAT CACA----CA GGACTAAAAG GAGCAGGTA- -TCAAGCACA
NC_013834 CCCTCCAAGT TAAC----TA AGACTAAGAG GAGCGGGTA- - TCAAGCACA ⑥F
NC_007704 CCCTCCAAGT TAA-----TA AGACTAAGAG GAGCTGGTA- - TCAAGCACA ⑥F
EF153719 CCCT - AA --C CCCTTAAGAA AAGAA TAAAG GAGCAGGTA- -TCAGGCACA⑦F
NC_002785 CCCTTAA--T GTCTCCCCAT TAGACAAAAG GAGCAGGTA- -TCAGGCACA
AY235571 CCCCCAA-AC CTTTCTTCCC AAGCAA-AAG GAGCAGGTA- -TCAGGCACA
EU009397 CCCTCAATAG CCTTCACCCC AGGCCTTAAG GAGCGGGTA- -TCAGGCACA
210 220 230 240 250
HM045018 CA-CCCT--G TAGCTCACGA CGCCTTGCTT -AACCACACC CCCACGGG-A
GU147934 CCTATAACGG TAGCTCATAA CGCCTTGCTC -AACCACACC CCCACGGG-A
EU939445 CTAGAAA--G TAGCTCATAA CACCTTGCTC -AGCCACACC CCCACGGG-A
GU068049 CA-TCTT--G TAGCTTACAA CGCCTCGCTT -AACCACACC CCTACGGG-A
HM236175 CACTCTT--G TAGCTCACAA CGCCTTGCTT -AACCACACC CCCACGGG-A
NC_013834 CA -- TCC --G TAGCTCA CGA CACCTTGCAT -AGCCACACC CCCACGGG-A⑥F
NC_007704 CA -- TCC --G TAGCTCA CGA CACCTTGCAC -AGCCACACC CCCACGGG-A⑥F
EF153719 CTCTA-AT-G TAGCCCAAGA CGCCTTGCTT GAGCCACACC CCCACGGGTA
NC_002785 CTATCTAT-G TAGCCCAAAA CGCCTTGCTT -AGCCACACC CCCACGGGTA
AY235571 CTCA-GCA-G TAGCCCAAGA CGCCTTGCTT AAGCCACACC CCCACGGGTA
EU009397 CCCAAGCA-G TAGCCCAAGA CGCCTTGCT- AAGCCACGCC CCCACGGGTA
260 270 280 290 300
HM045018 AACAGCAGTG ACAAAAATTA A-GCCATAAA CGAAAGTTTG ACTAAGTTAT
GU147934 AACAGCAGTG ATAAAAATTA A-GCCATGAA CGAAAGTTTG ACTAAGTTAT
EU939445 CACAGCAGTG ATAAAAATTA A-GCTATGAA CGAAAGTTCG ACTAAGTCAT
GU068049 GACAGCAGTG ACAAAAATTA A-GCCATAAA CGAAAGTTTG ACTAAGCCAT
HM236175 GACAGCAGTA ACAAAAATTA A-GCCATAAA CGAAAGTTTG ACTAAGCCAT
NC_013834 GACAGCAGTG ATAAAAATTA A-GCCATAAA CGAAAGTTTG ACTAAGCCAT
NC_007704 GACAGCAGTG ATAAAAATTA A-GCCATAAA CGAAAGTTTG ACTAAGCCAT
EF153719 TTCAGCAGTA ATTAACCTTA A-GCAATAAG TGTAAACTTG ACTTAGCCAT
NC_002785 CTCAGCAGTA ATTAACATTA A-GCAATAAG TGTAAACTTG ACTTAGCCAT
AY235571 CTCAGCAGTA ATTAACCTTA A-GCAATAAG TGTAAACTTG ACTTAGCCAT
EU009397 TTCAGCAGTA GTTAACATTA A-GCAATGAG TGCAAACTCG ACTTAGTCAT
310 320 330 340 350
HM045018 ATTAATTA-- -------GGG TTGGTAAATC TCGTGCCAGC CACCGCGGTC
GU147934 ATTAATTA-- -------GAG TTGGTAAATC TCGTGCCAGC CACCGCGGTC
EU939445 ATTAAATAA- -------GGG CTGGTAAATT TCGTGCCAGC CACCGCGGTC
GU068049 GTTGACCA-- -------GGG TTGGTAAATC TCGTGCCAGC CACCGCGGTC
HM236175 ATTGACTA-- -------GGG TTGGTAAATC TCGTGCCAGC CACCGCGGTC
NC_013834 ATTGATCA-- -------GGG TTGGTAAATT TCGTGCCAGC CGCCGCGGTC
NC_007704 ATTAATTA-- -------GGG TTGGTAAATT TCGTGCCAGC CACCGCGGTC
EF153719 AGCAA CTTT - ------ AGGG TTGGTAAATC TTGTGCC AGC CACCGCGGTC⑦R
NC_002785 GGCGACCCCC -----AAGGG TTGGTAAATC TTGTGCCAGC CACCGCGGTC
AY235571 AGCAACCC-- ------AGGG TTGGTAAATC TTGTGCCAGC CACCGCGGTC
EU009397 AGCAAGCCTC CACCCAAGGG TCGGTAAATC TTGTGCCAGC CACCGCGGTC
360 370 380 390 400
HM045018 ATACGATTAA CCCAAGCTAA CAGGAGTAC- ---GGCGTAA AACGTGTTAA
GU147934 ATACGATTAA CCCAAATTAA TAGATCCAC- ---GGCGTAA AGAGTGTTTA
EU939445 ATACGATTAG CCCAAATTAA TAAACCCTCC ---GGCGTAA AGCGTGTCAA
GU068049 ATACGATTAA CCCAAGCTAA CAGGAATAC- ---GGCGTAA AACGTGTTAA
HM236175 ATACGATTGA CCCAAGCTAA CAGGAGTAC- ---GGCGTAA AGCGTGTTAA
NC_013834 ATACGATTAA CCCAAGTTAA TAGGC ATAC - --- GGCGTAA AGCGTGTTAA ⑥R
NC_007704 ATACGATTAA CCCAAGTTAA TAGGC ATAC - --- GGCGTAA AGTGTGTTAA ⑥R
EF153719 ATACAAGAAA CCCAAATCAA TAG--CCATC --CGGCGTAA AGAGTGGTCA
NC_002785 ACACAAGAGA CCCAAACTAA CAG--T-AGC --CGGCGTAA AGAGTGGTAA
AY235571 ATACAAGAAA CCCAAATCAA TAG--CTACC --CGGCGTAA AGAGTGGCCA
EU009397 ATACAAGAGA CCCAAATCAA CTGTCCTACA AGCGGCGTAA AGAGTGGTAA
410 420 430 440 450
HM045018 AGCAC-CAT- --ACCA-AAT AGGGTTAAAT TCTAACTAAG CTGTAAAAAG
GU147934 AGAAA-AAAA -AACCACAAT AGAGTTAAAT TATAACTAAG CTGTAAAAAG
EU939445 AGACT-AAT- --ACCAAAAT AAAGTTAAAA CCCAGTTAAG CCGTAAAAAG
GU068049 AGCAC-TAC- --ATCA-AAT AGAGTTAAAT TCTAATTAAA CTGTAAAAAG
HM236175 AGCAT-CAT- --ACTA-AAT AGAGTTAAAT TTTAATTAAA CTGTAAAAAG
NC_013834 AG CAC-TAT- --ACCA-AAT AAAGTTAAAT TCCAATTAAG CTGTAAAAAG⑥R
NC_007704 AG CAC-TAT- --ACTA-AAT AAAGTTAAAT TCCAATTAAG CTGTAAAAAG⑥R
EF153719 CATGC-TATC TATACCAATT AAGATCAAAG TGTAACTAAG CTGTCATAAG
NC_002785 TATGT-TATC CAACCAAATT AAGACCCAAA CACAGCTAAG CTGTCACAAG
AY235571 CATGT-TATC TGCACCAGCT AAGATTAAAA TGCAACCAAG CTGTCATAAG
EU009397 GATGCCTATC CTACCTAACT AAGATCAAAA TGCAACTAAG CTGTCGCAAG
460 470 480 490 500
HM045018 C-CATGATTA AAATAAAAAT AAATGACGAA AGTGACCCTA CA--------
GU147934 C-CCTAGTTA AAATAAAA-T AACCCACGAA AGTGACTCTA AT--------
EU939445 C-TACAACCA AAGTAAAA-T AGACTACGAA AGTGACTTTA AT--------
GU068049 C-CATAATTA CAACAAAAAT AGATGACGAA AGTAACCCTA CT--------
HM236175 C-CATAATTA TAACAAAAAT AAATGACGAA AGTAACCCTA CA--------
NC_013834 C-CATAATTG CAACAAAAAT AAACAACGAA AGTAACTTTA CA--------
NC_007704 C-CATAATTG TAACAAAAAT ATATAACGAA AGTAACTTTA CA--------
EF153719 C-CCAAGATT CACCTAAGCC CAGCCTAAAA AATGATCTTA AC-TT-AACG
NC_002785 C-CCAAGATG TTCCTAAAAT CA-CCATAAA AATGGTCTTA ACACC-CACG
AY235571 C-CTAAGATC CACCTAAACC CA-AC-CCAA ATCCATCTTA GCCTC-AACG
EU009397 C-ACAAGATG CACCTAAACA CA-CCATCAA GATGATCTTA GAAACTAGCG
510 520 530 540 550
HM045018 --ATAGCCGA C-GCACTATA GCTAAGACCC AAACTGGGAT TAGATACCCC
GU147934 --AATCCTGA C-ACACGATA GCTAGGACCC AAACTGGGAT TAGATACCCC
EU939445 --ACCTCTGA CTACACGATA GCTAAGACCC AAACTGGGAT TAGATACCCC
GU068049 --GCAGCTGA T-ACACTATA GCTAAGACCC AAACTGGGAT TAGATACCCC
HM236175 --ATAGCTGA T-ACACCATA GCTAAGACCC AAACTGGGAT TAGATACCCC
NC_013834 --GCCGCTGA A-ACACGATA GCTAGGACCC AAACTGGGAT TAGATACCCC
NC_007704 --ACCGCTGA A-ACACGATA GCTAGGACCC AAACTGGGAT TAGATACCCC
EF153719 ATCAATTTAA AGCCACGAAA GCCAGGGCAC AAACTGGGAT TAGATACCCC
NC_002785 ATCAATTTCA CCCCACGAAA GCTAAGGCAC AAACTGGGAT TAGATACCCC
AY235571 ATTAATTTTA ACCCACGAAA GCTAGGACCC AAACTGGGAT TAGATACCCC
EU009397 ATTAATTTGA ACCCACGAAA GCCAGGGCCC AAACTGGGAT TAGATACCCC
560 570 580 590 600
HM045018 ACTATGCTTA GCCCTAAACA CAGATAATTA CATA-AACAA AATTATTCGC
GU147934 ACTATGCCTA GCCCTAAACC CAAATAGTTA --CATAACAA AACTATTCGC
EU939445 ACTATGCTTA GCCCTAAACT AAAATAGCTT ACCACAACAA AGCTATTCGC
GU068049 ACTATGCTTA GCCCTAAACA CAAATAATTA CAGA-AACAA AATTATTCGC
HM236175 ACTATGCTTA GCCCTAAACA CAAATAATTA TAAG-AACAA AATTATTCGC
NC_013834 ACTATGCCTA GCCTTAAACA CAAATAGTTA TGTA-AACAA AACTATTCGC
NC_007704 ACTATGCCTA GCCTTAAACA CAAATAGTTA TGCA-AACAA AACTATTCGC
EF153719 ACTATGCCTG GCCCTAAATC TTGATACTAA TAT---ACTC ACGTATCCGC
NC_002785 ACTATGCTTA GCCTTAAATC ATGATACTTA CCCC--ACCT AAGTATCCGC
AY235571 ACTATGCCTA GCCCTAAATC TAGATACCTC CCAT-CACAC ATGTATCCGC
EU009397 ACTATGCCTG GCCCTAAATC TTGATACTTA CCCT--ACCG AAGTATCCGC
610 620 630 640 650
HM045018 CAGAGTACTA CTAGCAACA- -GCTTAAAAC TCAAAGGACT TGGCGGTGCT
GU147934 CAGAGTACTA CTCGCAACT- -GCCTAAAAC TCAAAGGACT TGGCGGTGCT
EU939445 CAGAGTACTA CTAGCAACA- -GCCTAAAAC TCAAAGGACT TGGCGGTGCT
GU068049 CAGAGTACTA CCGGCAACA- -GCCCGAAAC TCAAAGGACT TGGCGGTGCT
HM236175 CAGAGTACTA CCGGCA-CA- -GCCCGAAAC TCAAAGGACT TGGCGGTGCT
NC_013834 CAGAGTACTA CCGGCAATA- -GCTTAAAAC TCAAAGGACT TGGCGGTGCT
NC_007704 CAGAGTACTA CCGGCAATA- -GCTTAAAAC TCAAAGGACT TGGCGGTGCT
EF153719 CTGAGAACTA CGAGCACAAA CGCTTAAAAC TCTAAGGACT TGGCGGTGCC
NC_002785 CCGAGAACTA CGAGCACAAA CGCTTAAAAC TCTAAGGACT TGGCGGTGCC
AY235571 CTGAGAACTA CGAGCACAAA CGCTTAAAAC TCTAAGGACT TGGCGGTGCC
EU009397 CAGAGAACTA CGAGCACAAA CGCTTAAAAC TCTAAGGACT TGGCGGTGCC
660 670 680 690 700
HM045018 TTATATCCTT CTAGAGGAGC CTGTTCTATA ATCGATAAAC CCCGATAAAC
GU147934 TCACATCCAC CTAGAGGAGC CTGTTCTATA ATCGATAAAC CCCGATAGAC
EU939445 TTACATCCCT CTAGAGGAGC CTGTTCCATA ATCGATAAAC CCCGATAAAC
GU068049 TTATACCCTT CTAGAGGAGC CTGTTCTATA ATCGATAAAC CCCGATAAAC
HM236175 TTATACCCTT CTAGAGGAGC CTGTTCTATA ATCGATAAAC CCCGATAAAC
NC_013834 TTATACCCTT CTAGAGGAGC CTGTTCTATA ATCGATAAAC CCCGATAAAC
NC_007704 TTATACCCTT CTAGAGGAGC CTGTTCTATA ATCGATAAAC CCCGATAAAC
EF153719 CTAAACCCAC CTAGAGGAGC CTGTTCTGTA ATCGATAATC CACGATCCAC
NC_002785 CTAAACCCAC CTAGAGGAGC CTGTTCTATA ATCGATAATC CACGATTCAC
AY235571 CCAAACCCAC CTAGAGGAGC CTGTTCTATA ATCGATAATC CACGATTCAC
EU009397 CTAAACCCAC CTAGAGGAGC CTGTTCTGTA ATCGATGATC CACGATCAAC
710 720 730 740 750
HM045018 CTCACCAATT CTTGCTA-AT ACAGTCTATA TACCGCCATC TTCAGCAAAC
GU147934 CTTACCAACC CTTGCCA-AT TCAGCCTATA TACCGCCATC TTCAGCAAAC
EU939445 CCCACCATCC CTTGCTA-AT TCAGCCTATA TACCGCCATC TTCAGCAAAC
GU068049 CTCACCAATC CTTGCTA-AT ACAGTCTATA TACCGCCATC TTCAGCAAAC
HM236175 CTCACCAATC CTTGCTA-AT ACAGTCTATA TACCGCCATC TTCAGCAAAC
NC_013834 CTCACCATTC CTTGCTA-CT ACAGTCTATA TACCGCCATC TTCAGCAAAC
NC_007704 CTCACCATTC CTTGCTA-AT ACAGTCTATA TACCGCCATC TTCAGCGAAC
EF153719 CCAACCACCT CTTGCCA-AC ACAGCCTACA TACCGCCGTC GCCAGCCCAC
NC_002785 CCAACCACCC CTTGCCA--T GCAGCCTACA TACCGCCGTC GCCAGCCCGC
AY235571 CCAACCACCC CTTGCCA-GC ACAGCCTACA TACCGCCGTC GCCAGCCCAC
EU009397 CCAACCGCCC CTTGCCAAGC ACAGCCTACA TACCGCCGTC GCCAGCCCAC
760 770 780 790 800
HM045018 CCT-AAAAA- GGAAAAAAAG TAAGCGTAAT TATGA-TACA TAAAAACGTT
GU147934 CCT-AAA-AA GGAACAATAG TAAGCACAAT CATAA-CACA TAAAAACGTT
EU939445 CCT-AAACAA GGTACCGAAG TAAGCACAAA TATCC-AACA TAAAAACGTT
GU068049 CCT-AAAAA- GGAACAAAAG TAAGCTCAAT CACAA-CACA TAAAGACGTT
HM236175 CCT-AAAAAA GGGACAAAAG TAAGCTCAAT AATAA-CACA TAAAGACGTT
NC_013834 CCT-AAAAA- GGTACAAAAG TAAGCACAAT CATAA-TACA TAAAAACGTT
NC_007704 CCT-AAAAA- GGTACAAAAG TAAGCACAAT CATAA-TACA TAAAGACGTT
EF153719 CTAAAATGAA AGATCAATAG TGAGCTCAAT AGTCC--CCA CTAACAAGAC
NC_002785 CTC--ATGAG AGAACAATAG CGAGCACAAT AGCCCACCCG CTAACAAGAC
AY235571 CTCTAATGAA AGAACAACAG TGAGCTCAAT AGCCC-CTCG CTAATAAGAC
EU009397 CTCGAATGAG AGCGCAACAG TGGGCGCAAC AGCAC-CCCG CTAATAAGAC
810 820 830 840 850
HM045018 AGGTCAAGGT GTAACCTATG AAATGGGAAG AAATGGGCTA CATTCTCTAC
GU147934 AGGTCAAGGT GTAGCTTATG GGTTGGAAAG AAATGGGCTA CATTTTCTAC
EU939445 AGGTCAAGGT GTAGCCCATG GGATGGAGAG AAATGGGCTA CATTTTCTAC
GU068049 AGGTCAAGGT GTAACCCATG GAATGGGAAG AAATGGGCTA CATTTTCTAC
HM236175 AGGTCAAGGT GTAACCTATG GAGTGGGAAG AAATGGGCTA CATTTTCTAC
NC_013834 AGGTCAAGGT GTAACCTATG GAACGGAAAG AAATGGGCTA CATTTTCTAA
NC_007704 AGGTCAAGGT GTAACCTATG GAACGGAAAG AAATGGGCTA CATTTTCTAA
EF153719 AGGTCAAGGT ATAGCCCATG AGGTGG-AAG AAATGGGCTA CATTTTCTA-
NC_002785 AGGTCAAGGT ATAGCATATG GAGTGG-AAG AAATGGGCTA CATTTTCTA-
AY235571 AGGTCAAGGT ATAGCCTATG GGGTGG-GAG AAATGGGCTA CATTTTCTA-
EU009397 AGGTCAAGGT ATAGCCTATG GGACGG-AAG AAATGGGCTA CATTCCCTAT
860 870 880 890 900
HM045018 AC------CA AGAGAATCAA GC---ACGAA AGTTATTATG AAACCAATAA
GU147934 -------ATA AGAATACCCA CC-ATACGAA AGTTTTTATG AAACTAAAAA
EU939445 CCTAAGAACA AGAACTTTAA CCCGGACGAA AGTCTCCATG AAACTGGAGA
GU068049 CT------TA AGAAAATTAA -T---ACGAA AGCCATTATG AAATTAATGA
HM236175 CC------AA GAAAATTTAA -T---ACGAA AGCCATTATG AAATTAATAG
NC_013834 TC------TA AGAAAATCCA AC---ACGAA AGTTATTATG AAACTAATAA
NC_007704 TC------TA AGAAAATCCA AC---ACGAA AGTTATTATG AAATTAATAA
EF153719 AC-------- ATAGAA--CA ----GACGAA AAAGGGCGTG AAACTCGCCC
NC_002785 AC-------- ATAGAATACA ----CACGAA AGAGGATATG AAA-TCATCC
AY235571 AC-------- ATAGAAC-AA -----ACGAA AAAGGACGTG AAACCCGCCC
EU009397 GC-------- ATAGGGC-AA ----CACGGA AAGAAGTATG AAACT-GCTT
910 920 930 940 950
HM045018 CC-AAAGGAG GATTTAGCAG TAAACTAAGA ATAGA----- ---GTGCTTA
GU147934 CC-AAAGGAG GATTTAGCAG TAAATCAAGA ATAGA----- ---GTGCTTG
EU939445 CT-AAAGGAG GATTTAGCAG TAAATTAAGA ATAGA----- ---GAGCTTA
GU068049 CC-AAAGGAG GATTTAGTAG TAAACTAAGA ATAGA----- ---GTGCTTA
HM236175 CC-AAAGGAG GATTTAGCAG TAAACTAAGA ATAGA----- ---GTGCTTA
NC_013834 CC-AAAGGAG GATTTAGCAG TAAACTAAGA ATAGA----- ---GTGCTTA
NC_007704 CC-AAAGGAG GATTTAGCAG TAAACTAAGA ATAGA----- ---GTGCTTA
EF153719 TTGGAAGGAG GATTTAGCAG TAAAGTAAGA CCATACTTCT CTTAAGCCTA
NC_002785 TCAGAAGGCG GATTTAGCAG TAAAATAGAA TAAGA----- ---GAGTCTA
AY235571 TTAGAAGGAG GATTTAGCAG TAAAGTGAGA TCATAC--CC CCTAAGCTCA
EU009397 CTAGAAGGAG GATTTAGCAG TAAAGCGGGA CAATA----- ---AAGCTCG
960 970 980 990 1000
HM045018 GTTGAATTAG GCCATGAAGC ACGCACACAC CGCCCGTCAC CCTCCTCAAA
GU147934 ATTGAATAAG GCCATGAAGC ACGCACACAC CGCCCGTCAC CCTCCTCAAG
EU939445 ATTGAATCAG GCCATGAAGC GCGCACACAC CGCCCGTCAC CCTCCTTAAA
GU068049 GTTGAATTAG GCCATGAAGC ACGCACACAC CGCCCGTCAC CCTCCTCAAG
HM236175 GTTGAATCAG GCCATGAAGC ACGCACACAC CGCCCGTCAC CCTCCTCAAG
NC_013834 GTTGAATTAG GCCATGAAGC ACGCACACAC CGCCCGTCAC CCTCCTCAAG
NC_007704 GTTGAACTAG GCCATGAAGC ACGCACACAC CGCCCGTCAC CCTCCTCAAG
EF153719 CTTAAAGACG GCCCTGGGGC ACGTACATAC CGCCCGTCAC CCTCCTCACA
NC_002785 TTTTAAGTCG GCTCTAGGAC ACGTACATAC CGCCCGTCAC CCTCCTCAAA
AY235571 CTTTAAGACG GCTCTGAGGC ACGTACATAC CGCCCGTCAC CCTCTTCACA
EU009397 CTTTAAGCCG GCCCTAGGGC ACGTACATAC CGCCCGTCAC CCTCCTCATA
1010 1020 1030 1040 1050
HM045018 TA-GATTCAG TGCATCTAAC CCTATTTAAA CGCAC-TAGC TACATGAGAG
GU147934 CATGTAGTAA TAAAA-ATAA CCTATATTCA ATTACACAAC CATGCAAGAA
EU939445 TATCACAAAT CATAACATAA CATAAAACCG -TGACCCAAA CATATGAAAG
GU068049 TA-AATACAA TGCACTCAAG CCTATTAACA CGCAT-CAAC TACATGAGAG
HM236175 TA-AATATGA TATACTTAAA CCTATTTACA TATAT-CAAC CACACGAGAG
NC_013834 TA-GGTACAA TACACTCAAA CTTATTTACA CGTAT-TAAT CATATGAGAG
NC_007704 TA-GGCACAG TACACTCAAA TTTATTTGCA CGTAT-TAAT CATATGAGAG
EF153719 AGCTATCAAT TTCAATAAAT A-ATAC---- CCAACCCTAG CTA--AAGAT
NC_002785 AGCTATAACA CCCCATACAT A-ATAA---- GCT-CCGCAG CTG--AAGAT
AY235571 AGCCATCAAC ATCAATAAAT ATATACT--T CCCCTCCCGG CTA--AAGAC
EU009397 AGCCA-CACC CCCACATAAT TAATAC---- CACGTAAATG CCA--AAGAT
1060 1070 1080 1090 1100
HM045018 GAGACAAGTC GTAACAAGGT AAGCATACTG GAAAGTGTGC TTGGATAAA-
GU147934 GAGACAAGTC GTAACAAGGT AAGCATACTG GAAAGTGTGC TTGGATTAC-
EU939445 GAGACAAGTC GTAACAAGGT AAGTATACCG GAAGGTGTAC TTGGATAAC-
GU068049 GAGATAAGTC GTAACAAGGT AAGCATACTG GAAAGTGTGC TTGGATAAA-
HM236175 GAGACAAGTC GTAACAAGGT AAGCATACTG GAAAGTGTGC TTGGATAAA-
NC_013834 GAGATAAGTC GTAACAAGGT AAGCATACTG GAAAGTGTGC TTGGATAAA-
NC_007704 GAGACAAGTC GTAACAAGGT AAGCATACTG GAAAGTGTGC TTGGATAAAA
EF153719 GAGGTAAGTC GTAACAAGGT AAGCGTACCG GAAGGTGCGC TTAGACTAC-
NC_002785 GAGGTAAGTC GTAACAAGGT AAGTGTACCG GAAGGTGCAC TTAGCATAT-
AY235571 GAGGCAAGTC GTAACAAGGT AAGTGTACCG GAAGGTGCAC TTAGACTAC-
EU009397 GAGGTAAGTC GTAACAAGGT AAGTGTACCG GAAGGTGTAC TTAGAATACT
1110 1120 1130 1140 1150
HM045018 -TCAAGATAT AGCTTAAA-- -C-AAAGCAT CCAGTTTACA CCTAGAAGAC
GU147934 --CAAAGCAT AGCTTAAA-- -CTAAAGCAC CTAGTTTACA CCTAGAAGAT
EU939445 --CAAAGTGT AGCTTAAA-- -C-AAAGCAT CCAGCTTACA CCTAGAAGAT
GU068049 -TCAAGATAT AGCTTAAC-- -C-AAAGCAC CTAGTTTACA CCTAGAAGAT
HM236175 -CCAAGATAT AGCTTAAT-- -T-AAAGCAT CTAGTTTACA CCTAGAAGAT
NC_013834 -TCAAGATAT AGCTTAAA-- -T-AAAGCAC CTAGTTTACG CCTAGAAGAT
NC_007704 ATCAAGATAT AGCTTAAA-- -C-AAAGCAT CTAGTTTACA CCTAGAAGAT
EF153719 --CAAGGCGT AGCTATAAAC CCTAAAGCAT TCAGCTTACA CCTGAAAGAT
NC_002785 --CAAGACGT AGCTAAAA-- CCAAAAGCAC TCAGCTTACA CCTGAGAGAT
AY235571 --CAAGGCGT AGCTATAA-C TTCAAAGCAT TCAGCTTACA CCTGAAAGAT
EU009397 --CAAGACGT AGCTATAA-C CCCAAAGCAC TCAGCTTACA CCTGAGAGAT
1160 1170 1180 1190 1200
HM045018 TTCATTC--- ATTATGAA TA TCTTGAACTA G------ ACC TAGCCCAAAG ①F
GU147934 CCCATAA--- TATATGGGTA CTTTGAACCA A------AGC TAGCTCAACA
EU939445 TTCACTC--- AAAATGAACA CTTTGAACTA A------AGC TAGCCCAA-A
GU068049 TTCACAT--- ATTATGAATA TCTTGAACTA T------ATC TAGCCCAA--
HM236175 TTCACAC--- ATTATGAGTA TCTTGAACTA T------TCC TAGCCCAAAA
NC_013834 TTCACAT--- ATCATGAATA TCTTGAACCA A------TTC TAGCCCGCAA
NC_007704 TTCATAT--- ATCATGAATA TCTTGAACTA A------TTC TAGCCCGCAA
EF153719 ACCTTTA-CA AACAAGGTCG CCTTGACTTG CTCTTCCT-C TAGCCCAACC
NC_002785 GTCTA----A CATAGGACCG TCTTGAAGCG C---- CCT -C TAGCTCATCC ⑧F
AY235571 ACCCTCAACA GACAAGGTCG CCTTGACTTG CCCCCCCT-C TAGCCCGACA
EU009397 ATCTGC--TA AACCAGGTCG TCTTGA---A GCCTTCCT-C TAGCTCAGCC
1210 1220 1230 1240 1250
HM045018 --ATA--CCC TCTCGA--CT AAACAACCAA GATAGAAT-- --------AA
GU147934 -------TAC TAAACAAATA CAAAAATACA CCAAAA-T-- --------AA
EU939445 -------CAA TAC-CTAATT CAATTACCCT TAGTCACT-- --------TA
GU068049 --TCC--CCC CCCCCA-TCT AAATTACCAA AACAGTCT-- --------AA
HM236175 CCTCC--CAC TCTCCAGTTT AAATAACTAA ATTAAT-T-- --------AA
NC_013834 -------GCC CATTCACACT AAACTATCAA TGTAATAT-- --------AA
NC_007704 -------GCC CATTCACACT AAATTATCAA TGTAACAT-- --------AA
EF153719 ACCCATACCC CATTAACCAT CAAAAACCTA CTACCCAA-- -----ATCAA
NC_002785 ACCCA ----- ------- CTT G AACAACCCA CTAAACTC-- -----AA-AA⑧F
AY235571 AACTCG-TAC CCTTAACATA AAAAACTTAC CTCCCCCT-- ------CTTA
EU009397 GCTTAAACAA CGCAAAACTA AAGAATCCCA CTAATTAAG- -----ACTTA
1260 1270 1280 1290 1300
HM045018 AACAAAACAT TTAATCCCAA TTTAAAGTAT AGGAGATAGA AAT-CTA-AG ①R
GU147934 AATAAAACAT TCACCTAAC- ATTAAAGTAT AGGAGATAGA AATTTTT-AT
EU939445 ACTAAAACAT TCACCAAACC ATTAAAGTAT AGGAGATAGA AATTTT--AA
GU068049 AACAAAACAT TTA--CCCCA ATTAAAGTAT AGGAGATAGA AATTTTA-AA
HM236175 AATAAAACAT TTA--CCCTA ATTAAAGTAT AGGAGATAGA AATTCTA-AA
NC_013834 AATAAAACAT TTATTCAACA ACAAAAGTAT AGGAGATAGA AATTTTA-A-
NC_007704 AATAAAACAT TTATTCAACA ACAAAAGTAT AGGAGATAGA AATTTTA-A-
EF153719 ACTAAAACAT TCTA-ACCTA CTCCTAGTAT AGGTGATAGA AAAGAC---C
NC_002785 ACTAAAACAT TTTC--CCTA CT--TAGTAT AGGCGATAGA AAAGTT---A
AY235571 ACCAAAACAT TATA--AATT GTCCCAGTAT AGGCGATAGA AAAGACT-AC
EU009397 ACTAAAGCAT TTT----CTA GTCCTAGTAT AGGCGATAGA AAAGAC--AC
1310 1320 1330 1340 1350
HM045018 TACGGCGCTA TAGAGAAA -- --- GTACC GC AAGGGAACGA TGAAAGAAAA①R
GU147934 CCTGACGCTA TAGAGATA-- ---GTACCGT AAGGGAAAGA TGAAAGAATA
EU939445 CTTGGCGCTA TAGAGAAA-- ---GTACCGT AAGGGAACGA TGAAAGAT--
GU068049 TATGGCGCTA TAGAGAAA-- ---GTACCGT AAGGGAATGA TGAAAGAAAA
HM236175 CACGGCGCTA TAGAGAAA-- ---GTACCGC AAGGGAATGA TGAAAGAAAA
NC_013834 TACGGCGCTA TAGAGAAA-- ---GTACCGT AAGGGAATGA TGAAAGAAAA
NC_007704 TACGGCGCTA TAGAGAAA-- ---GTACCGT AAGGGAATGA TGAAAGAAAA
EF153719 TTAGGCGCAA TAGAGACCAA CC-GTACCGT AAGGGAAAGA TGAAATAATA
NC_002785 CTTGACGCAA TAGAGATATC CTTGTACCGC AAGGGAAAGA TGAAATAATA
AY235571 CCCGGCGCAA TAGAGGCTAA CT-GTACCGC AAGGGAAAGA TGAAATAGCA
EU009397 TTAGACGCGA TAGAGACCA- ---GTACCGT AAGGGAAAGA TGAAATAATA
1360 1370 1380 1390 1400
HM045018 AAACTAA--- -AAGTATAAA AAAGCAAAGA TTACCCCTTG TACCTTTTGC
GU147934 A-AATAA--- -AAGTAAAAA AAAGCAAAGA TTACCCCTTC TACCTTTTGC
EU939445 G-CATCA--- -AAGTACTAA ACAGCAAAGC TTACCCCTTT TAC-TTTTGC
GU068049 AGAATTA--- -AAGTACAAA AAAGCAAAGA TTAACCCTTG TACCTTTTGC
HM236175 A-AATCA--- -TAGTACAAA AAAGCAAAGA TTAACCCTTG TACCTTTTGC
NC_013834 A-AATTA--- -AAGTACAAA AAAGCAAAGA TTACCCCTTG TACCTTTTGC
NC_007704 A-AATTA--- -AAGTACAAA AAAGCAAAGA TTACCTCTTG TACCTTTTGC
EF153719 GTGAAAACCA TAAGCAAAAA ATAGTAAAGA CCAACCCTTG TACCTCTTGC
NC_002785 ATGAAAACCA -AAGCAAAAA ACAGCAAAGA TCAACCCTTG TACCTTTTGC
AY235571 ATGAAAACCA TAAGCAAAAA ACAGCAAAGA CCAACCCTTG TACCTTTTGC
EU009397 GTGAAAACTA -AAGCAAGAG ACAGCAAAGA CTAACCCTTG TACCTTTTGC
1410 1420 1430 1440 1450
HM045018 ATAATGAATT AACTAGTATA AGACTTAACA AAATGAATTT TA-GCTAAGC
GU147934 ATAATGGTTT AACCAGAA-A AAATCTAACA AAGAGAACTT TA-GCTAGAT
EU939445 ATAATGATTT AACTAGAA-T AAACTTAGCA AAGAGAACTT AA-GCTAAGC
GU068049 ATAATGAATT AACGAGCAAA AAACTTAACA AAACGAATTT TA-GCTAAGT
HM236175 ATAATGAATT AACGAGCAAA AAACTTAACA AAACGAATTT TA-GCTAAGT
NC_013834 ATAATGAGTT AACTAGTA-A AAACTTAACA AAATGAATTT CA-GCTAAGT
NC_007704 ATAATGAGTT AACTAGTA-A AAACTTAACA AAATGAATTT CA-GCTAAGT
EF153719 ATCATGATTT AGCAAGAA-- CAACCAAGCA AAGCGAACTA AAAGTTTGCC
NC_002785 ATCATGATTT AGCAAGAA-- CAACCAAGCA AAAC GAATTT AA - GCTTGCC ⑧R
AY235571 ATCATGATTT AGCAAGAA-- CAACCAAGCA AAGTGAGCTA AA-GTTTGCC
EU009397 ATCATGATTT AGCAAGAA-- CAACCAAGCA AAGTGAACTG AA-GTTTGCC
1460 1470 1480 1490 1500
HM045018 AGCCCGAAAC -CAGACGAGC TACTCACAAA CAG----TTT ACCAAGAACT
GU147934 ACCCCGAAAC -CAGACGAGC TACCTATGAG CAG----TTT AAAA-GAACC
EU939445 ACCCCGAAAC -CAGACGAGC TACCTATGAA CAG----TTA CAAA-GAACC
GU068049 AACCCGAAAC -CAGACGAGC TACTCATGGG CAG----TTT ATCA-GAACC
HM236175 AACCCGAAAC -CAGACGAGC TACTTATAGA CAG----TTT ATTA-GAACC
NC_013834 ACCCCGAAAC -CAGACGAGC TACTTATGAA CAA----TTT ATCGAGAACC
NC_007704 ACCCCGAAAC -CAGACGAGC TACTTATGAA CAA----TTT ATCGAGAACC
EF153719 CTCCCGAAAC CTAAGCGAGC TACCTACGAG CAGC---TAA AATT-GAGCG
NC_002785 ATCCCG AAAC CCAAGCGAGC TACTTACAAG CAGC---TAT TATT-GAGCA⑧R
AY235571 TTCCCGAAAC CCAAGCGAGC TACTTGCGAG CAGC---TAA AATTTGAGCG
EU009397 ATCCCGAAAC CCAAGCGAGC TACTTACGAG CAGC---TA- --TTAGAGCG
1510 1520 1530 1540 1550
HM045018 AACTCATCTA TGTGGCAAAA TAGTGAGAA- GATTTGTAAG TAGAGGTGAC
GU147934 AACTCATCTA TGTGGCAAAA TAGTGAGAA- GACTTGTAGG TAGAGGTGAA
EU939445 AACTCATCTA TGTCGCAAAA TAGTGAGAA- GATTCGTAGG TAGAGGTGAA
GU068049 AACTCATCTA TGTGGCAAAA TAGTGAGAA- GACCCATAAG TAGAGGTGAC
HM236175 AACTCATCTA TGTGGCAAAA TAGTGAGAA- GATCCATAAG TAGAGGTGAC
NC_013834 AACTCATCTA TGTAGCAAAA TAGTGAGAA- GATTTGTAAG TAGAGGTGAA
NC_007704 AACTCATCTA TGTAGCAAAA TAGTGAGAA- GATTTGTAAG TAGAGGTGAA
EF153719 AACCCATCTC TGTCGCAAAA GAGTGGGAT- GACTTGTTGG TAGAGGTGAA
NC_002785 AACCCGTCTC TGTGGCAAAA GAGTGGGAA- GACTTGTCAG TAGAGGTGAA
AY235571 AACCCGTCTC TGTTGCAAAA GAGTGGGAT- GACTTGCCAG TAGAGGTGAA
EU009397 AACCCGTCTC TGTTGCAAAA GAGTGGGAT- GACTTGTCAG TAGAGGTGAA
1560 1570 1580 1590 1600
HM045018 ATGCCTAACG AGCCTGGTGA TAGCTGGTTG TCCAGAAAAT GAATCTAAGT
GU147934 AAGCCTAACG AGCCTGGTGA TAGCTGGTTG TCCGAGAA-A GAATTTTAGT
EU939445 AAGCCCAACG AGCCTGGTGA TAGCTGGTTG TCCAGAAACA GAATTTCAGT
GU068049 ATGCCTAACG AGCCTGGTGA TAGCTGGTTG TCCAGAAAAT GAATTTTAGT
HM236175 ATGCCTAACG AGCCTGGTGA TAGCTGGTTG TCCAGAAAAT GAATTTTAGT
NC_013834 ACGCCCAACG AGCCTGGTGA TAGCTGGTTG TCCAGAAAAT GAATATTAGT
NC_007704 ACGCCCAACG AGCCTGGTGA TAGCTGGTTG TCCAGAAAAT GAATATTAGT
EF153719 AAGCCAATCG AGCTAGGTGA TAGCTGGTTA CCTGCTAAAT GAATTTAAGT
NC_002785 AAGCCAACCG AGCTGGGTGA TAGCTGGTTG CCTGTGAAAA GAATCTAAGT
AY235571 AAGCCTACCG AGCTGGGTGA TAGCTGGTTA CCTGTCAAAC GAATCTAAGT
EU009397 AAGCCAACCG AGCTGGGTGA TAGCTGGTTA CCTGTGAAAT GAATCTAAGT
1610 1620 1630 1640 1650
HM045018 TCAGCTTTAA AGATACC--- --AAAAATTC AAATA----- -AACC----C
GU147934 TCAACCTTAA AAATACC--- --CCAAA-AA CCCTA----- -AATT----C
EU939445 TCAAATTTAA ATTTACC--- --TAAAA-AC TACTC----- -AATT----C
GU068049 TCAGCTTTAA AGATACC--- --AAAAATAT AAATA----- -AATT----T
HM236175 TCAGCTTTAA AGATACC--- --AAAAATAC AAATA----- -AATC----C
NC_013834 TCAGCTTTAA AAATACC--- --AAAAATAT GAACA----- -AATT----A
NC_007704 TCAGCTTTAA AAATACC--- --AAAAATAT GAACA----- -AATT----A
EF153719 TCCTCCTTAA CCCATTC--A CCAAGGACAT TCACCC---- -AACCCTGCT
NC_002785 TCACTCCTAA CTTACCC--C TCCCGG-CAT CCACT----- -AACCTTAAT
AY235571 TCCCCCTTAA CCCACCC-- C CTAAAGACAC CCACCTTTGT CAACCTTGAG⑨F
EU009397 TCTCCCTTAA TCTTCCCTAC CGGACAACA C CCAG ------ - AACC --- AC ⑩F
1660 1670 1680 1690 1700
HM045018 CACTGTAGCT TTAAAAGTTA GTCTAAAAAG GTACAGCCTT TTAGAAACGG
GU147934 CAATGTATTT TTAAGAGATA GTCTAAAAAG GTACAGCTTT TTAGAAACGG
EU939445 TAATGTAAAT TTAAATTATA ATCTAAAAAG GTACAGCTTT TTAGATACAG
GU068049 TACTGTATTT TTAAAAGTTA GTCTAAAAAG GTTCAGCCTT TTAGAAATGG
HM236175 CACTGTATCT TTAAAAGTTA GTCTAAAAAG GTACAGCCTT TTAGAAATGG
NC_013834 CAATGTATTT TTAAAAGTTA GTCTAAAAAG GTACAGCCTT TTAGAAATGG
NC_007704 TAATGTATTT TTAAAAGTTA GTCTAAAAAG GTACAGCCTT TTAGAAATGG
EF153719 CATGTTAGGG TTAAGAGCAA CTCGACGGGG GTACAGCCCC CTCGAAAAAG
NC_002785 GAGG--AAAG CTAGGAACTA TTTAAAGGAG GTACAGCTCC TTTAAAAAAG
AY235571 AACGTTGGGG TTAAGAGCAA TTCGATGGGG GTACAGCTCC ATCGAAAAAG
EU009397 AATGAGATGA TTAAG AGCTA TTTAATGGAG GTACAGCTCC ATTAAAAAAG⑩F
1710 1720 1730 1740 1750
HM045018 AT-ACAACCT TGACTAGAGA GTAAAATTTA ACACT----- ------A--C
GU147934 AT-A CAACCT TGACTAGAGA GTAAAATC TT A-ATA----- ------CTAC②F
EU939445 GT TACAACCT TCATTAGAGA GTAAGAACAA G -ATA----- ------AACC③F
GU068049 AT-A CAACCT TCACTAGAGA GTAAGACTTT ACAAC----- ------A--C④F
HM236175 GT - ACAACCT TCACTAGAGA GTAAGATC TA AAAAT----- ------A--C⑤F
NC_013834 AT-ACAACCT TAACTAGAGA GTAAATCTTA ACATT----- ------AAAC
NC_007704 AT-ACAACCT TAACTAGAGA GTAAACCCTA ACATT----- ------AAAC
EF153719 AATACAACCT CCCCCAGCGG ATAATAACAC TTTCT----- --CCACCTAT
NC_002785 AACACAACCT CCATTAGAGG GTAACCCCCC CCCCC----- --CCCTCCTC
AY235571 AACACAACCT CCTCCAGCGG ATAATAATCA CCCCT----- --CCCCGCAC
EU009397 GACACAACCT CGACTAGTGG ATAAATCTAA TCACC----- --AACCTTAC
1760 1770 1780 1790 1800
HM045018 CATAGTAGGC CTAAAAGCAG CCATCAATTA A-GAAAGCGT TAAAGCTCAA
GU147934 CATAGTAGGC CTAAAAGCAG CCATCAATTG A-GAAAGCGT TAAAGCTCAA
EU939445 CATAGTTGGC TTAAAAGCAG CCATCAATTA A-GAAAGCGT TCAAGCTCAA
GU068049 CATAGTAGGC CTAAAAGCAG CCATCAATTA A-GAAAGCGT TAAAGCTCAA
HM236175 CATAGTAGGC CTAAAAGCAG CCATCAATTA A-GAAAGCGT TAAAGCTCAA
NC_013834 CATAGTAGGC CTAAAAGCAG CCACCAATTA A-GAAAGCGT TAAAGCTCAA
NC_007704 CATAGTGGGC CTAAAAGCAG CCACCAATTA A-GAAAGCGT TAAAGCTCAA
EF153719 C---GTAGGC CCTAAAGCAG CCATCAACAA AAGAGTGCGT CAAAGCTCCA
NC_002785 CCACGTTGGC CCTAAAGCAG CCATCAACAA A-GAGTGCGT CAAAGCTCAA
AY235571 T---GTGGGC CTTCAAGCAG CCACCAACAA AAGAGTGCGT CAAAGCTCCC
EU009397 T---GTGGGC CTTAAAGCAG CCATCAACAA A-GAGTGCGT CAAAGCTCCA
1810 1820 1830 1840 1850
HM045018 CAACAAAAAT TAAATAGATT CCAACAACAA -AT--GATTA ACTCCTAGCC
GU147934 CAAATT-CAC CAACATAATC CCAAAA ACTA AT --- AACAA ACTCCTAG -C ②R
EU939445 CGACAT-ATC TATCTTAATC CCAACAATCA ACCCA AACTA ACTCCTAA -T ③R
GU068049 CAATAAAAAT AAAATTAATC CCAACAATAG TAC--AACTA ACTCCTAGAC
HM236175 CAACAATAGT ATTATTAATC CCAGCAATAA CATT - AGCCA ACTCCTAGAT ⑤R
NC_013834 CAATAA-AAT AATATTAATT CCAATAGTAA -GC--AATCA ACTCCTAA-T
NC_007704 CAATAA-AAT AATACTAATT CCAATAATAA -AC--AGTCA ACTCCTAG-T
EF153719 CCAA-TAAAA A--------T CTAG-AACCC TATT----CG ACTCCCT-CA
NC_002785 CCAAATAAAA A--------T TCAATAACAC TAT------G ACCCCCTACA
AY235571 TCATTAAAAA A--------T CTAA-AACCC TATT----TG ACTCCCT-CA
EU009397 CACTCAAAAA T-------- G CCAA - AACAA GAT ------G AATCCCT - TA ⑩R
1860 1870 1880 1890 1900
HM045018 CCAATACTGG ACTAATCTAT TATAGAATAG AAGCAATAAT GTTAATATGA
GU147934 CCAATACC GG ACTAATCTAT TGAAACATAG AAGCAATAAT GTTAATATGA②R
EU939445 CTCATACTG G ACTATTCTAT CAACACATAG AAGCAATAAT GTTAATATGA③R
GU068049 CTAATACTGG AC CACTCTAT TATTAAATAG AAGCAAT AAT GTTAATATGA④R
HM236175 TTAATACTGG ACTATTCTAT TACTAAATAG AAGCAATAAT GTTAATATGA⑤R
NC_013834 CTAATACTGG ACTAATCTAT TA-AAAATAG AAGCAATAAT GTTAATATGA
NC_007704 CTAATACTGG ACTAATCTAT TA-AAAATAG AAGCAATAAT GTTAACATGA
EF153719 CCTAAAGCAG GTTAACCTAT GAAA--ATAG AAGAATTTAT GCTAAAATGA
NC_002785 CCACTAACAG GCCAATCTAT GACC--ATAG AAGAACTTAT GCTAAAATGA
AY235571 ACCAAAGCAG GTTAACCTAT GACA--ATAG AAGAATCAAT GCTAAAATGA
EU009397 C CACAAACAG GTTAACCTAT GAAT--ATAG GAGAATTAAT GCTAAAATGA⑩R
1910 1920 1930 1940 1950
HM045018 GTAACAAGAA ---AAATTTT C-TCCTT--- ----GCATAA GTCTAAGTCA
GU147934 GTAACAAGAA ---GCCTTTC T--CCTC--- ----GCACAC GCTTACATCA
EU939445 GTAACAAGAA ---TTATTTC T--CCTT--- ----GCATAA GCTTATATCA
GU068049 GTAACAAGAA ---ATATTTT C-TCCCT--- ----GCACAA GTTTAAGTCA
HM236175 GTAACAAGAA ---ATATTTT C-TCCTC--- ----GCACAA GTTTAAGTCA
NC_013834 GTAACAAGAA ---ATAACTT C-TCCCC--- ----GCATAA GTTTAAGTCA
NC_007704 GTAACAAGAA ---ATAACTT CCTCCCC--- ----GCATAA GTTTAAGTCA
EF153719 GTAACTAGGA -----ACCCT CCTTCACA-- --CAGCGTAA ACTTACATTA
NC_002785 GTAATTAGAA -----ATTCT TCTCTAAA-- ----GCGCAA GCTTACATTA
AY235571 GTAA TCTGGA ----- ACCTA TCCTCCTA -- -- CGG CGTAA ACTTACATTA⑨R
EU009397 GTAACTTGGG GCCACACCCA CCCCTCTAG- --CGGCGCAA GCTTACATGA
그림 - 2. 가축 및 가금류에 대한 미토콘드리아 유전자 염기서열. 소(HM045018, ①), 돼지(GU147934, ②), 말(EU939445, ③), 염소(GU068049, ④), 양(HM236175, ⑤), 사슴(NC_013834, ⑥), 사슴(NC_007704, ⑥), 칠면조(EF153719, ⑦), 타조(NC_002785, ⑧), 닭(AY235571, ⑨), 오리(EU009397, ⑩)

(3) 종 특이적 프라이머의 이론적 평가 (소, 돼지, 양, 염소, 사슴, 말)
그림 - 2에서 확인된 종 특이 프라이머의 정확성을 확인하기 위해 각 동물의 동종에 해당하는 염기서열을 확보하여 그림 - 3 ～ 8까지 프라이머 제작 부위와 해당 동물의 염기서열을 비교 분석하여, 본 연구에서 개발하는 종 특이 프라이머의 이론적 평가를 하였다. 종별로 보면 소(Bos taurus)는 79개(그림 - 3), 돼지(Sus scrofa)는 70개(그림 - 4), 염소(Capra hircus)는 7개(그림 - 5), 사슴(Cervus elaphus , Cervus nippon)은 24개(그림 - 6), 양(Ovis aries)은 20개(그림 - 7), 말(Equus caballus)은 5개(그림 - 8)의 염기서열을 NCBI database를 이용하여 본 연구에서 개발된 종 특이적 프라이머의 특이성을 이론적으로 확인하였으며(프라이머 굵고, 밑줄로 표시) NCBI database에서 선택한 각각의 염기서열을 특이성 있게 제작한 프라이머 서열과 비교한 결과이다.
10 20 30 40 50
HQ184034 ACTAGACCTA GCCCAAAG AT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
HQ184033 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
HQ184032 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
HQ184031 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
HQ184030 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947021 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947020 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947019 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947018 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947017 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947016 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947015 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947014 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947013 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947012 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947011 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947010 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947009 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947008 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GU947007 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
HM045018 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
AF492351 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177870 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ATCCTCTCGA CTAAACAACT AAGATAGAAT
EU177869 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ATCCTCTCGA CTAAACAACT AAGATAGAAT
EU177868 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ATCCTCTCGA CTAAACAACT AAGATAGAAT
EU177867 ACTAAACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177866 ACTAAACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177865 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177864 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177863 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177862 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177861 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177860 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177859 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177858 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
DQ124418 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
DQ124417 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
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DQ124415 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAATC AAGATAGAAT
DQ124414 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
DQ124412 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
DQ124411 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
DQ124402 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
DQ124401 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
DQ124400 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
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DQ124376 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
AY676873 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
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AY676870 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
AY676860 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
AY676859 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
AY676855 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
FJ971088 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ATCCTCTCGA CTAAACAACT AAGATAGAAT
FJ971087 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
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FJ971084 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
FJ971082 ACTAAACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
FJ971080 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GQ129208 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
GQ129207 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
AB074968 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
AB074965 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
NC_006853 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
AY526085 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177857 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177855 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177852 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
EU177849 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
DQ124413 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
DQ124403 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ATCCTCTCGA CTAAACAACT AAGATAGAAT
DQ124397 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
DQ124396 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAAAAT
HQ184038 ACTAAACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
HQ184043 ACTAGACCTA GCCCAAAGAT ACCCTCTCGA CTAAACAACC AAGATAGAAT
60 70 80 90 100
HQ184034 AAAACAAAAC ATTTAATCCC AATTTAAAGT ATAGGAGATA GAAATCTAAG
HQ184033 AAAACAAAAC ATTTAATCCC AATTTAAAGT ATAGGAGATA GAAATCTAAG
HQ184032 AAAACAAAAC ATTTAATCCC AATTTAAAGT ATAGGAGATA GAAATCTAAG
HQ184031 AAAACAAAAC ATTTAATCCC AATTTAAAGT ATAGGAGATA GAAATCTAAG
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GU947021 AAAACAAAAC ATTTAATCCC AATTTAAAGT ATAGGAGATA GAAATCTAAG
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GU947018 AAAACAAAAC ATTTAATCCC AATTTAAAGT ATAGGAGATA GAAATCTAAG
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GU947013 AAAACAAAAC ATTTAATCCC AATTTAAAGT ATAGGAGATA GAAATCTAAG
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GU947011 AAAACAAAAC ATTTAATCCC AATTTAAAGT ATAGGAGATA GAAATCTAAG
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GU947009 AAAACAAAAC ATTTAATCCC AATTTAAAGT ATAGGAGATA GAAATCTAAG
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그림 - 3. NCBI에 등재된 소(Bos taurus)의 16s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가
소 종 특이 프라이머는 16s ribosomal RNA gene 지역을 이용하였으며, 그림 - 2에서 프라이머의 위치는 정방향 프라이머는1~18 그리고 역 방향프라이머는 100~123에 위치한다. 정방향 프라이머의 8bp는 16s 앞부분에 위치하여 그림 3에 표시되지 않았지만, 8bp 또한 서열이 모두 일치하는 것을 확인하였으며, 8bp를 포함한 PCR 증폭산물의 크기는 131 bp이다.
10 20 30 40 50
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60 70 80 90 100
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FJ236998 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
FJ236999 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
FJ237000 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
FJ237001 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
FJ237002 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
FJ237003 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
AP003428 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
GU147934 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
AF304200 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
AF304201 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
NC_014692 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
NC_012095 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
DQ334861 TCCCAAAAAC TAATAACAAA CTCCTAGCCC AATACC
그림 - 4. NCBI에 등재된 돼지(Sus scrofa)의 16s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가
돼지 종특이 프라이머의 위치는 그림 - 4에서 1~24 그리고 109~136에 위치한다. 프라이머 서열 부위가 모두 일치하는 것을 확인하였고, PCR 산물의 크기는 136 bp이다.
10 20 30 40 50
GU229278 CAACCTTCAC TAGAGAGTAA GACTTT ACAA CACCATAGTA GGCCTAAAAG
GU229279 CAACCTTCAC TAGAGAGTAA GACTTTACAA CACCATAGTA GGCCTAAAAG
GU229280 CAACCTTCAC TAGAGAGTAA GACTTTACAA CACCATAGTA GGCCTAAAAG
GU229281 CAACCTTCAC TAGAGAGTAA GACTTTACAA CACCATAGTA GGCCTAAAAG
GU068049 CAACCTTCAC TAGAGAGTAA GACTTTACAA CACCATAGTA GGCCTAAAAG
GU295658 CAACCTTCAC TAGAGAGTAA GACTTTACAA CACCATAGTA GGCCTAAAAG
NC_005044 CAACCTTCAC TAGAGAGTAA GACTTTACAA CACCATAGTA GGCCTAAAAG
60 70 80 90 100
GU229278 CAGCCATCAA TTAAGAAAGC GTTAAAGCTC AACAATAAAA ATAAAATTAA
GU229279 CAGCCATCAA TTAAGAAAGC GTTAAAGCTC AACAATAAAA ATAAAATTAA
GU229280 CAGCCATCAA TTAAGAAAGC GTTAAAGCTC AACAATAAAA ATAAAATTAA
GU229281 CAGCCATCAA TTAAGAAAGC GTTAAAGCTC AACAATAAAA ATAAAATTAA
GU068049 CAGCCATCAA TTAAGAAAGC GTTAAAGCTC AACAATAAAA ATAAAATTAA
GU295658 CAGCCATCAA TTAAGAAAGC GTTAAAGCTC AACAATAAAA ATAAAATTAA
NC_005044 CAGCCATCAA TTAAGAAAGC GTTAAAGCTC AACAATAAAA ATAAAATTAA
110 120 130 140 150
GU229278 TCCCAACAAT AGTACAACTA ACTCCTAGAC CTAATACTGG AC CACTCTAT
GU229279 TCCCAACAAT AGTACAACTA ACTCCTAGAC CTAATACTGG ACCACTCTAT
GU229280 TCCCAACAAT AGTACAACTA ACTCCTAGAC CTAATACTGG ACCACTCTAT
GU229281 TCCCAACAAT AGTACAACTA ACTCCTAGAC CTAATACTGG ACCACTCTAT
GU068049 TCCCAACAAT AGTACAACTA ACTCCTAGAC CTAATACTGG ACCACTCTAT
GU295658 TCCCAACAAT AGTACAACTA ACTCCTAGAC CTAATACTGG ACCACTCTAT
NC_005044 TCCCAACAAT AGTACAACTA ACTCCTAGAC CTAATACTGG ACCACTCTAT
160
GU229278 TATTAAATAG AAGCAAT
GU229279 TATTAAATAG AAGCAAT
GU229280 TATTAAATAG AAGCAAT
GU229281 TATTAAATAG AAGCAAT
GU068049 TATTAAATAG AAGCAAT
GU295658 TATTAAATAG AAGCAAT
NC_005044 TATTAAATAG AAGCAAT
그림 - 5. NCBI에 등재된 염소(Capra hircus)의 16s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가
염소 종특이 프라이머는 그림 - 5에서 1~26 그리고 143~167에 위치하고, PCR 산물의 크기는 167 bp이다.
10 20 30 40 50
AB245427 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CA CGACACCT TGCACAGCCA CACCCCCACG
GU457434 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCACAGCCA CACCCCCACG
GU457435 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCACAGCCA CACCCCCACG
NC_013836 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCACAGCCA CACCCCCACG
NC_013840 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCACAGCCA CACCCCCACG
AY184430 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
AY184431 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
NC_007704 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCACAGCCA CACCCCCACG
DQ153244 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCACAGCCA CACCCCCACG
DQ191145 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCACAGCCA CACCCCCACG
DQ191146 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
DQ191148 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
DQ191149 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCACAGCCA CACCCCCACG
HQ191429 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
NC_014703 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
DQ985076 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
AB210267 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
AB211429 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
AB218689 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT TACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
NC_007179 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT TACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
NC_008462 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
GU457433 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
NC_013834 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
AY184433 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
DQ191147 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
DQ191150 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
DQ191151 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
HQ191428 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
EF058308 TCAAGCACAC ATCCGTAGCT CACGACACCT TGCATAGCCA CACCCCCACG
60 70 80 90 100
AB245427 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
GU457434 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
GU457435 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
NC_013836 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
NC_013840 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
AY184430 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
AY184431 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
NC_007704 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
DQ153244 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
DQ191145 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
DQ191146 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
DQ191148 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
DQ191149 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
HQ191429 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
NC_014703 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
DQ985076 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
AB210267 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
AB211429 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
AB218689 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
NC_007179 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
NC_008462 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
GU457433 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
NC_013834 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
AY184433 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
DQ191147 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
DQ191150 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTTAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
DQ191151 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
HQ191428 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
EF058308 GGAGACAGCA GTGATAAAAA TTAAGCCATA AACGAAAGTT TGACTAAGCC
110 120 130 140 150
AB245427 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
GU457434 ATATTAATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
GU457435 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGAG GTCATACGAT
NC_013836 ATATTAATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
NC_013840 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGAG GTCATACGAT
AY184430 ATATTAATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
AY184431 ATATTAATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
NC_007704 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
DQ153244 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
DQ191145 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
DQ191146 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
DQ191148 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
DQ191149 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
HQ191429 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
NC_014703 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCACCGCG GTCATACGAT
DQ985076 ATATTAATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
AB210267 ATATTAATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
AB211429 ATATTAATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
AB218689 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
NC_007179 ATATTAATTA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
NC_008462 ATATTAATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
GU457433 ATATTGATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
NC_013834 ATATTGATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
AY184433 ATATTGATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
DQ191147 ATATTGATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
DQ191150 ATATTGATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
DQ191151 ATATTGATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
HQ191428 ATATTGATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
EF058308 ATATTAATCA GGGTTGGTAA ATTTCGTGCC AGCCGCCGCG GTCATACGAT
160 170 180 190
AB245427 TAACCCAAGT TAATAGG CAT ACGGCGTAAA GTGTGTTAAA G
GU457434 TAACCCAAGT TACAAGGCAC ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
GU457435 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GTGTGTTAAA G
NC_013836 TAACCCAAGT TACAAGGCAC ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
NC_013840 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GTGTGTTAAA G
AY184430 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
AY184431 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
NC_007704 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GTGTGTTAAA G
DQ153244 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GTGTGTTAAA G
DQ191145 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GTGTGTTAAA G
DQ191146 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
DQ191148 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
DQ191149 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GTGTGTTAAA G
HQ191429 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GTGTGTTAAA G
NC_014703 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GTGTGTTAAA G
DQ985076 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
AB210267 TAACCCGAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
AB211429 TAACCCGAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
AB218689 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
NC_007179 TAACCCAAGT TAATAGGCAC ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
NC_008462 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
GU457433 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
NC_013834 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
AY184433 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
DQ191147 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
DQ191150 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
DQ191151 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
HQ191428 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
EF058308 TAACCCAAGT TAATAGGCAT ACGGCGTAAA GCGTGTTAAA G
그림 - 6. NCBI에 등재된 사슴(Cervus elaphus , Cervus nippon)의 12s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가
사슴 종 특이프라이머는 그림 - 6에서 보여지듯 NCBI databse의 결과와 일치하는 것을 확인 하였으며, PCR 산물의 크기는 191 bp이고, 프라이머의 위치는 정방향 프라이머는 1~22 이고, 역방향 프라이머는 168~191에 위치한다.
10 20 30 40 50
NC_001941 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATC TAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236185 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236184 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236183 ATACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236182 ATACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236181 ATACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236180 ATACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236179 ATACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236178 ATACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236177 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236176 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236175 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
HM236174 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
EF490456 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
EF490455 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
EF490454 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
EF490453 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
EF490452 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
EF490451 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
AY858379 GTACAACCTT CACTAGAGAG TAAGATCTAA AAATACCATA GTAGGCCTAA
60 70 80 90 100
NC_001941 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236185 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236184 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236183 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236182 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236181 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236180 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236179 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236178 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236177 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236176 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236175 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
HM236174 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
EF490456 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
EF490455 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
EF490454 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
EF490453 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
EF490452 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
EF490451 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
AY858379 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTAAAG CTCAACAACA ATAGTATTAT
110 120 130 140
NC_001941 TAATCCCAGC AATAA CATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236185 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236184 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236183 TAATCCCAGC AATAACATTA ACCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236182 TAATCCCAGC AATAACATTA ACCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236181 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236180 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236179 TAATCCCAGC AATAACATTA ACCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236178 TAATCCCAGC AATAACATTA ACCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236177 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236176 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236175 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
HM236174 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
EF490456 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
EF490455 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
EF490454 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
EF490453 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
EF490452 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
EF490451 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
AY858379 TAATCCCAGC AATAACATTA GCCAACTCCT AGATTTAATA CTGG
그림 - 7. NCBI에 등재된 양(Ovis aries)의 16s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가
그림 - 7에서 보이듯 양 종 특이 프라이머와 NCBI databse의 염기서열과 일치하는 것을 확인 하였으며, 이때 PCR 산물의 크기는 144 bp이다. 프라이머의 위치는 정방향 프라이머는 1~27 이고, 역방향 프라이머는 116~144에 위치한다.
10 20 30 40 50
EF597512 TACAACCTTC ATTAGAGAGT AAGAACAAG A TAAACCCATA GTTGGCTTAA
AY584828 TACAACCTTC ATTAGAGAGT AAGAACAAGA TAAACCCATA GTTGGCTTAA
EF597513 TACAACCTTC ATTAGAGAGT AAGAACAAGA TAAACCCATA GTTGGCTTAA
NC_001640 TACAACCTTC ATTAGAGAGT AAGAACAAGA TAAACCCATA GTTGGCTTAA
EU939445 TACAACCTTC ATTAGAGAGT AAGAACAAGA TAAACCCATA GTTGGCTTAA
60 70 80 90 100
EF597512 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTCAAG CTCAACGACA CATCTATCTT
AY584828 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTCAAG CTCAACGACA CATCTATCTT
EF597513 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTCAAG CTCAACGACA CATCTATCTT
NC_001640 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTCAAG CTCAACGACA CATCTATCTT
EU939445 AAGCAGCCAT CAATTAAGAA AGCGTTCAAG CTCAACGACA TATCTATCTT
110 120 130 140
EF597512 AATCCCAACA ATCAA CCCAA ACTAACTCCT AATCTCATAC TG
AY584828 AATCCCAACA ATCAACCCAA ACTAACTCCT AATCTCATAC TG
EF597513 AATCCCAACA ATCAACCCAA ACTAACTCCT AATCTCATAC TG
NC_001640 AATCCCAACA ATCAACCCAA ACTAACTCCT AATCTCATAC TG
EU939445 AATCCCAACA ATCAACCCAA ACTAACTCCT AATCTCATAC TG
그림 - 8. NCBI에 등재된 말(Equus caballus)의 16s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가
말 종 특이적 프라이머와 비교한 결과 그림 - 8에 나타내었고, 프라이머는 1~29 그리고 116~142에 위치하고, PCR 산물의 크기는 142 bp이다.
제작된 6종의 축산물의 종 특이적 프라이머는 NCBI database의 염기서열과 차이가 없음을 그림 - 3 ～ 8에서 확인 하였고, 그림 - 2에서 제시된 것과 같이 타 종과의 종 특이성을 확인하였다. 각 그림에서 굵고, 밑줄로 표시된 부분과 표 - 13은 그림 - 2와 그림 - 3부터 그림 - 8까지의 이론적 평가를 실시하여 제작된 각 동물의 종 특이적인 프라이머의 염기서열을 나타낸 것이다. 표 - 12에서 소, 돼지, 염소의 정방향 프라이머에 굵고, 밑줄로 표시된 염기서열이 그림 - 3 ～ 그림 - 5의 염기서열과 다른 이유는 종 특이도와 반응성 향상을 위해 변경된 프라이머이다.
하기 표 - 13는 식육 6종에 대하여 개발된 종 특이 프라이머 정보에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 서열 정보 길이
(mer)		 PCR 산물 크기(bp) 비고
소 SFI11-Cow-F TAT CTT GAA CTA GAC CTA GCC CAA TG 26 131 16s
SFI11-Cow-R GGT ACT TTC TCT ATA GCG CCG TAC 24
돼지 SFI11-Pig-F CAA CCT TGA CTA GAG AGT AAA ACC 24 136 16s
SFI11-Pig-R GGT ATT GGG CTA GGA GTT TGT TAT TAG T 28
염소 SFI11-Goa-F CAA CCT TCA CTA GAG AGT AAG ACT CT 26 167 16s
SFI11-Goa-R ATT GCT TCT ATT TAA TAA TAG AGC G 25
사슴 SFI11-Dee-F TCA AGC ACA CAT CCG TAG CTC A 22 191 12s
SFI11-Dee-R CTT TAA CAC ACT TTA CGC CGT ATG 24
양 SFI11-Lam-F GTA CAA CCT TCA CTA GAG AGT AAG ATC 27 144 16s
SFI11-Lam-R CCA GTA TTA AAT CTA GGA GTT GGC TAA TG 29
말 SFI11-Hor-F TAC AAC CTT CAT TAG AGA GTA AGA ACA AG 29 142 16s
SFI11-Hor-R CAG TAT GAG ATT AGG AGT TAG TTT GGG 27
(4) 종 특이적 프라이머의 이론적 평가 (닭, 오리, 칠면조, 타조)
제작한 종 특이적 프라이머가 정확성을 확인하기 위하여 NCBI database에 있는 염기서열들을 이용하여 그림 - 9에서 그림 - 12까지 비교 분석하였다. 이때 사용된 염기서열은 각 동물별로 다음과 같이 사용하였다. 닭(Gallus gallus)은 4개(그림 - 9, 닭), 오리(Anas platyrhynchos)는 4개(그림 - 10, 오리), 칠면조(Meleagris gallopago)는 3개(그림 - 11, 칠면조) 그리고 타조(Struthio camelus)는 2개(그림 - 12, 타조)와 같은 염기서열을 이용하여 제작된 프라이머의 이론적 평가를 비교하였다(프라이머 굵고, 밑줄로 표시).
닭 종 특이적 프라이머는 그림 - 9에 나타내었으며, 프라이머의 위치는 1~21 그리고 261~282에 위치한다. 프라이머 염기서열 부위와 database의 결과가 모두 일치하는 것을 확인하였으며, PCR 산물의 크기는 281 bp이다. 오리 종 특이적 프라이머는 그림 - 10에 나타내었고, 프라이머는 1~26 그리고 162~185에 위치하며, PCR 산물의 크기는 185 bp이다. 칠면조 종 특이적 프라이머는 그림 - 11에 나타내었고, 프라이머는 1~24 그리고 150~174이며, PCR 산물의 크기는 174 bp이다. 타조 종 특이적 프라이머는 그림 - 12에 나타내었고, 프라이머는 1~23 그리고 219~239이고, PCR 산물의 크기는 239 bp이다.
10 20 30 40 50
GU261718 CCTAAAGACA CCCACCTTTG T CAACCTTGA GAACGTTGGG GTTAAGAGCA
GU261719 CCTAAAGACA CCCACCTTTG TCAACCTTGA GAACGTTGGG GTTAAGAGCA
GU261687 CCTAAAGACA CCCACCTTTG TCAACCTTGA GAACGTTGGG GTTAAGAGCA
GU261692 CCTAAAGACA CCCACCTTTG TCAACCTTGA GAACGTTGGG GTTAAGAGCA
60 70 80 90 100
GU261718 ATTCGATGGG GGTACAGCTC CATCGAAAAA GAACACAACC TCCTCCAGCG
GU261719 ATTCGATGGG GGTACAGCTC CATCGAAAAA GAACACAACC TCCTCCAGCG
GU261687 ATTCGATGGG GGTACAGCTC CATCGAAAAA GAACACAACC TCCTCCAGCG
GU261692 ATTCGATGGG GGTACAGCTC CATCGAAAAA GAACACAACC TCCTCCAGCG
110 120 130 140 150
GU261718 GATAATAATC ACCCCCTCCC CGCACTGTGG GCCTTCAAGC AGCCACCAAC
GU261719 GATAATAATC ACCCC-TCCC CGCACTGTGG GCCTTCAAGC AGCCACCAAC
GU261687 GATAATAATC ACCCC-TCCC CGCACTGTGG GCCTTCAAGC AGCCACCAAC
GU261692 GATAATAATC ACCCC-TCCC CGCACTGTGG GCCTTCAAGC AGCCACCAAC
160 170 180 190 200
GU261718 AAAAGAGTGC GTCAAAGCTC CCTCATTAAA AAATCTAAAA CCCTATTTGA
GU261719 AAAAGAGTGC GTCAAAGCTC CCTCATTAAA AAATCTAAAA CCCTATTTGA
GU261687 AAAAGAGTGC GTCAAAGCTC CCTCATTAAA AAATCTAAAA CCCTATTTGA
GU261692 AAAAGAGTGC GTCAAAGCTC CCTCATTAAA AAATCTAAAA CCCTATTTGA
210 220 230 240 250
GU261718 CTCCCTCAAC CAAAGCAGGT TAACCTATGA CAATAGAAGA ATCAATGCTA
GU261719 CTCCCTCAAC CAAAGCAGGT TAACCTATGA CAATAGAAGA ATCAATGCTA
GU261687 CTCCCTCAAC CAAAGCAGGT TAACCTATGA CAATAGAAGA ATCAATGCTA
GU261692 CTCCCTCAAC CAAAGCAGGT TAACCTATGA CAATAGAAGA ATCAATGCTA
260 270 280
GU261718 AAATGAGTAA TCTGGAACCT ATCCTCCTAC GG
GU261719 AAATGAGTAA TCTGGAACCT ATCCTCCTAC GG
GU261687 AAATGAGTAA TCTGGAACCT ATCCTCCTAC GG
GU261692 AAATGAGTAA TCTGGAACCT ATCCTCCTAC GG
그림 - 9. NCBI에 등재된 닭(Gallus gallus)의 16s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가
10 20 30 40 50
EU755253 CCCAGAACCA CAATGAGATG ATTAAG AGCT ATTTAATGGA GGTACAGCTC
NC_009684 CCCAGAACCA CAATGAGATG ATTAAGAGCT ATTTAATGGA GGTACAGCTC
FJ167857 CCCAGAACCA CAATGAGATG ATTAAGAGCT ATTTAATGGA GGTACAGCTC
HM010684 CCCAGAACCA CAATGAGATG ATTAAGAGCT ATTTAATGGA GGTACAGCTC
60 70 80 90 100
EU755253 CATTAAAAAA GGACACAACC TCGACTAGTG GATAAATCTA ATCACCAACC
NC_009684 CATTAAAAAA GGACACAACC TCGACTAGTG GATAAATCTA ATCACCAACC
FJ167857 CATTAAAAAA GGACACAACC TCGACTAGTG GATAAATCTA ATCACCAACC
HM010684 CATTAAAAAA GGACACAACC TCGACTAGTG GATAAATCTA ATCACCAACC
110 120 130 140 150
EU755253 TTACTGTGGG CCTTAAAGCA GCCATCAACA AAGAGTGCGT CAAAGCTCCA
NC_009684 TTACTGTGGG CCTTAAAGCA GCCATCAACA AAGAGTGCGT CAAAGCTCCA
FJ167857 TTACTGTGGG CCTTAAAGCA GCCATCAACA AAGAGTGCGT CAAAGCTCCA
HM010684 TTACTGTGGG CCTTAAAGCA GCCATCAACA AAGAGTGCGT CAAAGCTCCA
160 170 180
EU755253 CACTCAAAAA T GCCAAAACA AGATGAATCC CTTAC
NC_009684 CACTCAAAAA TGCCAAAACA AGATGAATCC CTTAC
FJ167857 CACTCAAAAA TGCCAAAACA AGATGAATCC CTTAC
HM010684 CACTCAAAAA TGCCAAAACA AGATGAATCC CTTAC
그림 - 10. NCBI에 등재된 오리(Anas platyrhynchos.)의 16s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가
10 20 30 40 50
JF275060 TGCCCTAACC CCTTAAGAAA AGAA TAAAGG AGCAGGTATC AGGCACACTC
NC_010195 TGCCCTAACC CCTTAAGAAA AGAATAAAGG AGCAGGTATC AGGCACACTC
EF153719 TGCCCTAACC CCTTAAGAAA AGAATAAAGG AGCAGGTATC AGGCACACTC
60 70 80 90 100
JF275060 TAATGTAGCC CAAGACGCCT TGCTTGAGCC ACACCCCCAC GGGTATTCAG
NC_010195 TAATGTAGCC CAAGACGCCT TGCTTGAGCC ACACCCCCAC GGGTATTCAG
EF153719 TAATGTAGCC CAAGACGCCT TGCTTGAGCC ACACCCCCAC GGGTATTCAG
110 120 130 140 150
JF275060 CAGTAATTAA CCTTAAGCAA TAAGTGTAAA CTTGACTTAG CCATAGCAAC
NC_010195 CAGTAATTAA CCTTAAGCAA TAAGTGTAAA CTTGACTTAG CCATAGCAAC
EF153719 CAGTAATTAA CCTTAAGCAA TAAGTGTAAA CTTGACTTAG CCATAGCAAC
160 170
JF275060 TTTAGGGTTG GTAAATCTTG TGCC
NC_010195 TTTAGGGTTG GTAAATCTTG TGCC
EF153719 TTTAGGGTTG GTAAATCTTG TGCC
그림 - 11. NCBI에 등재된 칠면조(Meleagris gallopago)의 12s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가
10 20 30 40 50
Y12025 CCTCTAGCTC ATCCACCCAC TTGAACAACC CACTAAACTC AAAAACTAAA
AF338715 CCTCTAGCTC ATCCACCCAC TTGAACAACC CACTAAACTC AAAAACTAAA
NC_002785 CCTCTAGCTC ATCCACCCAC TTGAACAACC CACTAAACTC AAAAACTAAA
60 70 80 90 100
Y12025 ACATTTTCCC TACTTAGTAT AGGCGATAGA AAAGTTACTT GACGCAATAG
AF338715 ACATTTTCCC TACTTAGTAT AGGCGATAGA AAAGTTACTT GACGCAATAG
NC_002785 ACATTTTCCC TACTTAGTAT AGGCGATAGA AAAGTTACTT GACGCAATAG
110 120 130 140 150
Y12025 AGATATCCTT GTACCGCAAG GGAAAGATGA AATAATAATG AAAACCAAAG
AF338715 AGATATCCTT GTACCGCAAG GGAAAGATGA AATAATAATG AAAACCAAAG
NC_002785 AGATATCCTT GTACCGCAAG GGAAAGATGA AATAATAATG AAAACCAAAG
160 170 180 190 200
Y12025 CAAAAAACAG CAAAGATCAA CCCTTGTACC TTTTGCATCA TGATTTAGCA
AF338715 CAAAAAACAG CAAAGATCAA CCCTTGTACC TTTTGCATCA TGATTTAGCA
NC_002785 CAAAAAACAG CAAAGATCAA CCCTTGTACC TTTTGCATCA TGATTTAGCA
210 220 230
Y12025 AGAACAACCA AGCAAAAC GA ATTTAAGCTT GCCATCCCG
AF338715 AGAACAACCA AGCAAAACGA ATTTAAGCTT GCCATCCCG
NC_002785 AGAACAACCA AGCAAAACGA ATTTAAGCTT GCCATCCCG
그림 - 12. NCBI에 등재된 타조(Struthio camelus)의 16s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가
표 - 14는 그림 - 2와 그림 - 9부터 그림 - 12에서 이론적으로 개발이 완료된 종 특이적 프라이머의 염기서열을 정리한 결과이다. 그림 - 9부터 그림 - 12에서 굵고, 밑줄로 표시된 부분이 종 특이적인 프라이머의 염기서열을 나타낸 것이다. 비교된 가금류의 종 특이적 프라이머는 NCBI database의 염기서열과 일치하는 것을 확인 하였으며, 본 연구의 유전자적 분석에 이용된 4종간에 각각 종 특이성을 보이는 것을 확인하였다.
하기 표 - 14는 조류 4종에 대한 종 특이 프라이머의 정보에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 서열 정보 길이
(mer)		 PCR 산물 크기(bp) 비고
닭 SFI11-Chi-F CCT AAA GAC ACC CAC CTT TGT 21 281 16s
SFI11-Chi-R CCG TAG GAG GAT AGG TTC CAG A 22
오리 SFI11-Duc-F CCC AGA ACC ACA ATG AGA TGA TTA AG 26 185 16s
SFI11-Duc-R GTA AGG GAT TCA TCT TGT TTT GGC 24
칠면조 SFI11-Tur-F TGC CCT AAC CCC TTA AGA AAA GAA 24 174 12s
SFI11-Tur-R GGC ACA AGA TTT ACC AAC CCT AAA G 25
타조 SFI11-Ost-F CCT CTA GCT CAT CCA CCC ACT TG 23 239 16s
SFI11-Ost-R CGG GAT GGC AAG CTT AAA TTC 21
2) 곡류(쌀, 밀, 메밀)
(1) Sequence 정보수집 및 이론적 평가
쌀(Oryza sativa), 밀(Triticum aestivum), 메밀(Fagopyrum esculentum)에 관한 NCBI에 database가 부족하기 때문에 기존에 식물 동정에 일반적으로 사용하는 것으로 알려진 프라이머를 선택적으로 선발하여 본 연구의 검사법을 확립하는데 이용하였다. 그림 13 ~ 15는 곡류의 프라이머를 NCBI blast를 이용하여 검색한 결과이다. 프라이머를 빨간색으로 표시하였으며 정보가 많지 않은 것을 확인할 수 있다. 표 - 15에 표기된 프라이머들은 본 연구에서 쌀, 밀 그리고 메밀의 종 특이적 구분을 위해 개발된 프라이머이다.
10 20 30 40 50
AY360385 TGAACCCTGA GTTCCTCTCG ACACTCAAGG CTGTTGTT-G GCCCGATCTT
AC130609 TGAACCCTGA GTTCCTCTCG ACATTCAAGG CAGTTGTTTG GTCTATTCTT
60 70 80 90 100
AY360385 TCGGTGAGTT G-TGATAACT ACGATTTGGG AGAAACGTTG ACGATCCGAC
AC130609 TAGGTGAGTT GATGATAACT ATAATTTGGG AGAAACGTTG ACGATCTGAC
110 120
AY360385 TACAA CCATA CAAGACGTTG CGTTG
AC130609 TACAACCGTA CAAGACATTG CGTTG
그림 - 13. NCBI에 등재된 쌀(Oryza sativa)의 센트로미어 염기서열에 대한 이론적 평가
10 20 30 40 50
M25537 GGTTCCGAGT TCTGCGGCG G TGGCTGCCAG AGCGGTGCTT GCAGCACCGA
J02961 GGTTCCGAGT TCTGCGGCGA GGGCTGCCAG AACGGCGCTT GCAGCACCGA
M25536 GGTTCCGAGT TCTGCGGCGG CGGCTGCCAG AGCGGTGCTT GCAGCACCGA
M29280 GGCTCCGAGT TCTGCGGCGA GGGCTGCCAG GGCGGTGCTT GCAGCACCGA
60 70 80 90 100
M25537 CAAGCCGTGC GGCAAGGACG CCGGCGGCAG GGTTTGCACT AACAACTACT
J02961 CAAGCCGTGT GGCAAGGACG CCGGCGGCAG GGTTTGCACT AACAACTACT
M25536 CAAACCGTGC GGCAAGGACG CCGGCGGCAG AGTTTGCACT AACAACTACT
M29280 CAAGCCGTGC GGCAAGGCCG CCGGCGGCAA AGTTTGCACC AACAACTACT
110 120
M25537 GTTGTA GCAA GTGGGGATCC TGTGGCA
J02961 GCTGTAGCAA GTGGGGATCC TGTGGCA
M25536 GTTGTAGCAA GTGGGGATCC TGTGGCA
M29280 GCTGCAGCAA GTGGGGATCC TGTGGCA
그림 - 14. NCBI에 등재된 밀(Triticum aestivum)의 AGG 염기서열에 대한 이론적 평가
10 20 30 40 50
Buckwheat GAGCCCTCTC GTAGAGTCCG GTCCGAGGCC GGAGTTACTG AGATTTGGGA
60 70 80 90 100
Buckwheat CCATGACACC CCTGAGTTCC GATGCGCCGG ATTTGTCGCT GTCCGTGTCG
110 120 130
Buckwheat TAATTCAGCC TGGAGGC CTC TTGCTTCCTT CCTACTCC
그림 - 15. NCBI에 등재된 메밀(Fagopyrum esculentum)의 FAGAG1 염기서열에 대한 이론적 평가
하기 표 - 15는 곡류 3종에 대한 종 특이 프라이머의 정보에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 서열 정보 길이
(mer)		 PCR 산물 크기(bp) 비고
쌀 SFI11-Ric-F CAA CGC AAC GTC TTG TAT GG 20 123 centromere
SFI11-Ric-R TGA ACC CTG AGT TCC TCT CG 20
밀 SFI11-Whe-F GGT TCC GAG TTC TGC GGC G 19 220 AGG
SFI11-Whe-R TGC CAC AGG ATC CCC ACT TGC 21
메밀 SFI11-Buc-F GAG CCC TCT CGT AGA GTC CG 20 138 FAGAG1
SFI10-Buc-R GGA GTA GGA AGG AAG CAA GAG 18
3) 근채류(인삼, 마, 더덕 및 도라지)
(1) Sequence 정보수집 및 이론적 평가
인삼(Panax schinseng), 마(Dioscorea batatas), 더덕(Nopsis lanceolata), 도라지(Platycodon grandiflorum)에 관한 NCBI에 database가 부족하기 때문에 기존에 식물 동정에 일반적으로 사용하는 것으로 알려진 프라이머를 선택하여 PCR을 한 후 4종의 PCR 결과물 크기가 다르게 나오는 프라이머들을 선택한 후 염기서열 분석을 통해 종 특이적인 프라이머를 제작하였다. 그림 - 16은 인삼과 마의 psbI 유전자의 염기서열을 비교한 그림이며, 선발하여 본 연구의 검사법을 확립하는데 이용하였다. 그림 - 16은 인삼 등 근채로 4종 psbI gene의 염기서열을 비교 분석한 그림이다. 그림과 같이 굵고, 밑줄로 표기된 지역이 본 연구에서 개발된 종간 특이 프라이머의 위치를 표기한 결과이다. 그림에서 F는 정방향 프라이머 위치를 표지하고, R은 역방향 프라이머 위치를 표시하였다. 표 - 16에 표기된 프라이머들은 본 연구에서 인삼, 마, 도라지 그리고 더덕의 종 특이적 구분을 위해 확립한 프라이머이다.
10 20 30 40 50
AY582139 GATCCGGGGC GTAATCCTGG ACGTGAA--- ---GAATAAA AGGAGGTTTT
JF705513 GATCCGGGAC GTAATCCTGG GCGTGAGGAA TGAAAATAAG AGTTAGTCTT
JF705510 GATCCGGGAC GTAATCCTGG GCGTGAGGAA TGAAAATAAG AGTTAGTCTT
60 70 80 90 100
AY582139 TTGTTTTCCT TGCTTGATTT -----TTAAA TTTTCTTAGG GTTTTTT---
JF705513 TCTTTATTTT ATTTTTTTT- CGGAATTTTT TTTTCATATT ATGTATTCCC
JF705510 TCTTTATTTT ATTTTTTTT- CGGAATTTTT TTTTCATATT ATGTATTCCC
110 120 130 140 150
AY582139 ---ATCTATT CGACATGTTT AACTAAGAAA AAATAAAAGG ATTGGCG--A
JF705513 TAGATTTCCT TTTAATTCTT AGTTAAATCT AGGGATCAGG ATTTTTTTCG
JF705510 TAGATTTCCT TTTAATTCTT AGTTAAATCT AGGGATCAGG ATTTTTTTCG
160 170
AY582139 AATTTGAAAG AGAAATAAA- ---------
JF705513 AATTCAAAAC TATCAAGTGA TCATAAGCA
JF705510 AATTCAAAAC TATCAAGTGA TCATAAGCA
그림 - 16(1). NCBI에 등재된 인삼과 마의 psbI 유전자의 염기서열을 분석한 결과
10 20 30 40 50
Ginseng GATCCCGGAC GTAATCCTG G ACGTGAAGAA TAA------- ---AA-----F
Yam GATCCCGGAC GTAATCCTG G GCGGGAGGAA GGAAAATAAG AGTTAGTCTTF
Duduck ---------- ----- CCTGG ACGTGAAGAA TAAT ---- CA AC TAA-----F
Balloon fl ---------- GTAATCCTGG ACGTGAAGAA TAATA - T ATA ATTAATCAAAF
60 70 80 90 100
Ginseng ----GGAGGT TTTTT-GTTT TCCTTGCTTG ATTTTTAAAT TTTCTTAGGG
Yam TCTTTATTTT ATTTTTTTTT TTCGGAATTT TTTTTTCATA TTATCTATT-
Duduck -----AAGGT TTTTGCGTTT TTCGAGTTTT ATTTTT-AGT TT-CTTAGGA
Balloon fl TAAAAAAGGT TTTTTAGTTT TTCGAGCTTT ATTTTTTAGT TT-CTTAGGA
110 120 130 140 150
Ginseng TTTTTTATCT ATTCGACATG TTTAACTAAG AAAAAATAAA AGGATTGGCG
Yam CCCTAGATTT CCTTTTAATT CTTAGTTAAA TCTAGGGATC AGGATTTTTT
Duduck TTTTTTAGTT AT-----ACG TTTA AATAGG AAAAG ----- - GGGTTTTCT
Balloon fl TGTTTTATCT ATTTCAGACG TTTA AATAGG AAAAG ----- - GGGTTTTCT
160 170 180
Ginseng -- AAATTTGA AAGAGAAATA AA -------- --R
Yam TCGAA TTCAA AACTATCAAG TGATCATAAG CA R
Duduck -- AAATT --- ---------- ---------- --R
Balloon fl -- AAATT --- ---------- ---------- --R
그림 - 16(2). NCBI에 등재된 근채류 4종에 대한 psbI 유전자의 염기서열을 분석한 결과
하기 표 - 16은 근채류 3종에 대한 종 특이 프라이머의 정보에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 서열 정보 길이
(mer)		 PCR 산물 크기(bp) 비고
인삼 SFI11-Gin-F GAT CCC GGA CGT AAT CCT G 19 150 psbI
(photosystem II reaction center I)
SFI11-Gin-R TTT ATT TCT CTT TCA AAT TTC GCC 24
마 SFI11-Hem-F GAT CCC GGA CGT AAT CCT G 19 181 psbI
(photosystem II reaction center I)
SFI11-Hem-R TGC TTA TGA TCA CTT GAT AGT TTT GAA 27
더덕 SFI11-Deo-F CCT GGA CGT GAA GAA TAA TCA AC 23 113 psbI
(photosystem II reaction center I)
SFI10-Deo-R AAT TTA GAA AAC CCC TTT TCC TAT T 25
도라지 SFI11-Bal-F GTA ATC CTG GAC GTG AAG AAT AAT AT 26 137 psbI
(photosystem II reaction center I)
SFI11-Bal-R AAT TTA GAA AAC CCC TTT TCC TAT T 25
4) 기타(마늘, 양파 및 무)
(1) Sequence 정보수집
양파(Allium cepa), 마늘(Allium sativum), 무(Raphanus sativus L.)에 관한 NCBI에 database가 부족하기 때문에 기존에 식물 동정에 일반적으로 사용하는 것으로 알려진 프라이머를 선택적으로 선발하여 본 연구의 검사법을 확립하는데 이용하였다. 표 - 17에 표기된 프라이머들은 본 연구에서 양파, 마늘, 무의 종 특이적 구분을 위해 확립한 프라이머이다.
하기 표 - 17는 마늘 등 3종에 대한 종 특이 프라이머의 정보에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 서열 정보 길이
(mer)		 PCR 산물 크기(bp) 비고
양파 API73-F GTT TCT TGG ATG CGA TTT TG 20 280 SSR
API73-R GCA ACT GTA TAA TCA GCA TAT GC 23
마늘 GB-ASM-080-F AAT CTC CCT CCA AAG TCC C 19 180 SSR
GB-ASM-080-R CTG TAT TTT GTG TAA AGC ATC A 22
무 A137-F GGG AGA GCT ATT CCC GAC TT 20 266
및(또는)
333		 rfd
A137-R CTC CCC AAG TCC AAC CAG TA 20
5) 기타(틸라피아)
(1) Sequence 정보수집
NCBI databse(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용하여 틸라피아(Oreochromis niloticus), 옥돔(Branchiostegus japonicus) 그리고 참돔(Pagrus major)의 mitochondrial DNA 서열 정보를 수집하여 비교하였다.
(2) 종 특이적인 primer 제작
3종 어류의 complete mitochondria를 비교하였을 때 12s부터 16s ribosomal RNA gene 지역에서 종간의 특이성이 있는 것을 찾을 수 있었고, 그림 - 17에 빨간색으로 표시한 것처럼 그 지역에서 종 특이적 프라이머를 제작하였다. 종 특이적 프라이머 제작을 위해 다음과 같은 방법을 이용하였다. 표 - 18에 표기된 프라이머들은 본 연구에서 틸라피아의 종 특이적 구분을 위해 개발된 프라이머이다.
210 220 230 240 250
GU238433-1 AGCTGGTTGC CTGAGAACTG AATAGAAGTT CAGCCC TTTA AATTCTTTAC F
NC_013663 AGCTGGTTGC CTGAGAACTG AATAGAAGTT CAGCCCTTTA AATTCTTTAC
O-EU861052 AGCTGGTTGC CTGAGAAATG GATAGAAGTT CAGCCTCCCG GCTTCTCCTC
O-NC_01290 AGCTGGTTGC CTGAGAAATG GATAGAAGTT CAGCCTCCCG GCTTCTCCTC
C-AP002949 AGCTGGTTGT CTGAGAAATG GATAGAAGTT CAGCCTCACG GCTTCTTACT
C-NC_00319 AGCTGGTTGT CTGAGAAATG GATAGAAGTT CAGCCTCACG GCTTCTTACT
260 270 280 290 300
GU238433-1 CCCCATTGGC CCAAGGCCTC CA-CACCGAA CAAAAGAAAC TAAAGGAGTT
NC_013663 CCCCATTGGC CCAAGGCCTC CA-CACCGAA CAAAAGAAAC TAAAGGAGTT
O-EU861052 TCA----CCC CAAATACTTC AGACA----- TCAAAGAAAC CGAGAGCGTT
O-NC_01290 TCA----CCC CAAATACTTC AGACA----- TCAAAGAAAC CGAGAGCGTT
C-AP002949 TCAAATTTCG TATAAACCTT AATTAGATTT CTAAAGAAAC CGAGAGAGTT
C-NC_00319 TCAAATTTCG TATAAACCTT AATTAGATTT CTAAAGAAAC CGAGAGAGTT
310 320 330 340 350
GU238433-1 AGTCAAAGGG GGTACAGCCC CTTTGAAACA AGATACAACT TTCCAAGGAG
NC_013663 AGTCAAAGGG GGTACAGCCC CTTTGAAACA AGATACAACT TTCCAAGGAG
O-EU861052 AATCAAAGGA GGGACAGCCC CTTTGATACA AGACACAACT TTTACAGAAG
O-NC_01290 AATCAAAGGA GGGACAGCCC CTTTGATACA AGACACAACT TTTACAGAAG
C-AP002949 AATCTTAGGG GGTACAGCCC CTAAGATCAA GGACACAACC TTCACAGGTG
C-NC_00319 AATCTTAGGG GGTACAGCCC CTAAGATCAA GGACACAACC TTCACAGGTG
360 370 380 390 400
GU238433-1 GGTAAAGATC ACAACAAACT TAAAGGC CTA ATGT -- TCTA GTGGGCCTAA R
NC_013663 GGTAAAGATC ACAACAAACT TAAAGGCCTA ATGT--TCTA GTGGGCCTAA
O-EU861052 GCTAAAGATC ATATTCACAT TTAAAGGTAA GCATGTTCTG GTTGGCTTAA
O-NC_01290 GCTAAAGATC ATATTCACAT TTAAAGGTAA GCATGTTCTG GTTGGCTTAA
C-AP002949 GGTAAAGATC ATAATTA-AC CCAAGGTAAA GCAC--CCCG GTGGGCCTAA
C-NC_00319 GGTAAAGATC ATAATTA-AC CCAAGGTAAA GCAC--CCCG GTGGGCCTAA
410 420 430 440 450
GU238433-1 AAGCAG CCAC CTACCCAGAA AGCGTTAAAG CTCGAACATT ACATAACCAG
NC_013663 AAGCAGCCAC CTACCCAGAA AGCGTTAAAG CTCGAACATT ACATAACCAG
O-EU861052 AAGCAGCCCT CCCTACAGAA AGCGTTAAAG CTCGGGCATA CTACCCGCCT
O-NC_01290 AAGCAGCCCT CCCTACAGAA AGCGTTAAAG CTCGGGCATA CTACCCGCCT
C-AP002949 AAGCAGCCAC CCATTCAGAA AGCGTTAAAG CTCAGGTGCA C--CCAACCT
C-NC_00319 AAGCAGCCAC CCATTCAGAA AGCGTTAAAG CTCAGGTGCA C--CCAACCT
그림 - 17. NCBI에 등재된 틸라피아 등 3종에 16s rDNA 염기서열에 대한 이론적 평가. 틸라피아(GU238433-1, NC_013663), 옥돔(O-EU861052, O-NC_01290), 참돔(C-AP002949, C-NC_00319)
하기 표 - 18는 틸라피아에 대한 종 특이 프라이머의 정보에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 서열 정보 길이
(mer)		 PCR 산물 크기(bp) 비고
틸라피아 SFI11-Til-F TTT AAA TTC TTT ACC CCC ATT GGC 24 167 16s
SFI11-Til-R CTG CTT TTA GGC CCA CTA GAA CAT TAG 27
3. 식품원료별 PCR 결과
1) 식육(소, 돼지, 양, 염소, 사슴 및 말)
식육 6종에 대하여 개발한 종 특이 프라이머를 사용한 PCR 결과 소, 돼지, 염소, 양, 사슴, 말에 대하여 각각 131, 138, 168, 144, 191, 142 bp의 PCR 산물이 생성되었으며 유사종에 대하여는 교차반응에 대한 비 특이적 밴드는 나타나지 않았다(그림 - 18)
Figure 112012044221561-pat00008

그림 - 18. 종 특이 프라이머[소(A), 돼지(B), 양(C), 염소(D), 사슴(E) 및 말(F)]를 이용한 식품원료인 가축류의 검출 결과. 1 ; 소, 2 ; 돼지, 3 ; 양, 4 ; 염소, 5 ; 사슴, 6 ; 말
2) 조류(닭, 오리, 칠면조 및 타조)
조류 4종에 대하여 개발한 종 특이 프라이머를 사용한 PCR 결과 닭, 오리, 칠면조, 타조에 대하여 각각 281, 186, 174, 238bp의 PCR 산물이 생성되었으며 유사종에 대한 비 특이적 밴드는 나타나지 않았다(그림 - 19).
Figure 112012044221561-pat00009

그림 - 19. 종 특이 프라이머[닭(A), 오리(B), 칠면조(C), 타조(D)]를 이용한 식품원료인 가금류의 검출 결과. 1 ; 닭, 2 ; 오리, 3 ; 칠면조, 4 ; 타조
3) 곡류(쌀, 밀, 메밀)
곡류 3종에 대하여 개발한 종 특이 프라이머를 사용한 PCR 결과 쌀, 밀, 메밀에 대하여 각각 123, 220, 138bp의 PCR 산물이 생성되었으며 유사종에 대한 비특이적 밴드는 나타나지 않았다(그림 - 20).
Figure 112012044221561-pat00010

그림 - 20. 종 특이 프라이머[쌀(A), 밀(B), 메밀(C)]를 이용한 식품원료인 곡류의 검출 결과. 1 ; 쌀, 2 ; 밀, 3 ; 메밀
4) 근채류(인삼, 마, 더덕 및 도라지)
근채류 4종에 대하여 개발한 종 특이 프라이머를 사용한 PCR 결과 인삼, 마, 더덕, 도라지에 대하여 각각 150, 181, 113, 137bp의 PCR 산물이 생성되었으며 유사종에 대한 비 특이적 밴드는 나타나지 않았다(그림 - 21).
Figure 112012044221561-pat00011

그림 - 21. 종 특이 프라이머[인삼(A), 더덕(B), 도라지(C), 마(D)]를 이용한 식품원료인 근채류의 검출 결과. 1 ; 인삼, 2 ; 더덕, 3 ; 도라지, 4 ; 마
5) 기타(마늘, 양파, 무 및 틸라피아)
종 특이 프라이머를 사용한 PCR 결과 마늘, 양파에 대하여 각각 180, 280bp의 PCR 산물이 생성되었으며, 마늘과 양파의 혼합물(1:1)에서도 검출됨을 확인하였다. 그리고 유사종에 대한 비 특이적 밴드는 나타나지 않았다(그림 - 22 및 23).
Figure 112012044221561-pat00012

그림 - 22. 마늘 특이 프라이머를 이용한 검출 결과. 1, 2 ; 마늘, 3, 4 ; 양파, 4, 5 ; 마늘 양파 혼합물(1:1)
Figure 112012044221561-pat00013

그림 - 23. 양파 특이 프라이머를 이용한 검출 결과. 1, 2 ; 마늘, 3, 4 ; 양파, 4, 5 ; 마늘 양파 혼합물(1:1)
무 특이 프라이머를 사용한 PCR 결과 무에 대하여 266 및(또는) 333bp의 PCR 산물이 생성됨을 확인하였다. 그리고 마늘 및 양파에서는 비 특이적 밴드는 나타나지 않았다(그림 - 24).
Figure 112012044221561-pat00014

그림 - 24. 무 특이 프라이머를 이용한 검출 결과. 1 ; 마늘, 2 ; 양파, 3 ; 무
틸라피아 특이 프라이머를 사용한 PCR 결과 167bp의 PCR 산물이 생성되었으며, 옥돔, 참도미, 뱀꼬돔에 대한 비 특이적 밴드는 나타나지 않았다(그림 - 25).
Figure 112012044221561-pat00015

그림 - 25. 틸라피아 특이 프라이머를 이용한 검출 결과. 1, 2 ; 틸라피아, 3 ; 옥돔, 4 ; 참돔, 5: 뱀꼬돔, 6: 고등어
제3절 종 특이 프라이머을 이용한 가공식품의 적용
1. 가공식품별 적용성 확인
1) 식육 및 조류
(1) 소고기를 함유하는 가공식품
소고기 특이 프라이머를 사용하여 가공식품(소고기 미함유 1건 및 함유 4건)을 대상으로 하여 PCR을 수행하였다. 가공식품은 복합조미식품으로 소고기를 함유하지 않은 1건, 5% 함유 1건, 8% 1건 10% 1건, 11% 1건 등 총 5건을 대상으로 하였다. PCR 결과 소고기를 함유하지 않은 시료에서는 특이밴드가 검출되지 않았으며, 함유하는 식품에서는 모두 특이 밴드가 검출되었다.
Figure 112012044221561-pat00016

그림 - 26. 소고기 특이 프라이머를 이용한 가공식품의 적용사례. 1 : 소고기(100%), 2 : 시료 a (소고기 0%), 3 ; 시료 b (소고기 11%), 4 ; 시료 c (소고기 10%), 5 ; 시료 d (소고기 5%), 6 : 시료 e (소고기 8%)
(2) 돼지고기 및(또는) 닭고기를 함유하는 가공식품
돼지고기 특이 프라이머를 사용하여 가공식품(돼지고기 함유 1건, 돼지고기 및 닭고기 함유 4건)을 대상으로 하여 PCR을 수행하였다. 가공식품은 축산물가공품으로 돼지고기 만을 함유하는 1건, 돼지고기 및 닭고기 각 18%, 44% 함유 1건, 돼지고기 및 닭고기 각 54%, 27% 함유 1건, 돼지고기 및 닭고기 각 45%, 45% 함유 1건, 돼지고기 및 닭고기 각 71%, 10% 함유 1건 등 총 5건을 대상으로 하였다. PCR 결과 돼지고기만을 함유하는 시료에서는 돼지고기 특이밴드만이 검출되었으며, 돼지고기 및 닭고기를 모두 함유하는 식품에서는 모두 특이 밴드가 검출되었다.
Figure 112012044221561-pat00017

그림 - 27. 돼지고기(1, 3, 5, 7, 9) 및 닭고기(2, 4, 6, 8, 10) 특이 프라이머를 이용한 가공식품의 적용사례. A(돼지고기 83%), B(돼지고기 18%, 닭고기 44%), C(돼지고기 54%, 닭고기 27%), D(돼지고기 45%, 닭고기 45%), E (돼지고기 72%, 닭고기10%)
2) 곡류를 함유하는 가공식품
쌀 특이 프라이머를 사용하여 가공식품(쌀 함유 7건)을 대상으로 하여 PCR을 수행하였다. 가공식품은 떡류로 모두 쌀 99% 함유하는 7건을 대상으로 하였다. PCR 결과 쌀을 함유하는 모든 떡류에서 특이 밴드가 검출되었다.
Figure 112012044221561-pat00018

그림 - 28. 쌀 특이 프라이머를 이용한 가공식품의 적용사례. 1 : 쌀(100%), 2 : 떡류 a(쌀 99%) 3 : 떡류 b(쌀 99%) 4 : 떡류 c(쌀 99%) 5 : 떡류 d(쌀 99%) 6 : 떡류 e(쌀 99%) 7 : 떡류 f(쌀 99%) 8 : 면류 g(쌀 99%)
밀 특이 프라이머를 사용하여 가공식품(밀 함유 2건)을 대상으로 하여 PCR을 수행하였다. 가공식품은 면류 1건, 떡류 2건을 대상으로 하였다. PCR 결과 밀을 함유하는 면류 1건 및 떡류 1건(모두 주원료에 밀 표시는 되어 있으나 함량은 미표시)에서 특이 밴드가 검출되었다. 그리고 쌀99%를 함유하는 떡류에서는 특이밴드가 검출되지 않았다.
Figure 112012044221561-pat00019

그림 - 29. 밀 특이 프라이머를 이용한 가공식품의 적용사례. 1 : 시료 a(밀 함유), 2 : 시료 b(밀 함유) 3 : 시료 c(쌀 99%)
메밀 특이 프라이머를 사용하여 가공식품(메밀 33% 1건)을 대상으로 하여 PCR을 수행하였다. 가공식품은 면류 1건(메밀 33% 함유), 떡류 2건(쌀 99%함유 1건 및 밀 함유 1건)을 대상으로 하였다. PCR 결과 메밀을 함유하는 면류 1건에서 특이 밴드가 검출되었다. 그리고 쌀 99%를 함유하는 떡류 1건 및 밀을 함유하는 떡류 1건에서는 특이밴드가 검출되지 않았다.
Figure 112012044221561-pat00020

그림 - 30. 메밀 특이 프라이머를 이용한 가공식품의 적용사례. 1 : 메밀, 2 : 시료 a(메밀 70%) 3 : 시료 b(메밀 33%)
3) 근채류를 함유하는 가공식품
마 특이 프라이머를 사용하여 가공식품을 대상으로 하여 PCR을 수행하였다. 가공식품은 고형차 2건(마 1% 함유 1건, 마 2% 함유 1건)를 대상으로 하였다. PCR 결과 마를 함유하는 2건에서 모두 특이 밴드가 검출되었다.
Figure 112012044221561-pat00021
그림 - 31. 마 특이 프라이머를 이용한 가공식품의 적용사례. 1 : 마, 2 : 시료 a(마 1%) 3 : 시료 b(마 2%)
4) 마늘을 함유하는 가공식품
마늘 특이 프라이머를 사용하여 가공식품을 대상으로 하여 PCR을 수행하였다. 가공식품은 기타가공품 22건(다진마늘로 100% 마늘 함유)을 대상으로 하였다. PCR 결과 마늘을 함유하는 22건에서 모두 특이 밴드가 검출되었다.
Figure 112012044221561-pat00022

그림 - 32. 마늘 프라이머를 이용한 가공식품의 적용사례. 03 ～24 : 다진마늘(마늘 100%), + : 마늘
제4절 일반 프라이머를 이용한 개별식품원료의 진위여부 판별법
1. 프라이머 설계 및 PCR 조건
1) 동물성 식품원료
동물성 식품원료를 분석하기 위하여는 미토콘드리아에 존재하는 유전자를 주로 활용하고 있다. 본 연구에서는 미토콘드리아 유전자 중 cytochrome C oxidase subunit 1(CO1)을 증폭할 수 있는 프라이머(LCO1490/HCO2198 및 VF2/FISH R2) 와 cytochrome b 부위를 증폭하는 프라이머(L14724/H15915)에 대하여 식품원료별 조건 등을 연구하였다.
(1) LCO1490/HCO2198 프라이머를 이용한 방법
본 프라이머는 일반적으로 동물의 미토콘드리아에 존재하는 cytochrome c oxidase(COI) 에 존재하는 부위를 증폭하기위한 방법이며 1994년 Folmer 등에 의하여 개발된 것이다.
프라이머 서열에 대한 정보는 아래 표 - 19에 명시된 것과 같다. 하기 표 - 19는 COI 부위를 증폭하기 위한 프라이머 정보(Ⅰ)에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 염기서열(5`-3`) 예상 크기
(bp)		 비고
미토콘드리아
(COI)		 LCO1490 GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 종별 차이 있음 Folmer 등(1994)
HCO2198 TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA
PCR 반응을 위한 조건은 표 - 20과 같다. 하기 표 - 20는 LCO1490/HCO2198 프라이머를 이용한 방법 PCR 반응조건에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 95℃ 5분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 95℃
40℃
72℃		 1분
1분
1분		 35
최종신장(elongation) 72℃ 7분 1
보존 4℃ - - -
(2) VF2/FISH R2 프라이머를 이용한 방법
본 프라이머는 일반적으로 동물의 미토콘드리아에 존재하는 cytochrome c oxidase(COI) 에 존재하는 부위를 증폭하기위한 방법이며 2011년 Zhang에 의하여 개발된 것이다.
프라이머 서열에 대한 정보는 아래 표 - 21에 명시된 것과 같다. 하기 표 - 21은 COI 부위를 증폭하기 위한 프라이머 정보(Ⅱ)에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 염기서열(5`-3`) 예상 크기
(bp)		 비고
미토콘드리아
(COI)		 VF2 TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAA CCA ACC ACA AAG ACA TTG GCA C 종별 차이 있음 Zhang
(2011)
FISH R2 CAG GAA ACA GCT ATG ACA CTT CAG GGT GAC CGA ATC AGA A
PCR 반응을 위한 조건은 표 - 22와 같다. 하기 표 - 22은 VF2/FISH R2 프라이머를 이용한 PCR 반응 조건에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 95℃ 5분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 94℃
※℃
72℃		 1분
1분
1분		 35
최종신장(elongation) 72℃ 7분 1
보존 4℃ - - -
※ 단, 결합온도는 종에 따라 최적의 온도는 달리하였음[청어, 청대구, 명태(40℃), 대구 및 우럭(55℃), 다랑어(54℃), 양, 염소, 소, 말, 사슴, 돼지, 오리, 닭, 타조, 칠면조(50℃)]
(3) L14724/H15915 프라이머를 이용한 방법
본 프라이머는 일반적으로 동물의 미토콘드리아에 존재하는 cytochrome b(cyt b) 에 존재하는 부위를 증폭하기위한 방법이며 1991년 Inwin 등에 의하여 개발된 것이다.
프라이머 서열에 대한 정보는 아래 표 - 23에 명시된것과 같다. 하기 표 - 23은 cytochrome c 부위를 증폭하기 위한 프라이머 정보에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 염기서열(5`-3`) 예상 크기(bp) 비고
미토콘드리아
(Cyt b)		 L14724 CGA AGC TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G 1,140 Irwin 등(1991)
H15915 AAC TGC AGT CAT CTC CGG TTT ACA AGA C
PCR 반응을 위한 조건은 표 - 24와 같다. 하기 표 - 24은 L14724/H15915 프라이머를 이용한 PCR 반응 조건에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 94℃ 4분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 94℃
44℃
72℃		 45초
1분
1분30초		 35
최종신장(elongation) 72℃ 7분 1
보존 4℃ - - -
2) 식물성 식품원료
식물성 식품원료를 분석하기 위하여는 SSR(simple sequence repeat), ITS(inter transcribed sequence), 엽록체 유전자 등을 주로 활용하며 본 연구에서는 엽록체에 존재하는 유전자를 증폭하기 위한 trnH/psbA, rpoB, rbcL 프라이머(LCO1490/HCO2198를 이용하여 식품원료별 조건 등을 연구하였다.
(1) trnH/psbA 프라이머를 이용한 방법
본 프라이머는 일반적으로 식물의 엽록체에 존재하는 부위를 증폭하기위한 방법이며 2011년 Mattia 등에 의하여 개발된 것이다.
프라이머 서열에 대한 정보는 아래 표 - 25에 명시된것과 같다. 하기 표 - 25은 엽록체의 일부 유전자를 증폭하기위한 프라이머 정보(Ⅰ)에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 염기서열(5`-3`) 예상 크기
(bp)		 비고
엽록체 trnH CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC 종에 따라 차이 있음 Mattia et al.(2011)
psbA GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C
PCR 반응을 위한 조건은 표 - 26와 같다. 하기 표 - 26는 trnH/psbA 프라이머를 이용한 PCR 반응 조건에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 94℃ 7분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 94℃
53℃
72℃		 45초
30초
1분		 35
최종신장(elongation) 72℃ 7분 1
보존 4℃ - - -
(2) rpoB 프라이머를 이용한 방법
본 프라이머는 일반적으로 식물의 엽록체에 존재하는 부위를 증폭하기위한 방법이며 2011년 Mattia 등에 의하여 개발된 것이다.
프라이머 서열에 대한 정보는 아래 표 - 27에 명시된것과 같다. 하기 표 - 27은 엽록체의 일부 유전자를 증폭하기위한 프라이머 정보(Ⅱ)에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 염기서열(5`-3`) 예상 크기
(bp)		 비고
엽록체 rpoB 1f AAG TGC ATT GTT GGA ACT GG 종별 차이 있음 Mattia 등(2011)
rpoB 4r GAT CCC AGC ATC ACA ATT CC
PCR 반응을 위한 조건은 표 - 28과 같다. 하기 표 - 28은 rpoB 프라이머를 이용한 PCR 반응 조건에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 94℃ 7분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 94℃
55℃
72℃		 45초
30초
1분		 35
최종신장(elongation) 72℃ 7분 1
보존 4℃ - - -
(3) rbcL 프라이머를 이용한 방법
본 프라이머는 일반적으로 식물의 엽록체에 존재하는 부위를 증폭하기위한 방법이며 2011년 Mattia 등에 의하여 개발된 것이다.
프라이머 서열에 대한 정보는 아래 표 - 29에 명시된 것과 같다. 하기 표 - 29는 엽록체의 일부 유전자를 증폭하기위한 프라이머 정보(Ⅲ)에 관한 것이다.
구분 프라이머 명 염기서열(5`-3`) 예상 크기
(bp)		 비고
엽록체 rbcL 1F ATG TCA CCA CAA ACA GA AAC 종별 차이 있음 Mattia et al.(2011)
rbcL 724R TCG CAT GTA CCT GCA GTA GC
PCR 반응을 위한 조건은 표 - 30과 같다. 하기 표 - 30는 rbcL 프라이머를 이용한 PCR 반응 조건에 관한 것이다.
구분 온도 시간 cycle 수 비고
초기변성(Initial denaturation) 94℃ 7분 1
변성(denaturation)
결합(annealing)
신장(extension)		 94℃
48℃
72℃		 45초
30초
1분		 35
최종신장(elongation) 72℃ 7분 1
보존 4℃ - - -
2. PCR 결과
1) 동물성 식품원료
(1) LCO1490/HCO2198 프라이머
식육 10종(소, 돼지, 양, 염소, 사슴, 말, 닭, 오리, 칠면조, 타조)에 대하여 cytochrome c oxidase subunit 1(CO1) 부위를 대상으로 유전자 증폭한 결과 900bp 근처에서 특이적인 밴드를 확인할 수 있었다(그림 - 33)
Figure 112012044221561-pat00023
그림 - 33. CO1 부위를 증폭하기 위한 LCO/HCO 프라이머를 이용한 PCR 결과. 1 ; 양, 2 ; 염소, 3 ; 소, 4 ; 말, 5 ; 사슴, 6 ; 돼지, 7 ; 오리, 8 ; 닭, 9 ; 타조, 10 ; 칠면조
(2) VF2/FISH R2 프라이머
식육 10종(소, 돼지, 양, 염소, 사슴, 말, 닭, 오리, 칠면조, 타조)에 대하여 cytochrome c oxidase subunit 1(CO1) 부위를 대상으로 유전자 증폭한 결과 1,100bp 근처에서 특이적인 밴드를 확인할 수 있었다(그림 - 34)
Figure 112012044221561-pat00024
그림 - 34. CO1 부위를 증폭하기 위한 VF2/FISH R2 프라이머를 이용한 PCR 결과. 1 ; 양, 2 ; 염소, 3 ; 소, 4 ; 말, 5 ; 사슴, 6 ; 돼지, 7 ; 오리, 8 ; 닭, 9 ; 타조, 10 ; 칠면조
어류 7종(청어, 명태, 대구, 청대구, 송어, 다랑어, 우럭)에 대하여 cytochrome c oxidase subunit 1(CO1) 부위를 대상으로 유전자 증폭한 결과 1,100bp 근처에서 특이적인 밴드를 확인할 수 있었다(그림 - 35)
Figure 112012044221561-pat00025
그림 - 35. CO1 부위를 증폭하기 위한 VF2/FISH R2 프라이머를 이용한 PCR 결과. 1 ; 청어, 2 ; 명태, 3 ; 대구, 4 ; 청대구, e 5 ; 송어, 6 ; 다랑어, 7 ; 우럭
(3) L14724/H15915 프라이머
식육 6종(소, 돼지, 양, 염소, 사슴, 말)에 대하여 cytochrome b 부위를 대상으로 유전자 증폭한 결과 1,200bp 근처에서 특이적인 밴드를 확인할 수 있었다(그림 - 36)
Figure 112012044221561-pat00026
그림 - 36. Cytochrome b 부위를 증폭하기 위한 L14724/H15915 프라이머를 이용한 PCR 결과. 1 ; 양, 2 ; 염소, 3 ; 소, 4 ; 말, 5 ; 사슴, 6 ; 돼지
2) 식물성 식품원료
(1) rbcL 프라이머
식물성원료 5종(마늘, 양파, 녹차, 시금치, 무)에 대하여 엽록체 부위를 대상으로 유전자 증폭한 결과 1,100bp 근처에서 특이적인 밴드를 확인할 수 있었다(그림 - 37)
Figure 112012044221561-pat00027

그림 - 37. 엽록체의 일부 유전자를 증폭하기 위한 rbcL 프라이머를 이용한 PCR 결과. 1 ; 마늘, 2 ; 양파, 3 ; 녹차, 4 ; 시금치, 5 ; 무
(2) rpoB 프라이머
식물성원료 5종(마늘, 양파, 녹차, 시금치, 무)에 대하여 엽록체 부위를 대상으로 유전자 증폭한 결과 600bp 근처에서 특이적인 밴드를 확인할 수 있었다(그림 - 38)
Figure 112012044221561-pat00028

그림 - 38. 엽록체의 일부 유전자를 증폭하기 위한 rpoB 프라이머를 이용한 PCR 결과. 1 ; 마늘, 2 ; 양파, 3 ; 녹차, 4 ; 시금치, 5 ; 무
(3) trnH-psbA 프라이머
식물성원료 5종(마늘, 양파, 녹차, 시금치, 무)에 대하여 엽록체 부위를 대상으로 유전자 증폭한 결과 특이적인 밴드를 확인할 수 있었으며 원료별로 특이적인 밴드의 크기는 다르게 나타남을 확일할 수 있었다(그림 - 39)
Figure 112012044221561-pat00029

그림 - 39. 엽록체의 일부 유전자를 증폭하기 위한 trnH/psbA 프라이머를 이용한 PCR 결과. 1 ; 마늘, 2 ; 양파, 3 ; 녹차, 4 ; 시금치, 5 ; 무
제5절 적용사례
1. 짜장 중 육류 판별
짜장 중 함유되어있는 육류에 대하여 돼지 종 특이 프라이머(SFI11-PIG-F/SFI11-PIG-R)를 이용하여 PCR을 수행한 결과 예상되는 밴드를 확인할 수 있었다. 또한, Cyt b 증폭을 위한 L14724/H15915 프라이머, CO1 증폭을 위한 LCO1490/HCO2198 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과 특이 밴드를 확인(그림 - 40)하였으며 염기서열 결정 후 DB 분석을 통하여 돼지로 판명되었다.(그림 - 41)
Figure 112012044221561-pat00030

그림 - 40. Cytochrome b[A(프라이머 명 : L14724/H15915)] 및 CO1[C(프라이머 명 : LCO1490/HCO2198)] 부위를 증폭하기 위한 일반 프라이머 및 돼지 특이 프라이머(B)를 이용한 PCR 결과. 1 ; 쥐조직, 2 ; 소고기, 3 ; 돼지고기, 4 ; 시료(짜장)
Figure 112012044221561-pat00031

그림 - 41. cyt b 부위의 염기서열에 대하여 Blast 프로그램을 이용하여 분석한 결과 돼지(학명 : Sus scrofa )로 판명되었음
2. 홍삼제품 중 애벌레 판별
홍삼제품에서 발견된 애벌레로 추정되는 이물에 대하여 CO1 부위를 증폭하기위한 LCO1490/HCO2198 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과 특이밴드를 확인(그림 - 42)하였으며 염기서열 결정후 DB 분석을 통하여 화랑곡나방으로 판명되었다.(그림 - 43)
Figure 112012044221561-pat00032

그림 - 42. 미토콘드리아의 COI 부위를 증폭하기위한 LCO1490/HCO2198 프라이머를 이용한 PCR 결과. 1 : 소고기, 2 : 돼지고기, 3, 4 : 검체
Figure 112012044221561-pat00033

그림 - 43. COI 유전자를 증폭하여 염기서열을 분석한 결과 검체에 이물로 추정되는 물질은 화랑곡나방(Plodia interpunctella)으로 동정되었음
3. 조미김 중 소형동물 판별
조미김에서 발견된 소형동물의 다리뼈 이물에 대하여 cytochrome b 부위를 증폭하기위한 L14724/H15915 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과 특이밴드를 확인(그림 - 44)하였으며 염기서열 결정 후 DB 분석을 통하여 쥐로 판명되었다.(그림 - 45)
Figure 112012044221561-pat00034

그림 - 44. 미토콘드리아의 cytochrome b 부위를 증폭하기위한 L14724/H15915 프라이머를 이용한 PCR 결과. 1 : 쥐, 2 : 검체
Figure 112012044221561-pat00035

그림 - 45. cytochrome b 유전자를 증폭하여 염기서열을 분석한 결과 검체에 이물로 추정되는 소형동물의 뼈는 쥐(Rattus norvegicus)으로 동정되었음
이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 식품원료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    상기 DNA를 주형으로 하고, 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 제1 PCR 단계, 상기 제1 PCR 단계에서 이용한 프라이머 세트와 상이한 어느 하나의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 제2 PCR 단계, 상기 제1 및 제2 PCR 단계에서 이용한 프라이머 세트와 상이한 어느 하나의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 제3 PCR 단계, 및 상기 제1 내지 제3 PCR 단계에서 이용한 프라이머 세트와 상이한 어느 하나의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 제4 PCR 단계로 이루어진 PCR 단계; 및
    상기 각 PCR 단계에 의해 증폭된 DNA를 검출하는 것에 의해 상기 식품원료 내에 닭(Gallus gallus) 고기, 오리(Anas platyrhynchos) 고기, 칠면조(Meleagris gallopago) 고기, 및 타조(Struthio camelus) 고기로 이루어진 가금류 원료가 존재하고 있는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 식품원료 내 가금류 원료의 혼입여부를 판별하는 방법:
    (a) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 닭고기 검출용 PCR 프라이머 세트;
    (b) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 오리고기 검출용 PCR 프라이머 세트;
    (c) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 칠면조고기 검출용 PCR 프라이머 세트;
    (d) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 타조고기 검출용 PCR 프라이머 세트.
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