CN104789648A - 鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记及其应用，属于植物生物技术和分子育种领域。通过比对水稻各类恢复系亲本测序数据，筛选恢复基因Rf-1区段多态性的32个位点，设计多个引物对和TaqMan-MGB探针组合，其核苷酸序列分别如SEQID NO.1-128所示，并将32组引物对和TaqMan-MGB探针组合进一步制作成OpenArray芯片，利用上述分子标记或芯片可实现对水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的鉴定。本发明可应用于水稻种质资源中CMS恢复基因Rf-1区段的单倍型鉴定及三系杂交稻的培育。

Description

鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术和分子育种领域，更具体地，涉及鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记及其应用。

背景技术

三系杂交水稻以其稳产、高产等优势，在种植面积上一直处于领先地位，为我国粮食安全做出了巨大的贡献。CMS(Cytoplasmic MaleSterility)即细胞质雄性不育,是三系杂交稻开发利用的物质基础，以此为基础开发的三系配套具体是指CMS恢复系、CMS保持系和CMS不育系。育种过程需要完成三系各自的保种和制备杂交种，具体操作是CMS保持系和CMS恢复系通过自交繁种；CMS不育系与CMS保持系杂交繁种；CMS恢复系做父本，与CMS不育系母本杂交可以制杂交种。我国杂交水稻CMS恢复系的选育历史上，CMS恢复系主要有野败型(WA)CMS恢复系和红莲型(HL)CMS恢复系，以及粳稻包台型(BT)CMS恢复系(万建民等，2008)。明恢63的培育成功具有里程牌式的意义，它兼具野败型CMS和包台型CMS恢复系的作用(Tang等，2014；Wang等，2006；Komori等，2004)；其次，9311是红莲型CMS恢复系的代表品系(Hu等，2012)。上述3种类型中控制着育性恢复的关键位点之一就是Rf-1基因及其相邻区间，它包括了野败型CMS恢复基因Rf4(Tang等，2014)、包台型CMS恢复基因Rf-1(Rf1a)和Rf1b(Wang等，2006；Komori等，2004)、红莲型CMS恢复基因Rf5(Rf1a)(Hu等，2012)。

传统育种中，恢复系的选育通过大田杂交测恢保关系，工作量大，组合有限，而利用分子标记可以在室内快速鉴定恢复基因的等位类型，提升育种的预见性，减少不必要的测交组合，从而提高育种效率。在分子标记辅助育种中，当前该基因座位的常用分子标记可分为两种，一是紧密连锁的标记，二是功能标记(陈涛等，2013)。在大规模选择中这两类标记都有一定的缺陷，前者会有目的基因丢失的现象，后者在育种实践中只能够鉴别其中一个基因座位的基因型，且两种标记都会伴随非预期性状的带入，即存在连锁累赘的问题。

基于CMS恢复基因Rf-1位点的基因定位克隆研究，已经认识到该位点的恢复基因都属于PPR家族成员，具有较高的DNA序列同源性，常规的InDel区分彼此之间的差异非常困难，而SNP分布广、数量多，是开发鉴别该位点基因家族成员彼此之间差异标记的有效来源。因而，通过开发区段内分布合理的多个以SNP标记为主的组合，可以鉴定种质资源的Rf-1区段的单倍型，同时，可以在培育三系杂交水稻中，鉴定Rf-1区段导入片段大小范围，选择更加合适的改良单株后代，有效克服连锁累赘。最终，达到同步解决多个基因座位的基因型鉴定及连锁累赘的问题，进而，提升育种技术水平。

Life Technologies公司(http://www.lifetechnologies.com/)的TaqMan OpenArray技术是将TaqMan-MGB探针技术与OpenArray芯片技术相结合的高通量基因分型技术。TaqMan-MGB探针技术是已经成熟应用的水解携带荧光基团的杂交探针获取荧光信号的检测技术。OpenArray芯片技术是将反应控制在33nl的微孔内进行的微阵列技术，一张芯片上设有3072个微孔，由48个方阵组成，按4行12列排布，每个方阵由64个微孔组成，按8行8列排布。芯片上可以灵活地选择检测的目标数目，如16个，32个，64个，128个和256个；相应的检测样品数为144份，96份，48份，24份和12份。OpenArray芯片灵活的检测目标数目与检测样品数的组合方案可以为不同规模的检测提供成本控制更加合理的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供了鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记。

为实现本发明目的，本发明首先利用新一代测序技术，对水稻野败型和包台型CMS恢复系亲本明恢63、红莲型CMS恢复系亲本9311、自主培育的优良恢复系G527和水稻野败型保持系亲本珍汕97进行全基因组重测序，与参照品种日本晴测序数据进行比对，选定Rf-1基因及其上下游各200kb约遗传距离1cM区间范围，发掘多态性位点。共获得水稻CMS恢复基因Rf-1区段多态性位点32个。

具体地，本发明筛选水稻CMS恢复基因Rf-1区段多态性位点的方法包括以下步骤：

(1)比对参考基因组，将各材料测序reads比对到Nipponbare基因组，使用软件BWA进行比对，参考基因组序列是MSU第6.1版Nipponbare的基因组序列。

(2)鉴定筛选多态性位点，基于步骤(1)的比对结果，使用软件SAMtools分析鉴定多态性位点，具体步骤如下:1)位置碱基比对的质量值(MapQ值为50是特异性最强的reads，MapQ值小于40时将不会被采用)；2)位置碱基测序的质量值大于或等于20；3)位置碱基的杂合程度(碱基必须纯合)；4)位置碱基的覆盖度(位点的覆盖度大于5小于1000)；5)baseQ/BAQ的值小于15的位点不会被选定；6)位置碱基的变异可能性Q值大于等于20。满足以上条件且变异位点周围的序列保守时，该位点将被用作开发标记的候选。

(3)设计探针引物，将抽提包含候选变异位点的测序序列，利用Primer Express V3.0.1软件的TaqMan MGB Allelic Discrimination模块进行设计，如果软件给出设计结果，选择合适的探针、引物作为候选；否则，将序列转换为反向互补序列后，再次尝试设计，如果依然找不到合适的探针引物则视为标记设计未通过。如果一段序列上可以设计多个探针，则选择软件设计给出罚分最低的探针。以标记坐标平均分布的原则，在5个参考样品基因组重测序共线性的区段每10Kb设计一个标记，在平衡基因组之间的结构差异之后达到均匀分布。

因此，本发明提供了一种用于鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记，该分子标记是由以下引物扩增得到，所述引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1-2或SEQ ID NO.5-6或SEQ ID NO.9-10或

SEQ ID NO.13-14或SEQ ID NO.17-18或SEQ ID NO.21-22或

SEQ ID NO.25-26或SEQ ID NO.29-30或SEQ ID NO.33-34或

SEQ ID NO.37-38或SEQ ID NO.41-42或SEQ ID NO.45-46或

SEQ ID NO.49-50或SEQ ID NO.53-54或SEQ ID NO.57-58或

SEQ ID NO.61-62或SEQ ID NO.65-66或SEQ ID NO.69-70或

SEQ ID NO.73-74或SEQ ID NO.77-78或SEQ ID NO.81-82或

SEQ ID NO.85-86或SEQ ID NO.89-90或SEQ ID NO.93-94或

SEQ ID NO.97-98或SEQ ID NO.101-102或

SEQ ID NO.105-106或SEQ ID NO.109-110或

SEQ ID NO.113-114或SEQ ID NO.117-118或

SEQ ID NO.121-122或SEQ ID NO.125-126。

本发明还提供了一种用于鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记，该分子标记是由32组引物经PCR扩增得到，32组引物序列分别为：

SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.5-6和SEQ ID NO.9-10和

SEQ ID NO.13-14和SEQ ID NO.17-18和SEQ ID NO.21-22和

SEQ ID NO.25-26和SEQ ID NO.29-30和SEQ ID NO.33-34和

SEQ ID NO.37-38和SEQ ID NO.41-42和SEQ ID NO.45-46和

SEQ ID NO.49-50和SEQ ID NO.53-54和SEQ ID NO.57-58和

SEQ ID NO.61-62和SEQ ID NO.65-66和SEQ ID NO.69-70和

SEQ ID NO.73-74和SEQ ID NO.77-78和SEQ ID NO.81-82和

SEQ ID NO.85-86和SEQ ID NO.89-90和SEQ ID NO.93-94和

SEQ ID NO.97-98和SEQ ID NO.101-102和

SEQ ID NO.105-106和SEQ ID NO.109-110和

SEQ ID NO.113-114和SEQ ID NO.117-118和

SEQ ID NO.121-122和SEQ ID NO.125-126所示。

本发明还提供了用于鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的引物探针组合，是由32组引物探针组合构成，每组引物探针组合由一对引物及两条TaqMan-MGB探针组成，其序列分别如SEQ IDNO.1-128所示。

进一步地，本发明将上述32个位点的TaqMan-MGB探针和引物对组合，利用TaqMan OpenArray芯片制造技术制作成OpenArray芯片，该芯片命名为Rf-OA芯片，可同时检测96个样品。

本发明提供了上述分子标记或引物探针组合或OpenArray芯片在水稻种质资源鉴定中的应用。

本发明还提供了上述分子标记或引物探针组合或OpenArray芯片在培育三系杂交稻中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型鉴定方法。

本领域技术人员可以根据本发明提供的上述分子标记，利用PCR的方法鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1的基因型，也可以利用上述引物探针组合或OpenArray芯片，采用荧光定量PCR方法进行水稻CMS恢复基因Rf-1的基因型鉴定，去除实验过程中缺失数据的位点，将所得结果与参照样品进行比较，判断单倍型，具体包括以下步骤：

(1)水稻基因组DNA提取：

根据检测需要从水稻种子、叶片等组织抽提基因组DNA。

(2)DNA样品质量检测：

用紫外分光光度计测量基因组DNA中蛋白质和有机物质污染水平，基因组DNA A260/280比值应在1.8-2.0之间，A260/230比值应在1.8-2.2之间，DNA工作液浓度10ng/μl；

(3)按照Life Technologies网站提供的标准操作方法进行操作,产生检测样品原始的基因型数据，即样品在特定位点上的基因型的型别，如纯合子1，纯合子2，杂合子或者无扩增杂交信号；

(4)数据分析：QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System仪器自带的分析软件产生基因型数据，经过缺失值的数据处理后，利用PowerMarker软件计算等位基因频率，按照SharedAllele距离计算方法计算材料间的遗传距离，并利用Mega5软件对材料间遗传距离的结果进行图形化展示，将材料间遗传距离为0的样品判定为相同单倍型，将材料间遗传距离小于0.04的样品判定为相近单倍型。

本发明提供上述方法在水稻种质资源鉴定及培育三系杂交稻中的应用。

本发明由于利用了多个标记进行目标区段的鉴定，比紧密连锁标记或单一的功能标记辅助选择更加准确，同时，本发明由于两端标记跨度大，相邻标记间距适中，可以准确鉴定导入片段的交换位点，克服连锁累赘问题，对于育种群体筛选更有指导意义。

附图说明

图1为分子标记在染色体上的分布示意图。左图为标记在基因组上的物理位置(参照日本晴基因组注释MSU6.1版)，右图为以目标基因Rf-1起始密码子ATG为参照的相对物理距离。图中垂直柱左侧数字为相对物理距离，右侧相应水平高度的符号为标记名称。

图2为四类标记典型检测效果图，(a)为标记TMRf1M07，(b)为标记Rfd11-2-R，(c)为标记d10-1，(d)为标记S80-2-R。横轴指示VIC荧光的信号水平，纵轴指示FAM荧光的信号水平；图中的圆点指示检测样品在特定的检测目标下出现的两种荧光水平，曲线代表了样品在每个循环中检测的两种荧光水平的变化趋势。图中I代表基因型为纯合子1，II代表基因型为纯合子2，III代表基因型为杂合子；黑色方框代表空白对照，“X”代表基因型不确定或者无扩增信号。

图3为Rf-1基因区段单倍型聚类图。其中，图3a为水稻各型CMS恢复系及参照系共22份，利用32个标记基因型聚类结果图；图3b为水稻各型CMS恢复系及参照系22份，利用3个基因片段测序分型聚类结果图。图下方的水平线是利用标记或序列评价材料间遗传距离的标尺，线上的数据是具体的距离值，聚类图中的水平线长度指示利用标记或序列评价材料间遗传距离大小，图右侧数值1-5指示的是聚类中选择一定的分类阈值之后的分类类别；“Z01”至“Z22”为材料代号。

图4为目标基因Rf-1导入片段分析示意图。左图为导入片段示意图：最左侧垂直线旁的数字为物理坐标，上方是四种基因型的形状注释，中心区域垂直柱显示的是该区段不同的重组个体的基因型，中间的横线指示标记的中心位置，垂直柱下方的符号为重组个体代号，重组个体代号下方连续的水平线指示个体中间具有相同亲本，再下方的符号指示重组个体的母本和父本。右图为导入片段区间多态性标记分布图：多态性标记在基因组上的物理位置(参照日本晴基因组注释MSU6.1版)，其中垂直柱左侧数字为物理位置，右侧相应水平高度的符号为标记名称。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecμlar cloning:a laboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 水稻CMS恢复基因Rf-1区段分子标记的设计

利用新一代测序技术(Illumina MiSeq测序仪)，对水稻野败型和包台型CMS恢复系亲本明恢63、红莲型CMS恢复系亲本9311、自主培育的优良恢复系G527和水稻野败型保持系亲本珍汕97进行全基因组平均20倍覆盖重测序，选定Rf-1基因及其上下游各200kb(遗传距离约1cM区间)范围，发掘变异位点。标记设计的具体步骤如下：

第一步，比对参考基因组，将各材料测序reads比对到Nipponbare基因组，使用软件BWA进行比对，参考基因组序列是MSU第6.1版Nipponbare的基因组序列。

第二步，鉴定筛选多态性位点，基于第一步的比对结果，使用软件SAMtools分析鉴定多态性位点，具体步骤如下:(1)位置碱基比对的质量值(MapQ值为50是特异性最强的reads，MapQ值小于40时将不会被采用)；(2)位置碱基测序的质量值大于或等于20；(3)位置碱基的杂合程度(碱基必须纯合)；(4)位置碱基的覆盖度(位点的覆盖度大于5小于1000)；(5)baseQ/BAQ的值小于15的位点不会被选定；(6)位置碱基的变异可能性Q值大于等于20。满足以上条件且变异位点周围的序列保守时，该位点将被用作开发标记的候选。

第三步，设计探针引物，将抽提包含候选变异位点的测序序列，利用Primer Express V3.0.1软件的TaqMan MGB Allelic Discrimination模块进行设计，如果软件给出设计结果，选择合适的探针、引物作为候选；否则，将序列转换为反向互补序列后，再次尝试设计，如果依然找不到合适的探针引物则视为标记设计未通过。如果一段序列上可以设计多个探针，则选择软件设计给出罚分最低的探针。以标记坐标平均分布的原则，在5个参考样品基因组重测序共线性的区段每10Kb设计一个标记，在平衡基因组之间的结构差异之后达到均匀分布。通过该方法在参考基因组坐标轴上设计32个成功分型的引物探针组，染色体上的物理位置跨度为18.69Mb-19.11Mb，其分布如图1所示。

获得的32个成功分型的引物探针组合，每组引物探针组合由一对引物及两条TaqMan-MGB探针组成，其序列分别如SEQ IDNO.1-128所示。组合命名规则为：首字段为标记的特异字段，区分不同的标记，如TMRf1M01、TMRf1M02、TMRf1M03等；后续字段为各组标记所包含的四条序列的特征字段，其中forward primer为引物对上游扩增引物、reverse primer为引物对下游扩增引物、TaqMan MGBProbe 1为探针序列1、TaqMan MGB Probe 2为探针序列2。

实施例2 水稻CMS恢复基因Rf-1区段OA芯片的制备

将实施例1获得的32个分子标记的128条序列SEQ ID No.1-SEQ ID No.128提交Life Technologies公司合成相应的引物和TaqMan-MGB探针，并制作OpenArray芯片，可同时检测96个样品。

实施例3 鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记在检测水稻DNA样品中的应用效果验证

为验证水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型鉴定方法，需要测试引物探针组合、OA芯片的实际检测及分型效果，通过比较设计参考的样品基因型与实际检测的基因型是否一致，从而判定引物探针组、OA芯片是否达到设计预期效果。该实施例具体步骤如下：

1.水稻基因组DNA提取：

根据检测需要从水稻种子、叶片等组织抽提基因组DNA，其中水稻幼嫩叶片DNA抽提采用Promega植物基因组抽提试剂盒标准流程抽提。

2.DNA样品质量检测：

用紫外分光光度计测量基因组DNA中蛋白质和有机物质污染水平，基因组DNA A260/280比值应在1.8-2.0之间，A260/230比值应在1.8-2.2之间，DNA工作液浓度10ng/μl。

3.基因型检测：

按照Life Technologies网站(http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/4478673.pdf)提供的标准操作方法进行操作，产生检测样品原始的基因型数据，即样品在特定位点上的基因型的型别，如纯合子1，纯合子2，杂合子或者无扩增杂交信号。

4.数据分析：

QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System仪器自带的分析软件，并根据图2所示的方式对标记的检测效果进行判读分类：(a)图相同类型圆点的聚类集中，不同类型圆点相互之间间距明显，呈现出直角平分之势，如标记TMRf1M07；(b)图不同类型圆点(或带曲线圆点)相互之间间距明显，呈现出直角平分之势，如标记Rfd11-2-R；(c)图不同类型圆点(或带曲线圆点)相互之间间距明显，呈现出锐角平分之势，如标记d10-1；(d)图不同类型圆点(或带曲线圆点)相互之间间距小，呈现出锐角平分之势，如标记S80-2-R。再经过缺失值的数据处理后，产生基因型数据，利用PowerMarker软件进行等位基因频率和材料间遗传距离的计算，并利用Mega5软件对材料间遗传距离的结果进行图形化展示。

5.结果解读——基因型检测鉴定结果与设计前基因型的比对：

使用水稻野败型和包台型CMS恢复系亲本明恢63，红莲型CMS恢复系亲本9311，自主培育的优良恢复系G527和水稻野败型保持系亲本珍汕97，以及芯片开发中参考基因型材料日本晴。参考上述4个步骤进行实验，聚类结果如图3b所示，图中Z01(明恢63)、Z14(9311)、Z21(G527)、Z22(日本晴)分别聚在第1、2、4和5类中，该结果表明32个引物探针组能区分三种类型恢复系和常规粳稻。

实施例4 Rf-OA芯片在鉴定种质资源Rf-1基因区段单倍型中的应用

种质资源是育种的基础，鉴定种质的基因资源是育种应用的重要途径。本发明收集的一套种质资源主要是育种中不同细胞质雄性不育类型的恢复系，具体信息见表1。

利用Rf-OA芯片，本发明对17份不同胞质类型恢复系Rf-1基因区段(18.69Mb-19.11Mb)进行了标记组合的单倍型鉴定并整合5份参考样品的标记基因型数据进行了分析，实验操作参见实施例2中第1步至第4步。

根据基因分型结果利用PowerMarker3.25对上述材料进行聚类分析，聚类结果用Mega5进行作图展示，结果(图3b)显示，可以分为5种主要的单倍型。由于上述材料都是育种过程中形成的自然群体，根据连锁不平衡的规律，一般认为水稻群体的连锁不平衡衰减距离在500kb，故区段内选取位点的基因型可以反映该区段内基因的单倍型，为验证上述分型与具体的3个基因座位的单倍型是否对应，再次利用Sanger测序方法进行了下列研究，将17份样品和5份参考样品在Rf-1基因区段(18.69Mb-19.11Mb)的3个基因座位Rf4/Rf1a/Rf1b基因区间LOC_Os10g35240(18760733..18764605)、LOC_Os10g35440(18880028..18882286)和LOC_Os10g35640(18985444..18988240)通过sanger测序，Mega5开展进化树分析(Tamura et al.,2011)，鉴定出3个基因的多种单倍型，其中，Rf4分为10种单倍型(Tang等，2014)：Rf4-1(比对参考样品明恢63，有恢复功能等位基因Rf4)，Rf4-2，Rf4-3，Rf4-4，Rf4-5(比对参考样品9311，无恢复功能等位基因rf4-j)，Rf4-6，Rf4-7，Rf4-8，Rf4-9，Rf4-10(比对参考样品日本晴，无恢复功能等位基因rf4-j)；Rf1a分为3种单倍型(Wang等，2006；Komori等，2004)：Rf1a-1(比对参考样品明恢63和9311，有恢复功能等位基因Rf1a),Rf1a-2,Rf1a-3(比对参考样品日本晴，无恢复功能等位基因rf1a)；rf1b分为7种单倍型(Wang等，2006)：Rf1b-1(比对参考样品明恢63，有恢复功能等位基因Rf1b)，Rf1b-2，Rf1b-3，Rf1b-4，Rf1b-5，Rf1b-6，Rf1b-7(比对参考样品9311，无恢复功能等位基因rf1b)，详细结果见表1。3个基因组合分类，以3个基因位点测序拼接序列为数据，利用Mega5对上述材料进行聚类分析，结果见图3a，根据参考样品在已有报道中该区段的功能特征，进一步划分为5个类别。利用标记分型(图3b)和利用基因测序分型(图3a)具有相近的分类趋势，参考代表品系的3个基因座位的已知基因型，可以划分为：1、野败CMS恢复系亲本明恢63(Z01Rf4/Rf1a/Rf1b)代表群，三个恢复基因均为有功能的单倍型；2、红莲型CMS恢复系亲本9311(Z14rf4-i/Rf1a/rf1b)代表群，仅Rf1a恢复基因均有功能的单倍型；3、其他类群(Rf1b)，仅知道Rf1b为有功能的单倍型；4、自主培育的恢复系G527(Z21)，恢复基因为新型的功能的单倍型；5、Nip(Z22rf4-j/rf1a/rf1b)代表群，三个恢复基因均为无功能的单倍型。基于基因序列聚类(图3a)与标记单倍型聚类(图3b)，结果显示其有类似的分类趋势，表明利用区段单倍型能够反映功能基因位点序列的单倍型。

分类结果中，多数材料被归为了野败CMS恢复系类群，这与当前利用野败CMS不育系以及多数其他类型的不育系与野败CMS不育系具有类似的恢保关系有关，另外，还有一些不能确定对应功能的单倍型资源成为探索研究的新材料。

表1三个恢复基因测序分析分类结果

水稻CMS恢复基因Rf-1检测方法在鉴定种质资源区段单倍型时，能够确定不同材料之间有多态性的标记，从而方便地转换为单标记，利于群体改良过程中大规模前景筛选。再者，单倍型分析能够了解区段在多样性材料中的单倍型分类状况，辅助决策遗传改良的对象，缩减重复工作的数量，利于扩大育种改良的有效性。

实施例5 Rf-OA芯片在遗传改良培育三系中的应用

利用覆盖422kb范围的标记组构建的OpenArray芯片可以快速将交换位点锁定到平均20kb左右的范围，辅助选择更加小而有效的导入事件进行后续育种，进而大大地降低连锁累赘的影响，提升育种效率。

通过两个远端SSR标记筛选9311(轮回亲本)与R1128(目标Rf1恢复基因区段供体亲本)的BC1F1群体，发现173份重组单株，接着利用Rf-OA芯片检测了上述重组单株。基因型鉴定的实验操作参见实施例2中第1步至第3步。断点分析按照以下4步进行：第1步，校对原始基因型，比较每个标记在双亲之间的多态性，将有多态性的标记数据保留下来；第2步，基因型转换，根据被转育材料基因型记为A，转育材料基因型记为B，杂合基因型记为H的原则进行基因型转换；第3步，依照以下规则作图，对应参考基因组相邻的标记为同样的基因型时，将两者之间的区间认定为与两个相邻标记具有相同的基因型；对应参考基因组相邻的标记为不同的基因型时，将两者之间的区间认定为不确定基因型，即重组交换区间或断点区间；第4步，将多态性标记及对应坐标等信息加载到图中，如图4所示，其中左斜线方框所所示为被转育的材料基因型，右斜线方框所示为转育材料基因型；左右斜线交叉方框表示杂合状态基因型，空白方框表示位置基因型区间，即重组交换或断点区间。

在检测的转育后代材料中，一共找到37份在Rf-OA标记覆盖范围内的交换，均为单交换。具体结果从断点区间的分布来看，几乎覆盖了在整个标记区间，间距从3kb-120kb不等，图中仅展示了部分有多态性的标记(图4)。举例说明，代号为NIL01的单株，基因型结果为除一个标记Rfd14-3-R(SEQ ID No.125-128)为A(左斜线方框)以外，其他多态性标记均为H(左右斜线方框)，与其紧邻的标记Rfd11-2-R(SEQ ID No.117-120)，参考断点分析步骤第3步，Rfd14-3-R(SEQ ID No.125-128)与Rfd11-2-R(SEQ ID No.117-120)两个标记之间的区间用空白方框表示未知基因型，即断点区间，从图中可知两标记之间从19085kb-19119kb，相距34kb，即未知基因型的断点区间在大约34kb。图中展示的结果表明，针对少量标记辅助选择的个体进行区段的精细基因型鉴定是必要的，它可以减少含有不利连锁基因的单株进入后续育种环节，避免了育种资源的浪费。区段密集的标记鉴定相比单一的分子连锁标记鉴定更能保证目的基因不丢失，相比功能标记而言，更利于将可能的连锁累赘减少到最低，为后续的育种提供更加合适的候选单株。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记，其特征在于，其为在Rf-1基因及其上下游物理距离200kb区段内的分子标记。

2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，该分子标记是由以下引物扩增得到，所述引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1-2或SEQ ID NO.5-6或SEQ ID NO.9-10或

SEQ ID NO.13-14或SEQ ID NO.17-18或SEQ ID NO.21-22或

SEQ ID NO.25-26或SEQ ID NO.29-30或SEQ ID NO.33-34或

SEQ ID NO.37-38或SEQ ID NO.41-42或SEQ ID NO.45-46或

SEQ ID NO.49-50或SEQ ID NO.53-54或SEQ ID NO.57-58或

SEQ ID NO.61-62或SEQ ID NO.65-66或SEQ ID NO.69-70或

SEQ ID NO.73-74或SEQ ID NO.77-78或SEQ ID NO.81-82或

SEQ ID NO.85-86或SEQ ID NO.89-90或SEQ ID NO.93-94或

SEQ ID NO.97-98或SEQ ID NO.101-102或

SEQ ID NO.105-106或SEQ ID NO.109-110或

SEQ ID NO.113-114或SEQ ID NO.117-118或

SEQ ID NO.121-122或SEQ ID NO.125-126。

3.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，该分子标记是由32组引物经PCR扩增得到，32组引物序列分别为

SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.5-6和SEQ ID NO.9-10和

SEQ ID NO.13-14和SEQ ID NO.17-18和SEQ ID NO.21-22和

SEQ ID NO.25-26和SEQ ID NO.29-30和SEQ ID NO.33-34和

SEQ ID NO.37-38和SEQ ID NO.41-42和SEQ ID NO.45-46和

SEQ ID NO.49-50和SEQ ID NO.53-54和SEQ ID NO.57-58和

SEQ ID NO.61-62和SEQ ID NO.65-66和SEQ ID NO.69-70和

SEQ ID NO.73-74和SEQ ID NO.77-78和SEQ ID NO.81-82和

SEQ ID NO.85-86和SEQ ID NO.89-90和SEQ ID NO.93-94和

SEQ ID NO.97-98和SEQ ID NO.101-102和

SEQ ID NO.105-106和SEQ ID NO.109-110和

SEQ ID NO.113-114和SEQ ID NO.117-118和

SEQ ID NO.121-122和SEQ ID NO.125-126所示。

4.用于鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的引物探针组合，其特征在于，由32组引物探针组合构成，每组引物探针组合由一对引物及两条TaqMan-MGB探针组成，其序列分别如SEQ ID NO.1-128所示。

5.一种用于水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型鉴定的芯片，为OpenArray芯片，其特征在于，该芯片含有32组引物探针组合，每组引物探针组合由一对引物对及两条TaqMan-MGB探针组成，其序列分别如SEQ ID NO.1-128所示。

6.权利要求1至3任意一项所述的分子标记或权利要求4所述的引物探针组合或权利要求5所述的芯片在水稻种质资源鉴定中的应用。

7.权利要求1至3任意一项所述的分子标记或权利要求4所述的引物探针组合或权利要求5所述的芯片在培育三系杂交稻中的应用。

8.一种水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的鉴定方法，其特征在于，利用权利要求1至3任意一项所述的分子标记或权利要求4所述的引物探针组合或权利要求5所述的芯片，采用PCR方法进行水稻基因型鉴定，将所得结果与参照样品进行比较，如果与参照样品基因型完全一致，则具有参照样品的单倍型。

9.权利要求8所述方法在水稻种质资源鉴定中的应用。

10.权利要求8所述方法在培育三系杂交稻中的应用。