CN101851675A - 检测检疫性实蝇的探针组及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种利用寡核苷酸探针检测检疫性实蝇的方法。本发明要解决是现有技术无法快速、准确地确定检测性实蝇的种类的技术问题。本发明为了解决这一技术问题，提供了检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组及检测检疫性实蝇的方法。该检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组包含选自20种检疫性实蝇的至少一种特异性寡核苷酸探针序列。本发明在检疫性实蝇的检测鉴别方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种利用寡核苷酸探针检测检疫性实蝇的探针组及利用此探针组检测检疫性实蝇的方法。
背景技术
出入境植物检验检疫致力于防止植物危险性病、虫、杂草及其他有害生物入侵、定殖、传播，与农业生产安全和贸易关系密切。近年来，随着经济腾飞所带来的贸易发展以及国际交往日益频繁，随之危险性病、虫、杂草及其他有害生物传入我国的机会也大大增加；另外，植物检疫作为重要的非关税技术性壁垒措施，因此其作为国际贸易的技术壁垒的趋势日益明显。
实蝇(Fruit-fly)在植物检验检疫上具有重要的地位。在现行的《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》(1992年版)中，地中海实蝇Ceratitis capitata被列为一类检疫危险性害虫，另外按实蝇属和寡毛实蝇属的6个种类被列为二类检疫危险性害虫。正是由于实蝇是为害水果和蔬菜重要的害虫类群，其发生不仅给当地果蔬生产造成严重损失，而且还将严重影响国家间的贸易，因此备受世界各国的关注。目前，全世界已记录的实蝇种类达4000余种，是最具经济重要性的一类害虫之一，如地中海实蝇、墨西哥实蝇、加勒比实蝇、桔小实蝇和瓜实蝇等就是其中最危险的实蝇害虫种类。在我国，已经记载的实蝇有近400余种(赵又新等，1986)。实蝇害虫不但危害果蔬作物的果实，造成严重的经济损失，而且还可随果实借助运输工具远距离传播到全球可能适生的任何地方。因此，很多实蝇害虫是国际上的重要检疫性有害生物。实蝇给人类带来的问题给植物检验检疫提出了重大的挑战。在正常的国际贸易活动中，许多果品进口国所颁布、实施的植检法规，必然使得果品生产国在占领潜在的出口市场方面受到约束和限制，并迫使生产者按进口国的要求，认真执行有关果品外销前的产地检疫、灭虫处理等繁琐程序。但这些复杂的程序中，最基本的却是实蝇物种快速有效的鉴定。
当前对实蝇类昆虫的鉴别主要依据其成虫外部形态特征。但实蝇主要以幼虫随寄主果实远距离传播，从受害瓜果中截获到的实蝇多数是卵和幼虫，而多数果实蝇的卵和幼虫在形态学上无明显差别，难以进行种类鉴定。为确定所发现的卵、幼虫是否属于检疫性有害生物种类，检验检疫人员不得不采用常规生物学手段，将卵或幼虫饲养到成体，再按经典形态学方法定名。这一检疫过程耗时费力，难以满足口岸快速通关的要求。至于成虫残体，即使是有经验的分类学家也常常无能为力。此外，鉴定需要借助分类学家的知识。而在信息技术高度发展的今天，合格分类学家的缺乏已成为世界范围内的难题。由于分类学家一般终生仅研究一个类群，分类学家的减少意味着大量类群无人研究，无人能够鉴定物种。而一旦有危险外来物种因为这样的原因漏网，将对我国的进出口植物检疫造成严重影响。
随着分子生物学和信息技术的发展，分子鉴定已成为时代潮流，越来越广泛地应用于各个实践领域。采用分子生物学技术开展昆虫种类鉴定，可以解决不能通过果实蝇卵、幼虫形态特征进行种类鉴定的问题。
分子生物技术，如PCR、RAPD、PCR-RFL等技术，可以有效解决形态特征无法解决的部分问题，特别适用于外部形态相似的种类、害虫的幼期阶段或不同地理分布种群的鉴定。在植物检疫中具有广阔的应用前景。上世纪80年代以来，同工酶、染色体核型以及DNA探针等分子生物技术已经被用于多种昆虫的鉴定研究(Berlocher，1980；Drew&Hardy，1981；梁广勤等，1994；David etal.，1994)。动物mtDNA(线粒体DNA)属母系遗传，为双链闭环结构，基因序列组成相对保守，无重组和单拷贝，并易于检测。昆虫mtDNA平均进化速率是单拷贝核DNA的1一2倍，长度为15.4kb到16.3kb左右，包括12-13个编码蛋白质的基因。由于其结构和进化上的特点，mtDNA多被作为研究物种进化的重要分子标记(Vigilan et al.1991；张亚平&施立明1992；施伟&叶辉2004)。在mtDNA各基因中，Cytb基因的结构和功能研究得比较清楚(Moritz et al.，1987；Gray，1989)，因其碱基序列稳定性较高而常用于动物类群的系统进化和分类鉴定研究(Jermiin&Grozier，1994；Sheppard et al.，1996；David et al.，1998；任竹梅等，2003)。
新兴的以线粒体COI(Cytochrome oxidase I细胞色素C氧化酶亚单位I)基因序列(约500～600bp)为基础的DNA条形码技术(DNA Barcoding)在物种鉴定方面的优势已经在学术界备受关注。本领域急需建立快速、高效准确的检验性实蝇检测技术。
发明内容
本发明要解决是现有技术无法快速、准确地确定检疫危险性实蝇的种类的技术问题。本发明为了解决这一技术问题，提供了检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组。该检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组包含选自表1中的至少一种寡核苷酸探针序列，所述检疫性实蝇为：南瓜实蝇Bactrocera tau、瓜实蝇B.cucurbitae、川黑实蝇B.ater、具条实蝇B.scutellata、异颜实蝇B.diversa、桔小实蝇B.dorsalis、番茄枝果实蝇B.aquilonis、番石榴实蝇B.correcta、油橄榄实蝇B.oleae、蜜柑大实蝇B.tsuneonis、柑橘大实蝇B.minax、南美按实蝇Anastrepha fraterculus、墨西哥按实蝇A.aludens、山榄按实蝇A.Serpentina、地中海实蝇Ceratitis capitata、非洲芒果实蝇C.cosyra、非洲蜡实蝇C.Rosa、苹果绕实蝇Rhagoletis pomonella、白带绕实蝇R.cingulata或黑樱桃实蝇R.fausta中的至少一种。
表1检测检疫性实蝇的第1号寡核苷酸探针序列
| 物种名 | 序列 | Tm | GC％ | 长度 |
| 南瓜实蝇 | GCTGGTGGTGGGGATCCTATTTTATA(SEQ ID No.1) | 57.8192 | 46.15 | 26 |
| 瓜实蝇 | CTGGTGGTGGAGACCCTATT(SEQ ID No.2) | 54.7342 | 55 | 20 |
| 川黑实蝇 | GTATAGTGGAAAATGGAGCTGGGACA(SEQ ID No.3) | 58.2343 | 46.15 | 26 |
| 具条实蝇 | ACTACTGCCCCCTTCACTTACACTAC(SEQ ID No.4) | 59.3444 | 50 | 26 |
| 异颜实蝇 | TTTCATCTATTTTAGGAGCCGTA(SEQ ID No.5) | 51.2625 | 34.78 | 23 |
| 物种名 | 序列 | Tm | GC％ | 长度 |
| 南美按实蝇 | GCACTATTACTACTCTTATCATTACCAG(SEQ ID No.6) | 53.1408 | 35.71 | 28 |
| 墨西哥按实蝇 | ACAGCTCACGCGTTTGTGATAAT(SEQ ID No.7) | 57.502 | 43.48 | 23 |
| 山榄按实蝇 | GATTCGGAAATTGACTAGTTCCTTTAAT(SEQ ID No.8) | 54.0328 | 32.14 | 28 |
| 桔小实蝇 | CACTTCACTTAGCRGGTATTT(SEQ ID No.9) | 54.1294 | 39.13 | 21 |
| 番茄枝果实蝇 | TGGTTTCGGAAACTGGCTTGTT(SEQ ID No.10) | 57.3283 | 45.45 | 22 |
| 番石榴实蝇 | ACTCCACTTAGCYGGTATTTC(SEQ ID No.11) | 53.7451 | 47.62 | 21 |
| 白带绕实蝇 | ATAATGTAATTGTTACAGCTCATGC (SEQ ID No.12) | 52.2152 | 32 | 25 |
| 黑樱桃实蝇 | ACAATGTAATTGTAACAGCTCATG (SEQ ID No.13) | 52.0226 | 33.33 | 24 |
| 苹果绕实蝇 | CTCTACACTTAGCGGGGATTTCTTC (SEQ ID No.14) | 56.8407 | 48 | 25 |
| 非洲芒果实蝇 | ATAACGTAATTGTAACTGCTCATG (SEQ ID No.15) | 51.6557 | 33.33 | 24 |
| 非洲蜡实蝇 | CTCTTCACTTAGCAGGAATCTCTTCTAT(SEQ ID No.16) | 55.7944 | 39.29 | 28 |
| 地中海实蝇 | CTCTTCATTTAGCTGGAATTTCTTCTA (SEQ ID No.17) | 53.3041 | 33.33 | 27 |
| 油橄榄实蝇 | ATAATGTAATTGTAACTGCTCACG (SEQ ID No.18) | 51.6557 | 33.33 | 24 |
| 柑橘大实蝇 | ATAACGTAATCGTTACAGCCCAC (SEQ ID No.19) | 54.9944 | 43.48 | 23 |
| 蜜柑大实蝇 | ATAACGTAATCGTTACAGCCCAC(SEQ ID No.20) | 54.9944 | 43.48 | 23 |
注：R＝A/G；Y＝C/T；W＝A/T；M＝A/C；S＝G/C；K＝G/T
进一步的，上述检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组，还包含选自表2中所示的相应实蝇种类的第2号寡核苷酸探针序列。即根据探针组要针对检测的检疫性实蝇的种类选择相应的第2号寡核苷酸探针序列。
表2检测检疫性实蝇的第2号寡核苷酸探针序列
| 物种名 | 序列 | Tm | GC％ | 长度 |
| 南瓜实蝇 | GGGGATCCTATTTTATACCAACA (SEQ ID No.21) | 51.4797 | 39.13 | 23 |
| 瓜实蝇 | GCTGGTGGTGGAGACCCTATTTTATA(SEQ ID No.22) | 57.7756 | 46.15 | 26 |
| 川黑实蝇 | GGAGACCCTATTCTATATCAACA (SEQ ID No.23) | 50.5042 | 39.13 | 23 |
| 具条实蝇 | CCCCATTCTATACCAACACTTATTCTGA (SEQ ID No.24) | 56.1793 | 39.29 | 28 |
| 物种名 | 序列 | Tm | GC％ | 长度 |
| 异颜实蝇 | ACAGCCTTGTTATTACTTCTTTCAT (SEQ ID No.25) | 52.8252 | 32 | 25 |
| 南美按实蝇 | GGAGATCCAATTTTATACCAACA (SEQ ID No.26) | 50.4479 | 34.78 | 23 |
| 墨西哥按实蝇 | GGGGATCCAATTTTATATCAACA (SEQ ID No.27) | 50.4539 | 34.78 | 23 |
| 山榄按实蝇 | GTATGAGCCGTAGTATTAACAGCTTTATT (SEQ ID No.28) | 55.4558 | 34.48 | 29 |
| 桔小实蝇 | GGAGACCCTATTCTTTACCAACA (SEQ ID No.29) | 53.5698 | 43.48 | 23 |
| 番茄枝果实蝇 | CCCTATTACTTTTACTATCATTGCCAGTT (SEQ ID No.30) | 55.2809 | 34.48 | 29 |
| 番石榴实蝇 | GGGGACCCTATTCTCTATCAACA (SEQ ID No.31) | 54.7215 | 47.83 | 23 |
| 白带绕实蝇 | CTGCACTATTACTTCTACTATCTTTACCA(SEQ ID No.32) | 54.2618 | 34.48 | 29 |
| 黑樱桃实蝇 | TACGATCATCTGGGATTACATTTGA (SEQ ID No.33) | 53.7604 | 36 | 25 |
| 苹果绕实蝇 | GGAGACCCAATCTTATACCAGC(SEQ ID No.34) | 54.1419 | 50 | 22 |
| 非洲芒果实蝇 | TATTACTAACTGACCGAAATCTAAACAC (SEQ ID No.35) | 53.4029 | 32.14 | 28 |
| 非洲蜡实蝇 | CAGGAGGAGGTGATCCTATTTTATACC(SEQ ID No.36) | 55.9374 | 44.44 | 27 |
| 地中海实蝇 | TTACTGCACTACTTCTATTRTTATCTTTA(SEQ ID No.37) | 50.5378 | 24.14 | 29 |
| 油橄榄实蝇 | GGAGACCCAATCCTTTACCAAC(SEQ ID No.38) | 54.787 | 50 | 22 |
| 柑橘大实蝇 | GGAGATCCCATTCTCTACCAAC(SEQ ID No.39) | 53.801 | 50 | 22 |
| 蜜柑大实蝇 | AGATCCCATTCTCTACCAACG(SEQ ID No.40) | 53.163 | 47.62 | 21 |
注：R＝A/G；Y＝C/T；W＝A/T；M＝A/C；S＝G/C；K＝G/T
更进一步的，上述检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组，还包含选自表3中所示的相应实蝇种类的第3号寡核苷酸探针。即根据探针组要针对检测的检疫性实蝇的种类选择相应的第3号寡核苷酸探针序列。表3检测检疫性实蝇的第3号寡核苷酸探针序列
表3检测检疫性实蝇的第3号寡核苷酸探针序列
| 物种名 | 序列 | Tm | GC％ | 长度 |
| 南瓜实蝇 | AGCGTTCCCTCGAATGAATAAT(SEQ ID No.41) | 54.0817 | 40.91 | 22 |
| 瓜实蝇 | AGCGTTCCCTCGAATAAATAAT(SEQ ID No.42) | 51.8528 | 36.36 | 22 |
| 川黑实蝇 | GATCTACAGGAATTACTTTCGACCGAATA(SEQ ID No.43) | 56.491 | 37.93 | 29 |
| 物种名 | 序列 | Tm | GC％ | 长度 |
| 具条实蝇 | CCTCCTCTTTCATCAATTATTGCTCAT(SEQ ID No.44) | 55.4224 | 37.04 | 27 |
| 异颜实蝇 | AATATACGATCTACGGGAATTACAT(SEQ ID No.45) | 51.4495 | 32 | 25 |
| 南美按实蝇 | GGAATTTCATCAATTCTAGGAGCAGT(SEQ ID No.46) | 55.1961 | 38.46 | 26 |
| 墨西哥按实蝇 | TAGCTGGAATTTCATCAATCCTAGGGG(SEQ ID No.47) | 57.9086 | 44.44 | 27 |
| 山榄按实蝇 | CACTACATCTAGCCGGAATCTCATC(SEQ ID No.48) | 56.507 | 48 | 25 |
| 桔小实蝇 | CCCTATCATCTGTTATTGCACAC(SEQ ID No.49) | 53.4185 | 43.48 | 23 |
| 番茄枝果实蝇 | AAGATTTTGGTTACTACCCCCTTCC(SEQ ID No.50) | 56.2659 | 44 | 25 |
| 番石榴实蝇 | AGCATTTCCACGAATAAATAATATAAG(SEQ ID No.51) | 50.5773 | 25.93 | 27 |
| 白带绕实蝇 | GATTTGGAAACTGATTAGTACCCTTAATA(SEQ ID No.52) | 53.3186 | 31.03 | 29 |
| 黑樱桃实蝇 | GTTTCTGATTATTGCCTCCTTCCCTT(SEQ ID No.53) | 57.0077 | 42.31 | 26 |
| 苹果绕实蝇 | AGCATTTCCTCGGATAAACAAT(SEQ ID No.54) | 52.2603 | 36.36 | 22 |
| 非洲芒果实蝇 | CTCCTTCTCTCACACTCTTATTAGTA(SEQ ID No.55) | 53.0167 | 38.46 | 26 |
| 非洲蜡实蝇 | TAATATGCGATCAACTGGAATTTCATTTG(SEQ ID No.56) | 55.2203 | 31.03 | 29 |
| 地中海实蝇 | TCCTCTTTCTTCTGTGATTGCTC(SEQ ID No.57) | 54.4808 | 43.48 | 23 |
| 油橄榄实蝇 | GGCATTCCCCCGAATAAATAAT(SEQ ID No.58) | 52.7038 | 40.91 | 22 |
| 柑橘大实蝇 | GATTACTGCCACCATCTCTTACCTTA(SEQ ID No.59) | 55.902 | 42.31 | 26 |
| 蜜柑大实蝇 | AGCTTTCCCACGAATAAATAAT(SEQ ID No.60) | 50.0066 | 31.82 | 22 |
注：R＝A/G；Y＝C/T；W＝A/T；M＝A/C；S＝G/C；K＝G/T
上述对第2、3号探针序列的引入是为了减少假阳性的干扰，提高准确率。
其中，上述检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组中至少包括针对瓜实蝇(Bactroceracucurbitae)；南瓜实蝇(B.tau)；具条实蝇(B.scutellata)；川黑实蝇(B.ater)；柑橘大实蝇(B.minax)；异颜实蝇(B.diversa)中的至少一种的寡核苷酸探针序列。
为了解决本发明的技术问题，本发明还提供了一种检测检疫性实蝇的方法。该方法包括以下步骤：
a、提取待检实蝇样品的总DNA；
b、从提取的总DNA中扩增待检实蝇样品COI基因；
c、用扩增得到的COI基因与权利要求1～3任一项中所述的检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组中的各条寡核苷酸探针序列分别进行杂交实验，杂交实验结果为阳性的探针所对应的实蝇种名即为待检实蝇样品的种名。
进一步的，上述方法步骤b中扩增待检实蝇样品COI基因的引物对为：
5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
和5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
其中，上述方法步骤a中提取待检实蝇样品的总DNA的过程为：将得到的样品置于EP管中，加入50mMNaOH 180μl，将样品碾碎，并用Vortex充分震荡，95℃金属浴10min，加入1M pH8.0的Tris-HCl20μl在13,000rmp离心2min，去上清液即得。
其中，上述方法步骤b中扩增待检实蝇样品COI基因的反应过程为：
反应体系如下表：
反应程序为：94℃，2min；再将以下三步骤执行35个循环：94℃，10秒；56-47℃，30秒；68℃，1min；然后68℃，7min；反应采用降落PCR的方法，每个循环退火温度下降0.3℃。
上述方法中的提取样品的总DNA的方法、扩增待检实蝇样品COI(Cytochrome oxidase I细胞色素C氧化酶亚单位I)基因的方法、以及将待测样品和寡核苷酸探针序列进行杂交实验的方法可根据现有分子生物学技术完成。
本发明的有益效果在于；本发明探针组可以准确的鉴定20种检疫性实蝇的，本发明检测方法简单快速得到结果，同时对实蝇的幼虫或卵也能检测，尤其是能检测6种现在还没有COI基因记录的实蝇。本发明方法简单快速，能基本杜绝假阳性。具有好的应用前景，为本领域提供了一种新的选择。
附图说明
图1为空白芯片的照片
图2为未杂交的点制芯片扫描图，a行1-6为Hex；7-12为阴性探针；13-18为阳性探针；b行1-9为南瓜实蝇；10-18为瓜实蝇；c行1-9为川黑实蝇；10-18为具条实蝇；d行1-9为异颜实蝇；10-18为南美按实蝇；e行1-9为墨西哥按实蝇；10-18为山榄按实蝇；f行1-9为桔小实蝇；10-18为番茄枝果实蝇；g行1-9为番石榴实蝇；10-18为白带绕实蝇；h行1-9为黑樱桃实蝇；10-18为苹果绕实蝇；i行1-9为非洲芒果实蝇；10-18为非洲蜡实蝇；j行1-9为地中海实蝇；10-18为油橄榄实蝇；k行1-9为柑橘大实蝇；10-18为蜜柑大实蝇；1行1-6为阳性探针；7-12为阴性探针；13-18为Hex。
图3为待测样品COI目的条带电泳检测图，M为D2000marker；1号、2号、3号为桔小实蝇HF425、HF366、HF297；4、5、6号为南瓜实蝇HF589、HF486、HF593；7、8号为具条实蝇HF573、HF467；9、10号为川黑实蝇HF117、HF621；11号为地中海实蝇HF444；12号为番石榴实蝇HF403；13号为瓜实蝇HF313；14号为异颜实蝇HF105。
图4为b：待测样品阳性参照16S rRNA片段电泳检测图
注：M为D2000marker；1号、2号、3号为桔小实蝇HF425、HF366、HF297；4、5号为南瓜实蝇HF589、HF486；6、7号为具条实蝇HF573、HF467；8、9号为川黑实蝇HF117、HF621；10号为地中海实蝇HF444；11号为番石榴实蝇HF403；12号为瓜实蝇HF313；13号为异颜实蝇HF105；14号为阴性参照。
图5桔小实蝇样品HF366杂交结果
图6桔小实蝇样品HF297杂交结果
图7南瓜实蝇样品HF589杂交结果
图8南瓜实蝇样品HF593杂交结果
图9具条实蝇样品HF573杂交结果
图10具条实蝇样品HF467杂交结果
图11番石榴实蝇样品HF403杂交结果
图12瓜实蝇样品HF313杂交结果
图13川黑实蝇样品HF621杂交结果
图14地中海实蝇样品HF444杂交结果
图15柑橘大实蝇样品HF638杂交结果
图16异颜实蝇样品HF105杂交结果
在图5到图16中，左边均为各种实蝇的理论杂交结果模式图，右边均为实际的样本杂交结果。
具体实施方式
实施例一待检测实蝇种类的确定
根据实蝇种类实蝇科主要属的代表性，我国检疫性有害生物名录，政府间协定，国内分布等情况综合，本发明确定了我国有重要意义的有20种检疫性实蝇。这些种类包括的种类如表5所述。
表5本发明所针对的20种检疫性实蝇
实施例二待检测实蝇的COI序列的确定及分析
1实蝇DNA提取
物种样本DNA可以从其多种组织器官中提取，其标本的新鲜度、保存方法和保存时间等因素都可能影响提取方法及DNA质量。新鲜未保存过的标本最好，若标本一旦死亡，细胞溶解和其释放的酶将很快降解DNA。因此，标本越新鲜越好。
根据实蝇标本的特点，选用了高盐法提取DNA。具体的提取步骤如下：
(1)500μl buffer(10mM Tris，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5-1％SDS)加上tissue(部分或整只实蝇样品)；
(2)加入10μl蛋白酶K(20mg/ml)；
(3)55℃消化(消化以组织溶解为准，时间大于7小时)
(4)完全消化后，13000rpm离心5min；
(5)上清液装入新的1.5mlEP管中；
(6)加入180μl 5M NaCl，混匀放置碎冰中，5-10min；
(7)13000rpm离心10min；
(8)上清液再次转入新的1.5mlEP管中；
(9)加入400-600μl异丙醇(放置2min)
(10)13000rpm离心10min；
(11)70％乙醇洗涤沉淀2次；
(12)100％乙醇洗涤沉淀1次；
(13)自然干燥或55℃干燥保存；
(14)OD值测定；
(15)DNA原液-20℃保存；
2、目的片段COI的扩增
样本DNA提取后，使用用PCR法扩增COI基因。扩增在一般的PCR仪上即可进行。表6为具体使用的扩增条件：PCR体系中的buffer，镁离子，以及dNTP和ExTaq酶均购于大连宝生物(TaKaRa)。
通用引物LCOI-1490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和HCOI-2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)，由上海生工(Sangon)公司合成。
表6COI扩增PCR反应体系
PCR的反应在PTC200热循环仪上进行，经过多次条件优化后，具体扩增程序为：((1)95℃1min；(2)94℃45sec；(3)49℃45sec；(4)72℃1min；GOTO step(2)35more times；(6)72℃10min；(7)12℃00:00:00)。
将扩增的样品进行琼脂糖凝胶电泳。由于扩增的片段大小为700bp左右，所以琼脂糖的浓度选择1％。
对PCR扩增的样品进行纯化，选用OMEGA EZNATM，Cycle-pure kit(OMEGA，USA)试剂盒；或OMEGA EZNATM，Gel Extraction kit(OMEGA，USA)试剂盒。纯化的步骤参见各产品使用说明书。
将检测纯化后的样品送至上海英俊生物技术有限(Invirtrogen)公司进行测序。
3序列分析
从NCBI和BOLD(BARCODE OF LIFE DATA SYSTEMS)等DNA序列库中下载可用的COI序列，没有的则重新测定。按确定的芯片的20种名单的COI序列详见附录(附2记载有其NCBI登录号或其SEQ ID号)。本项目共新得到了6种实蝇COI序列，它们分别是：南瓜实蝇(Bactrocera tau SEQ ID No.64)，川黑实蝇(Bactrocera ater SEQ ID No.65)，具条实蝇(Bactrocera scutellata SEQ ID No.66)，异颜实蝇(Bactrocera diversa SEQ ID No.67)，柑橘大实蝇(Bactrocera minax SEQ ID No.68)，蜜柑大实蝇(Bactrocera tsuneonis SEQ ID No.69)。
通过聚类分析计算，可知4个属的实蝇物种都类聚在一起形成独立的支系，而属内各个种再形成小的支系。用于测试验证的20个样本的种属关系在DNA序列合约树上能得到正确划分，表明COI序列分类结果准确可靠，能够鉴定4属20种的实蝇。
实施例三待检测实蝇的特异性寡核苷酸探针的确定
1探针设计
探针设计要满足所设计探针与物种是一一对应关系，并且为了满足芯片杂交的条件，需要充分考虑1)探针自身无二级结构；2)所有的探针应保持相近的Tm值，GC含量；3)挑选的探针一般是序列中高变的区域，那么同种内也可能出现不同的单倍型，所以必要时使用兼并探针。
由于以上一些因素的限制，所挑选的探针需要反复验证。由于在实际芯片杂交中会遇到复杂的杂交动力学的因素，因此根据实际杂交的情况对探针进行了反复调整。根据上面介绍的COI序列，本发明最终设计出的三段探针序列分别如表1、表2、表3所示，每张表中列出了20种探针的每段探针，包括探针的序列Tm值，GC含量和序列长度。从表中可以看出，探针序列的Tm值的范围在50-55℃之间，长度根据Tm，在25bp上进行了调整，范围在20-27bp之间。为了使所选探针对所检物种既有特异性又有普适性，因此可对单倍型碱基差异的位点根据所出现的碱基设计兼并探针，使检测的稳定性和准确性更好。
2电子虚拟杂交验证
本发明对所设计探针进行计算机虚拟杂交进行效果验证。将本项目中20个样本的COI基因片断序列分别与DNA条形码芯片进行电子虚拟杂交，并对电子杂交结果进行聚类分析，以验证DNA条形码分类计算的准确性。
计算机虚拟杂交杂交结果如表7，表8和表9所示。计算机杂交结果以一串0和1的代码来表示。其中1表示COI基因片断与芯片上探针位点序列完全一样，表明杂交成功，成阳性；0表示COI基因片断与芯片上探针序列存在至少1个碱基的不配对，不能杂交上的，成阴性。
表7第1段探针虚拟杂交结果
| 1 | 南瓜实蝇 | 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 2 | 瓜实蝇 | 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 3 | 川黑实蝇 | 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 4 | 具条实蝇 | 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 5 | 异颜实蝇 | 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 6 | 南美按实蝇 | 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 7 | 墨西哥按实蝇 | 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 8 | 山榄按实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 9 | 桔小实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 10 | 番茄枝果实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 11 | 番石榴实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 1 | 南瓜实蝇 | 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 12 | 白带绕实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 13 | 黑樱桃实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 |
| 14 | 苹果绕实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 |
| 15 | 非洲芒果实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 |
| 16 | 非洲蜡实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 |
| 17 | 地中海实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 |
| 18 | 油橄榄实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 |
| 19 | 柑橘大实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 |
| 20 | 蜜柑大实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 |
从表7中可以看出，除了柑橘大实蝇和蜜柑大实蝇出现了交叉杂交外，“1”出现的位置正好是表中的斜对角线，表明物种和探针之间是特异性杂交，这种一一对应的关系，可以有效的提高芯片的鉴定效果。
表8第2段探针虚拟杂交结果
| 1 | 南瓜实蝇 | 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 2 | 瓜实蝇 | 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 3 | 川黑实蝇 | 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 4 | 具条实蝇 | 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 5 | 异颜实蝇 | 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 6 | 南美按实蝇 | 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 7 | 墨西哥按实蝇 | 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 8 | 山榄按实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 9 | 桔小实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 10 | 番茄枝果实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 11 | 番石榴实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 12 | 白带绕实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 13 | 黑樱桃实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 |
| 14 | 苹果绕实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 |
| 15 | 非洲芒果实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 |
| 16 | 非洲蜡实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 |
| 17 | 地中海实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 |
| 18 | 油橄榄实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 |
| 19 | 柑橘大实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 |
| 20 | 蜜柑大实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 |
从表8中可以看出，“1”出现的位置正好是表中的斜对角线，表明物种和探针之间是特异性杂交，这种一一对应的关系，可以有效的提高芯片的鉴定效果。
表9第3段探针虚拟杂交结果
| 1 | 南瓜实蝇 | 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 2 | 瓜实蝇 | 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 3 | 川黑实蝇 | 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 4 | 具条实蝇 | 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 5 | 异颜实蝇 | 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 6 | 南美按实蝇 | 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 7 | 墨西哥按实蝇 | 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 8 | 山榄按实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 9 | 桔小实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 10 | 番茄枝果实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 11 | 番石榴实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 12 | 白带绕实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 |
| 13 | 黑樱桃实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 |
| 14 | 苹果绕实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 |
| 15 | 非洲芒果实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 |
| 16 | 非洲蜡实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 |
| 17 | 地中海实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 |
| 18 | 油橄榄实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 |
| 19 | 柑橘大实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 |
| 20 | 蜜柑大实蝇 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 |
从图9中可以看出，“1”出现的位置正好是表中的斜对角线，表明物种和探针之间是特异性杂交，这种一一对应的关系，可以有效的提高芯片的鉴定效果。
统计显示，没有一个超过25bp的基因片断被所有的人类分享，依此推断其它物种也存在这种情况，因此，每个物种设计3条探针，只要与待鉴定标本PCR产物杂交匹配上至少1条探针，就可以认为DNA芯片识别结果为阳性。当然最好是匹配上3条。
本发明以检疫性实蝇DNA条形码标准区域为模板，设计DNA芯片探针，具有较为理想的物种识别率与准确性，可以有效的鉴定这20种待检的检疫性实蝇。。尤其是将3段探针联合使用，效果更佳。
实施例四使用待检测实蝇的基因芯片的来确证本发明探针组的效果
1芯片阳性和阴性参照设计
为了芯片杂交的稳定性和有效性的验证，设计了阳性及阴性参照。阳性参照选择的是实蝇科线粒体16S基因上的保守序列。用于分析的实蝇科16S序列从GenBank中获得，阳性参照挑选办法同探针的挑选。由于是阳性参照，在芯片杂交时所有的实蝇物种都应该检测到荧光信号，所以阳性参照选择的是16S上十分保守的序列，在所分析的所有实蝇物种中序列都相同。
挑选的阳性参照探针的序列为(SEQ ID No.61)：
5’-GACGAGAAGACCCTATAAATCTT-3’；
碱基长度为23bp，GC含量为39.13％，Tm值为：51.3931。
为了扩增此段阳性参照在其上下游设计特异扩增引物。引物序列如下：
上游((SEQ ID No.62))：5’-ACTGTGCRAAGGTAGCATAATCA-3’；
下游(SEQ ID No.63)：5’-CTTAATCCAACATCGAGGTCGC-3’
阴性参照选择超纯水。
2探针的合成
将设计好的20个实蝇物种的60条探针以及作为阳性参照的16S探针送上海生工生物工程有限公司合成。探针合成并用HPLC纯化，然后在-20℃保存。为了使杂交反应更容易进行，在探针的5’端连接了一段长为15bp的寡聚T片段。并在寡聚T的5’端进行氨基修饰，以便于芯片上的醛基进行化学反应。
5.2.2.3DNA芯片的制备
在生物芯片北京国家工程研究中心(博奥)——成都中医药大学联合实验室制作芯片。
芯片点阵设计如表4所示。将合成好的探针用超纯水溶解，使其终浓度为40μM。然后将溶解的探针和点样缓冲液(晶芯基因芯片点样液)充分混匀分装到384孔板中，另外还将Hex及阳性和阴性内参装入384孔板的对应位置。之后将384孔板和醛基芯片放入如芯片点样仪中进行点样。点样的过程在博奥生物芯片公司所设计的“晶芯SmartArrayer48”点样程序下完成。本实施例采用的是18×12的矩阵，点样时各参数按系统计算结果进行。试验过程所使用的博奥公司的型号为SmartArraryerTM48芯片点样仪。点制的是CapitalBio(博奥)的醛基基片，点制后的芯片如图1所示。
为了检测芯片是否有漏点的情况，对点制的芯片进行扫描，以便对漏点进行补点。点制好的芯片扫描结果如2，图中的白色亮点为Hex，其余为探针点。点阵中探针位点与表4芯片阵列设计图中位点相同。矩阵共12行，18列。第一行与最后一行为Hex，阴性参照和阳性参照。中间十行为检测实蝇种类特异性探针。其中每个物种三段探针，每个探针点三次重复。
芯片点制好后进行常规的芯片固定过程，使探针牢固的结合到芯片上。
表4芯片点阵表
实施例五本发明检测实蝇的基因芯片效果的验证实验
利用制作好的芯片，对已有的部分样品进行验证。验证的样品选择了南瓜实蝇、瓜实蝇、具条实蝇、桔小实蝇、番石榴实蝇、川黑实蝇、异颜实蝇和地中海实蝇。其中对南瓜实蝇、具条实蝇、桔小实蝇和川黑实蝇进行不同地方的验证。
为了满足口岸快速鉴定物种的要求，本课题采用了多种DNA提取方法，并对PCR的最佳扩增条件进行了摸索。最终寻找了一种优化的快速杂交样品制备方案：
具体的操作过程如下：
1)DNA模板的提取：将得到的样品(实蝇标本个体)置于EP管中---加入50mMNaOH 180μl，将样品碾碎，并用Vortex充分震荡---95℃金属浴，10min---加入1M Tris-HCl(pH8.0)20μl---13,000rmp离心2min，上清液可直接作为PCR反应模板。
2)PCR反应体系见表10：
表10DNA条形码样品扩增PCR反应体系
反应程序如下：94℃，2min；再执行35个循环以下三步骤：94℃，10sec；56-47℃，30sec；68℃，1min；然后68℃，7min。反应采用降落PCR的方法，每个循环退火温度下降0.3℃。
通过此方法的扩增条带的电泳图谱如图6.1-a所示。从图中可以看出利用高效PCR聚合酶和降落PCR的方法可以扩增出目的条带，并且条带的亮度大于markerD2000，说明此方法扩增效果良好。
另外阳性参照16S rRNA片段也采用这种扩增方法，扩增后电泳检测结果见图6.1-b。
1样品和芯片预处理
杂交体系的配制与变性过程杂交体积为12μl，选用博奥提供的杂交液，将杂交液和样品混合再转移到0.2ml的离心管中，短暂离心。在PCR仪中95℃热变性3min，冰浴骤冷2-3min，用于杂交。杂交液12μl体系见表11。
表11 12μl体系杂交体系的配方
芯片贴围栏。将围栏不干胶面贴纸揭掉，用镊子夹住围栏放在盛放围栏的模具中，有粘性的一面朝上。将芯片前端顶在模具的内侧，手持芯片标签一端缓慢往下压，使芯片与围栏贴紧。注意：芯片点有样品的一面向下。
2芯片杂交
杂交盒与杂交：把贴好围栏的芯片放入杂交盒内，点有探针的一面朝上。将带有凸块的盖玻片卡放在芯片的黑色围栏上，注意有凸块的一面对着芯片；然后从盖玻片的小孔缓慢加入12μl的杂交液后，杂交液会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凸面和芯片之间形成一道液膜。不要震动盖玻片或芯片以避免破坏液膜。快速把玻片放入杂交盒内(杂交盒内的凹槽内预先加入150μl蒸馏水)，盖紧杂交盒盖，再将杂交盒放入BioMixerTMII芯片杂交清洗仪中，42℃，杂交12～14h。
3芯片清洗及扫描
芯片清洗的操作过程如下：
A.先后将洗液I、洗液II放在微波炉中预热至42℃，转置到清洗盒中。
B.杂交结束后，将芯片转移到盛放洗液的清洗盒中(围栏可保留)，杂交面朝上，放在水平摇床上缓慢清洗。清洗步骤如表12.
表12三维氨基芯片的洗液配制及清洗条件
C.芯片清洗后，放在50ml锥形离心管中，2000rpm离心1分钟，除去玻片表面的液体，此时的芯片可以用于扫描。
样品与芯片杂交实验过程中所使用的芯片杂交仪，型号：BiomixerTMII，芯片清洗仪芯片清洗仪，型号：SlidewasherTM8和芯片扫描仪芯片扫描仪型号：LuxScan-1OK/A。
综上，芯片从制备到样品杂交检测扫描所使用的实验材料、试剂和仪器如表13所示。
表13基片制备和样品检测中的实验材料、试剂和仪器
4芯片杂交扫描结果
4.1桔小实蝇杂交验证结果
本项目共验证了由广东广州和四川攀枝花等出入境检验检疫局提供的桔小实蝇样品。来自广州出入境检验检疫局的桔小实蝇标本编号为HF366，芯片杂交结果见图5；来自四川攀枝花出入境检验检疫局的桔小实蝇标本编号为HF297，芯片杂交结果见图6。
从图中可以看出，整个芯片矩阵的左上角和右下角的六个绿色荧光点为HEX坐标探针，矩阵的右上角和左下角六亮点为阳性参照，第一排和最后一排的中间六点为阴性参照，在图中与背景颜色相同。三号样品都与代表桔小实蝇的第六排左起的三段探针的九个点样点呈现杂交阳性，结果符合试验设计，表明此芯片可特异性的鉴定桔小实蝇。杂交图中出现了一些较暗的非特异性杂交，这可能与杂交时间过长和杂交样品量有关，也与探针间差异位点的位置有关。但是三段探针都呈现明显阳性的物种只有桔小实蝇，符合本芯片以三条探针确定一个物种的设计，因此假阳性位点不影响对结果的判断。
4.2南瓜实蝇杂交验证结果
本项目共验证了由四川南充和出入境检验检疫局提供的南瓜实蝇样品。标本编号为分别HF589和HF593，芯片杂交结果见图7和图8。
从图中可以看出，在左侧的南瓜实蝇理论杂交模式图中显示了整个芯片矩阵的布置情况。三号样品都与代表南瓜实蝇的第二排左起的三段探针的九个点样点呈现杂交阳性，结果符合试验设计，表明此芯片可特异性的鉴定南瓜实蝇。
4.3具条实蝇杂交验证结果
本项目共验证了由四川南充和福建福州等出入境检验检疫局提供的南瓜实蝇样品。其中来自四川南充出入境检验检疫局的具条实蝇标本编号为HF573，芯片杂交结果见图9；来自福建福州出入境检验检疫局的具条实蝇标本编号为HF467，芯片杂交结果见图10。
从图中可以看出，两号样品都与代表具条实蝇的第三排右起的三段探针的九个点样点呈现杂交阳性，结果符合试验设计，表明此芯片可特异性的鉴定具条实蝇。在图9中具条实蝇杂交只呈现了8个杂交位点，第三段探针的第三个位点未出现杂交信号。出现这种情况可能是杂交时该位点有杂质或者是杂交边缘效应所致。
4.4番石榴实蝇杂交验证结果
本项目验证了由云南出入境检验检疫局提供的番石榴实蝇样品。其番石榴实蝇标本由提供，标本编号为HF403，芯片杂交结果见图11。
从图中可以看出，样品与代表番石榴实蝇的第七排左起的三段探针的九个点样点呈现杂交阳性，结果符合试验设计，表明此芯片可特异性的鉴定番石榴实蝇。
4.5瓜实蝇杂交验证结果
本项目验证了由广州出入境检验检疫局提供的瓜实蝇标本，标本编号为HF313，芯片杂交结果见12。从图中可以看出，样品与代表瓜实蝇的第二排右起的三段探针的九个点样点呈现杂交阳性，结果符合试验设计，表明此芯片可特异性的鉴定瓜实蝇。芯片中三段探针都呈现明显阳性的物种只有瓜实蝇，符合本实验以两条和两条以上探针确定一个物种的设计，因此假阳性位点不影响对结果的判断。
4.6川黑实蝇杂交验证结果
本项目共验证了由在成都驷马桥野外采集的川黑实蝇样品。来自成都驷马桥的川黑实蝇标本由编号为HF621，芯片杂交结果见图13。
从图中可以看出，川黑实蝇的三段探针中，第一段探针的三个杂交位点的杂交信号较弱，但仍可通过调整光强度来判读结果。这种三段探针中出现一段弱的杂交信号的情况，与探针和标记样品之间的吻合度及该段探针的最适杂交条件有关。但是三段探针都呈现明显阳性的物种只有川黑实蝇，符合以三条探针确定一个物种的设计，因此假阳性位点不影响对结果的判断。
4.7地中海实蝇杂交验证结果
本项目验证了由截获自多哥的地中海实蝇样品。其地中海实蝇标本编号为HF444，芯片杂交结果见图14。从图中可以看出，样品与代表地中海实蝇的第十排左起的三段探针的九个点样点呈现杂交阳性，结果符合试验设计，表明此芯片可特异性的鉴定地中海实蝇。
地中海实蝇是实蝇科中最重要的种类，号称“水果头号杀手”，对其准确有效地鉴定意义重大。从对地中海实蝇的检测结果显示，三段探针都能准确判读，其他探针位点上出现假阳性的情况较少，而且假阳性位点的荧光亮度较低，不影响对实验结果的判定。
4.8柑橘大实蝇杂交验证结果
本项目验证了由贵州都匀县质量技术监督局提供的柑橘大实蝇样品，标本编号为HF638，芯片杂交结果见图15。
从图中可以看出，样品与代表柑橘大实蝇的倒数第二排左起的三段探针的第二段和第三段探针的六个点样点呈现杂交阳性，结果符合试验设计，表明此芯片可特异性的鉴定柑橘大实蝇。杂交图中出现了第三行右起第二段探针三个点的非特异性杂交，这可能与探针间差异位点的位置有关。但是三段探针中呈现两段阳性的物种只有柑橘大实蝇，符合以两条和两条以上探针确定一个物种的设计，因此假阳性位点不影响对结果的判断。
4.9异颜实蝇杂交验证结果
本项目验证了由四川攀枝花出入境检验检疫局提供的异颜实蝇样品，标本编号为HF105，芯片杂交结果见16。
从图中可以看出，1样品与代表异颜实蝇的第四排左起的三段探针的九个点样点呈现杂交阳性，结果符合试验设计，表明此芯片可特异性的鉴定异颜实蝇。1但是三段探针都呈现明显阳性的物种只有异颜实蝇，符合1以两条和两条以上探针确定一个物种的设计，因此1假阳性位点不影响1对结果的判断。
本发明对样品到扩增出目的杂交片段的过程进行了优化。即采用DNA快速提取方法，并采用高效PCR聚合酶和降落PCR的方法。运用此鉴定方法不仅使目的条带的浓度和纯度达到杂交的要求，而且从得到需检测的实蝇种类样品到扩增出目的片段、电泳检测、杂交、扫描到得出结论的整个DNA芯片对物种的鉴定过程仅要四个小时。这充分满足了口岸对于检疫性实蝇快速鉴定的要求。
附1：英文简写
附2 20种检疫性实蝇的COI序列
Bactrocera tau南瓜实蝇(SEQ ID No.64)
Bactrocera ater川黑实蝇(SEQ ID No.65)
Bactrocera scutellata具条实蝇(SEQ ID No.66)
Bactrocera diversa异颜实蝇(SEQ ID No.67)
Bactrocera minax柑橘大实蝇(SEQ ID No.68)
Bactrocera tsuneonis蜜柑大实蝇(SEQ ID No.69)
瓜实蝇见DQ116246B|actrocera_cucurbitae
南美按实蝇见DQ116201|Anastrepha_fraterculu
墨西哥按实蝇见DQ116207|Anastrepha_ludens
山榄按实蝇见DQ116216|Anastrepha_serpentine
桔小实蝇见DQ116273|Bactrocera_dorsalis
番茄枝果实蝇见DQ116234|Bactrocera_aquilonis
番石榴实蝇见DQ116265|Bactrocera_correcta
白带绕实蝇见DQ006863|Rhagoletis_cingulate
黑樱桃实蝇见DQ116380|Rhagoletis_fausta
苹果绕实蝇见DQ006862|Rhagoletis_pomonella
非洲芒果实蝇见AY788421|Ceratitis_cosyra
非洲蜡实蝇见DQ116375|Ceratitis_rosa
地中海实蝇见DQ116370|Ceratitis_capitata
油橄榄实蝇见NC_005333|Bactrocera_oleae
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中华人民共和国四川出入境检验检疫局
中国科学院成都生物研究所
<120>检测检疫性实蝇的探针组及检测方法
<130>A100105K
<160>69
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>1
gctggtggtg gggatcctat tttata 26
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>2
ctggtggtgg agaccctatt 20
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>artificial
<400>3
gtatagtgga aaatggagct gggaca 26
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>4
actactgccc ccttcactta cactac 26
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>5
tttcatctat tttaggagcc gta 23
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>6
gcactattac tactcttatc attaccag 28
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>7
acagctcacg cgtttgtgat aat 23
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>8
gattcggaaa ttgactagtt cctttaat 28
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<223>R＝A/G
<220>
<221>R
<222>(14)..(14)
<223>R＝A/G
<400>9
cacttcactt agcrggtatt t 21
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>10
tggtttcgga aactggcttg tt 22
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<223>Y＝C/T
<221>Y
<222>(13)..(13)
<223>Y＝C/T
<400>11
actccactta gcyggtattt c 21
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>12
ataatgtaat tgttacagct catgc 25
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>13
acaatgtaat tgtaacagct catg 24
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>14
ctctacactt agcggggatt tcttc 25
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>15
ataacgtaat tgtaactgct catg 24
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>16
ctcttcactt agcaggaatc tcttctat 28
<210>17
<211>27
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>17
ctcttcattt agctggaatt tcttcta 27
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>18
ataatgtaat tgtaactgct cacg 24
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>19
ataacgtaat cgttacagcc cac 23
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>20
ataacgtaat cgttacagcc cac 23
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>21
ggggatccta ttttatacca aca 23
<210>22
<211>26
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>22
gctggtggtg gagaccctat tttata 26
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>23
ggagacccta ttctatatca aca 23
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>24
ccccattcta taccaacact tattctga 28
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>25
acagccttgt tattacttct ttcat 25
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>26
ggagatccaa ttttatacca aca 23
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<400>27
ggggatccaa ttttatatca aca 23
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>28
gtatgagccg tagtattaac agctttatt 29
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>29
ggagacccta ttctttacca aca 23
<210>30
<211>29
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>30
ccctattact tttactatca ttgccagtt 29
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>31
ggggacccta ttctctatca aca 23
<210>32
<211>29
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>32
ctgcactatt acttctacta tctttacca 29
<210>33
<211>25
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>33
tacgatcatc tgggattaca tttga 25
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>34
ggagacccaa tcttatacca gc 22
<210>35
<211>28
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>35
tattactaac tgaccgaaat ctaaacac 28
<210>36
<211>27
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>36
caggaggagg tgatcctatt ttatacc 27
<210>37
<211>29
<212>DNA
<213>artificial
<223>R＝A/G
<220>
<221>R
<222>(20)..(20)
<223>R＝A/G
<400>37
ttactgcact acttctattr ttatcttta 29
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>38
ggagacccaa tcctttacca ac 22
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>39
ggagatccca ttctctacca ac 22
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>40
agatcccatt ctctaccaac g 21
<210>41
<211>22
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>41
agcgttccct cgaatgaata at 22
<210>42
<211>22
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>42
agcgttccct cgaataaata at 22
<210>43
<211>29
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>43
gatctacagg aattactttc gaccgaata 29
<210>44
<211>27
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>44
cctcctcttt catcaattat tgctcat 27
<210>45
<211>25
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>45
aatatacgat ctacgggaat tacat 25
<210>46
<211>26
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>46
ggaatttcat caattctagg agcagt 26
<210>47
<211>27
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>47
tagctggaat ttcatcaatc ctagggg 27
<210>48
<211>25
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>48
cactacatct agccggaatc tcatc 25
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>49
ccctatcatc tgttattgca cac 23
<210>50
<211>25
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>50
aagattttgg ttactacccc cttcc 25
<210>51
<211>27
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>51
agcatttcca cgaataaata atataag 27
<210>52
<211>29
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>52
gatttggaaa ctgattagta cccttaata 29
<210>53
<211>26
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>53
gtttctgatt attgcctcct tccctt 26
<210>54
<211>22
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>54
agcatttcct cggataaaca at 22
<210>55
<211>26
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>55
ctccttctct cacactctta ttagta 26
<210>56
<211>29
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>56
taatatgcga tcaactggaa tttcatttg 29
<210>57
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>57
tcctctttct tctgtgattg ctc 23
<210>58
<211>22
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>58
ggcattcccc cgaataaata at 22
<210>59
<211>26
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>59
gattactgcc accatctctt acctta 26
<210>60
<211>22
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>60
agctttccca cgaataaata at 22
<210>61
<211>23
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>61
gacgagaaga ccctataaat ctt 23
<210>62
<211>25
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>62
ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25
<210>63
<211>26
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>63
taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26
<210>64
<211>615
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>64
ttagttcgag cagaactagg gcacccagga gctttaattg gagatgacca aatctataat 60
gtaatcgtaa cagctcatgc atttgttata atttttttca tggtaatgcc tattataatt 120
ggaggatttg gaaattgatt agtacctcta atattaggag caccagatat agcgttccct 180
cgaatgaata atataagatt ttgattatta cctccctctc ttacattact tttagtgagc 240
agtatagtag aaaacggagc tggtacaggt tgaactgttt accctcccct ttcatcaatt 300
atcgctcatg gtggagcctc agttgattta gctatttttt ctctacattt agctggtatt 360
tcatcaattt taggggctgt aaatttcatt actacagtaa ttaatatacg atcaacaggg 420
attacatttg accgaatacc tttattcgtt tgagctgtag tattaacagc tcttctttta 480
cttctatctc tcccagtatt agctggagct attactatac ttttaacaga ccgaaactta 540
aatacatctt tcttcgaccc agctggtggt ggggatccta ttttatacca acacttattt 600
tgattttttg gtcac 615
<210>65
<211>615
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>65
ttagttcgag cagaattagg tcatccagga gctctaattg gagacgacca aatttataat 60
gtaatcgtaa cagctcatgc atttgtaata atttttttca tagtaatacc aattatgatt 120
ggaggatttg gtaattgatt agtaccatta atacttggag ccccagatat agcattccca 180
cgaataaata acataagatt ttgattactg cctccttcac ttactctact tttagtgagc 240
agtatagtgg aaaatggagc tgggacaggt tgaactgtat accctcctct ttcatcaatt 300
attgcacatg ggggagcatc cgttgattta gctattttct ctttacattt agctggaatt 360
tcctctattt taggtgccgt aaattttatt acaacagtaa ttaatatacg atctacagga 420
attactttcg accgaatacc tttattcgta tgagcagtag tattaacagc actattacta 480
ctactttcat tgcctgtttt agctggagct atcacaatac tattaacaga tcgaaattta 540
aatacttctt tctttgaccc agcgggaggt ggagacccta ttctatatca acatttattt 600
tgattttttg gtcac 615
<210>66
<211>615
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>66
ttagtccgag cagaattggg tcgcccagga gctctaattg gagacgacca aatttataat 60
gtaatcgtaa cagctcatgc atttgtaata atttttttca tagtaatacc tattataatt 120
ggaggatttg gtaattgatt agtaccttta atactcggag ccccagatat agccttccca 180
cgaataaata atataagatt ttgactactg cccccttcac ttacactact tttagtgagc 240
agtatagtag aaaatggggc tggaacaggt tgaactgttt accctcctct ttcatcaatt 300
attgctcatg ggggagcatc tgttgatcta gctattttct ctttacattt agccggaatt 360
tcctctattt taggtgcagt aaattttatt acaacagtaa tcaatatacg atctacagga 420
attaccttcg atcgaatacc tttatttgtc tgagcagtag tattaacagc cctattacta 480
ctactttcat tacctgtttt agctggagct attacaatgc tattaacaga tcgaaattta 540
aatacctctt tctttgaccc agccggaggt ggagacccca ttctatacca acacttattc 600
tgattttttg gtcac 615
<210>67
<211>615
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>67
ttagttcgag cagaattagg tcaccccgga gctctaattg gagacgatca aatttataac 60
gtaatcgtaa cagctcacgc atttgtaata atttttttta tagttatacc tattataatt 120
ggagggtttg gtaattgatt agttccccta atactgggag ccccagatat agcattccca 180
cgaataaata atataagatt ctgattgctg cccccttcac ttacactact tttagtcagc 240
agtatagtag aaaacggagc tgggacaggt tgaactgttt accctcccct ctcatcaatc 300
atcgctcacg gaggggcatc tgttgattta gctatttttt ctttacattt agccggaatt 360
tcatctattt taggagccgt aaattttatt accacagtaa ttaatatacg atctacggga 420
attacattcg accgaatgcc tttattcgta tgagcagtag tattaacagc cttgttatta 480
cttctttcat tgcctgtact agccggagct attactatat tattaacaga tcgaaattta 540
aacacctctt tcttcgaccc agctggaggt ggagacccta ttttatacca acatttattt 600
tgattttttg gtcac 615
<210>68
<211>616
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>68
cttgttcgag cagaaactag gccacccagg agccttaatc ggagatgacc aaatttataa 60
cgtaatcgtt acagcccacg cttttgtaat aatcttcttc atagtgatac ctatcataat 120
tgggggattc ggaaactgat tagtacccct aatactgggg gcccccgaca tagctttccc 180
acgaataaat aatataagat tctgattact gccaccatct cttaccttat tgttagtcag 240
cagcatagtg gaaaacgggg cgggcacagg ttggactgtt taccctccgc tatcatctat 300
tatcgcccac ggaggggcct cagtcgactt agccattttc tccctccacc tagcaggaat 360
ctcgtcaatt ctaggggcag taaactttat tactacagta attaatatgc gttcaacagg 420
aattacattt gaccgaatac ccctctttgt gtgagccgta gtactaacag ctctactcct 480
cttactatcc ctcccagtcc tagccggagc tatcacaata cttttaacag accgaaacct 540
aaacacttcc ttcttcgacc cagcgggagg gggagatccc attctctacc aacacttatt 600
ctgatttttt ggtcac 616
<210>69
<211>615
<212>DNA
<213>artificial
<223>artificial
<400>69
cttgttcgag cagaactagg ccacccagga gccttaaccg gagatgacca aatttataac 60
gtaatcgtta cagcccacgc ttttgtaata atcttcttca tagtgatacc tatcataatt 120
gggggattcg gaaactgatt agtaccccta atactggggg cccccgacat agctttccca 180
cgaataaata atataagatt ctgattactg ccaccatctc ttaccttatt gttagtcagc 240
agcatagtgg aaaacggggc gggcacaggt tggactgttt accctccgct atcatctatt 300
atcgcccacg gaggggcctc agtcgactta gccattttct ccctccacct agcaggaatc 360
tcgtcaattc taggggcagt aaactttatt actacagtaa ttaatatgcg ttcaacagga 420
attacatttg accgaatacc cctctttgtg tgagccgtag tactaacagc tctactcctc 480
ttactatccc tcccagtcct agccggagct atcacaatac ttttaacaga ccgaaactta 540
aacacttcct tcttcgaccc agcgggaggg ggagatccca ttctctacca acgcttattc 600
tgattttttg gtcac 615
Claims (7)
1.检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组，所述的寡核苷酸探针组包含如下所示的至少一种寡核苷酸探针序列，
序列中，R＝A/G，Y＝C/T；所述检疫性实蝇为：南瓜实蝇Bactrocera tau、瓜实蝇B.cucurbitae、川黑实蝇B.ater、具条实蝇B.scutellata、异颜实蝇B.diversa、桔小实蝇B.dorsalis、番茄枝果实蝇B.aquilonis、番石榴实蝇B.correcta、油橄榄实蝇B.oleae、蜜柑大实蝇B.tsuneonis、柑橘大实蝇B.minax、南美按实蝇Anastrepha fraterculus、墨西哥按实蝇A.aludens、山榄按实蝇A.Serpentina、地中海实蝇Ceratitis capitata、非洲芒果实蝇C.cosyra、非洲蜡实蝇C.Rosa、苹果绕实蝇Rhagoletis pomonella、白带绕实蝇R.cingulata或黑樱桃实蝇R.fausta中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组，所述的寡核苷酸探针组还包含包含选自如下所示各序列中相应实蝇种类的第2号寡核苷酸探针序列，
序列中，R＝A/G，Y＝C/T。
3.根据权利要求3所述的检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组，所述的寡核苷酸探针组还包含选自如下所示的各序列中的相应实蝇种类的第3号寡核苷酸探针，
4.检测检疫性实蝇的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、提取待检实蝇样品的总DNA；
b、从提取的总DNA中扩增待检实蝇样品COI基因；
c、用扩增得到的COI基因与权利要求1～3任一项中所述的检测检疫性实蝇的寡核苷酸探针组中的各条寡核苷酸探针探针序列分别进行杂交实验，杂交实验结果为阳性的探针所对应的实蝇种名即为待检实蝇样品的种名。
5.根据权利要求4所述的检测检疫性实蝇的方法，其特征在于步骤b中扩增待检实蝇样品COI基因的引物对为：
5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
和5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
6.根据权利要求4所述的检测检疫性实蝇的方法，其特征在于步骤a中提取待检实蝇样品的总DNA的方法为：将得到的样品置于EP管中，加入50mMNaOH 180μl，将样品碾碎，并用Vortex充分震荡，95℃金属浴10min，加入1M pH8.0的Tris-HCl 20μl在13,000rmp离心2min，去上清液即得。
7.根据权利要求4所述的检测检疫性实蝇的方法，其特征在于步骤d中扩增待检实蝇样品COI基因的方法为：
反应体系如下表：
反应程序如下：94℃，2min；再将以下三步骤执行35个循环：94℃，10秒；56-47℃，30秒；68℃，1min；然后68℃，7min；反应采用降落PCR的方法，每个循环退火温度下降0.3℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010140942 CN101851675B (zh) | 2010-04-07 | 2010-04-07 | 检测检疫性实蝇的探针组及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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