CN101805783B - 植原体探针、基因芯片以及检测植原体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植原体探针，包含该探针的基因芯片以及利用该基因芯片检测植原体的方法。该植原体探针为针对11种植原体的特异性探针，点样制成基因芯片，检测植原体包括以下步骤：植物DNA样品提取；利用通用引物对样品特异性片段扩增并对产物进行标记；杂交：将待测标记的样品加入杂交缓冲液中，混匀成杂交混合液，将混合液滴加入基因芯片的杂交区域，放入杂交盒杂交；取出杂交后的芯片并干燥后，进行扫描及数据分析，判断样品中有无植原体的存在。利用本发明的探针制成的基因芯片可快速、高效、高通量检测11种植原体。

Description

植原体探针、基因芯片以及检测植原体的方法

技术领域

本发明涉及植原体的检测领域，尤其是指植原体探针、包含该探针的高通检测基因芯片以及利用该基因芯片检测植物样品中是否含有植原体的方法。

背景技术

1967年，日本科学家首次利用电子显微镜观察有丛枝症状的桑树、矮牵牛、马铃薯和泡桐等4种植物韧皮部筛管细胞中存在形态结构类似动物菌原体的微生物，但不能用菌原体培养基人工培养及不能感染动物，将其称之为类菌原体(Mycoplasma-likeorganism，MLO)。在1992年的第九届国际菌原体组织(IntemationalOrganizationforMycoplasmology，IOM)大会上，首次提出了用植原体(phytoplasma)作为这类原核生物的新名称和暂定的属名(Phytoplasmasp)。是一类无细胞壁，不能人工培养，存在于植物韧皮部筛管细胞中类似细菌的原核生物，隶属于软壁菌门，柔膜菌纲，植原体属。主要由韧皮部取食的昆虫传播，包括叶蝉、飞虱和蚜虫，常常引起植株黄化、变叶、丛枝，而且被它侵染的植物一旦发病无特效药可治，严重危害粮食、棉花、油料、花卉、药材、蔬菜、果树、橡胶、桑、竹等许多粮食作物、经济作物以及林木和特种珍贵树种，对农业经济造成巨大损失，对人类生活造成重大影响。

自1967年发现由植原体引起的病害以来，全世界已报道有多种植物(其中主要是木本植物)受到该类病原物的侵染，它所引起的病害已遍布世界各地。目前世界各地先后报道的植原体病害达700多种，我国也报道了70余种，且有不断增加的趋势。在我国，由植原体引起的植物黄化型病害已早有记载，江南流行的桑树萎缩病，古时称“桑癃”，在明末的《沈氏农书·运田地法》中即有“凡桑一癃，在无医法，断不可留者”的记载，证明我国劳动人民对这类病害的性质很早就有所认识，我国是发现植原体病害较多的国家，最近统计的中国植原体类病共有74种植原体，上世纪50-70年代，桑树萎缩病严重危害了江苏、浙江两省的桑树种植，造成养蚕业的重大经济损失，据调查，我国现有11个省的250万亩桑园受此病害为害，约占全国桑园总面积的25％，每年造成桑树约10％的经济损失。在河南、山东等地发生的泡桐丛枝病，曾使人工种植林难以发展，1989年泡桐主产区河南省的丛枝病发病面积达504万亩，致使桐树木材年生长量减少约23万立方米。1990年通过对河南、山东等8省的调查显示，我国泡桐丛枝病发病面积达88万公顷，每年造成直接经济损失超过亿元。枣疯病一直是枣树上一种难防治的毁灭性病害，据1989年统计，全国已有18个省、市有枣疯病的分布和为害，枣树主产区的河北、河南等五省发生最为普遍，感病枣树结果小，果实品质下降或不产枣，感病植株在几年内慢慢衰退死亡。

植原体病害主要通过无性繁殖材料、种苗或昆虫介体传播，很少或不能种子传毒。带病种苗能非常有效地通过高温或抗菌素处理而脱掉病原。故及早发现感病植物中植原体的存在，及早采取相应的措施，将带毒植物予以铲除，杜绝侵染来源，对该类病害的防治具有重要意义。带毒植物的早期诊断是防治植原体病害的重要措施之一。

近年，随着城市发展建设和人们生产、生活的需要，我国每年都要从国外引进大量花卉、种苗。在新修订并公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，就有14种植原体列入进境检疫性有害生物名录，包括桤树黄化植原体(Alderyellowsphytoplasma)、白蜡树黄化植原体(Ashyellowsphytoplasma)、蓝莓矮化植原体(Blueberrystuntphytoplasma)、澳大利亚植原体候选种(CandidatusPhytoplasmaaustraliense)、葡萄金黄化植原(Grapevineflavescencedoréephytoplasma)、澳大利亚植原体候选种、苹果丛生植原体(Appleproliferationphytoplasma)、梨衰退植原体(Peardeclinephytoplasma)、桃X病植原体(PeachX-diseasephytoplasma)、杏退绿卷叶植原体(Apricotchloroticleafrollphtoplasma)、椰子致死黄化植原体(Coconutlethalyellowingphytoplasma)、榆韧皮部坏死植原体(Elmphloemnecrosisphytoplasma)、来檬丛枝植原体(Limewitches’broomphytoplasm)、马铃薯丛枝植原体(Potatowitches’broomphytoplasma)、草莓簇生植原体(Strawberrymultiplierphytoplasma)。

由于植原体既不象真菌、细菌那样容易培养，也不象病毒易于提纯，植原体自发现后的10多年里，其检测技术的发展一直没有大的突破，严重阻碍了植原体的分类及诊断防治工作的进程。在确定一种植物病害是否由植原体引起时，传统方法一般先根据病害症状初步推测，然后对植物注射或喷洒植原体敏感的四环素类物质，若症状受到抑制，就进一步说明病原物可能是植原体，最后均通过电子显微镜观察加以确定。该方法费时费力，结果往往也不是很可靠。80年代以来，随着血清学、分子探针以及PCR技术的发展应用，为植原体的检测提供了相对简单、灵敏、可靠的检测方法。Lin于1985年首次报道翠菊黄花病植原体的单克隆抗体制备成功之后，目前已经成功制备了多种植原体的单克隆抗体，建立特异性和灵敏性较高的血清学检测方法。但由于植原体在植株体内含量低、大小不均一、易破碎、不能人工培养等自身的许多特点，导致很难制备出高效价的抗血清，国际上尚无商品化血清出售，多克隆抗体易与健康植株的抗原产生强烈的交叉反应，这无疑大大限制了该法的推广应用。1987年KIRKPATRICK等利用重组DNA技术首次报道了西方X病植原体DNA成功的分离和克隆，并创立了灵敏的杂交(点杂交)分析法用于植原体的检测。短短的几年时间里，利用植原体DNA随机克隆片段作为探针，建立灵敏、可靠的核酸杂交技术已成功用于多种植原体的检测，也成功地应用于植原体的区分及其分布和生态学的控制。PCR技术也即聚合酶链式反应自90年代以来被广泛用于生物学各个领域，同样也被用于植原体的检测中来。基于保守序列，如16SrRNA基因、核糖体蛋白基因、延伸因子、16S-23S间隔区域和其他保守的染色体基因或DNA序列而设计的通用引物或特异性引物可用来检测与植原体相关的病害。而且近几年，在此基础上发展的巢式PCR、免疫-捕获PCR、循环PCR、荧光实时PCR等技术提高了检测的灵敏度、准确度。而上述这些方法都难以实现高通量、快速准确的检测，难以实现大批量样品的检测、多类植原体的比较分析以及植原体蛋白质相互作用的分析。基因芯片具有高通量特性，正好符合这一需要。

基因芯片技术被誉为具有划时代意义的“革命性技术”，作为一种检测手段，其具有灵敏度高、特异性强和高通量等特性。基因芯片用于检测已有不少理论和应用成果，但主要集中在人类疾病诊断等方面，将基因芯片用于植物植原体检测还未见报道。

目前，我国检验检疫部门对进境植原体尚未建立有效的检测方法，在入境口岸的检疫实践中，还无法对相关检疫物进行植原体的检测，因此，在一线入境口岸建立植原体的检测技术平台，把好植检关口极其重要。而把好植检关口的关键在于建立准确快速，大批量货物的集成化检测的方法以满足快速通关的要求。能够在第一时间将为国家带来严重损失的植原体拒之国门之外。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供多种植原体探针，包含该探针的基因芯片，以及利用该基因芯片检测植原体的方法，解决现有技术不能同时、迅速、高通量地检测多种植原体问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：探针，针对选自序列表中SEQ ID NO.1-11的11种植原体中至少一种植原体的16sRNA核苷酸序列，所述的探针序列选自表1中对应植原体的至少一条特异性探针序列。

对应所述每种植原体的特异性探针为2-9条，每种植原体的特异性探针序列及熔解温度如表1。

基因芯片，包含如上所述的探针。

所述芯片还包含阴性对照和阳性对照，阴性对照探针选取一段人类基因的保守序列如序列表中SEQ ID NO.17-20，与植原体序列没有同源性，阴性对照探针如表1中H28302128、H34916057、H4504152、H47060296对应的序列；外参照阳性对照探针分别来自于5个小鼠管家基因序列如序列表中SEQ ID NO.12-16，所述阳性对照探针如表1中M3116F01、M3116F10、M3116E05、M3116D01、M3157F03对应的序列。

该基因芯片包括上下两个重复的点样区，每个独立的点样区包括四个小矩阵，每个矩阵包括8行19列共152个探针点，其中每一列为同一个探针的重复。

每个独立的点样区中探针点样如图2及表3所示，所述芯片基质选自玻片、硅片、金属片或膜中的一种。

一种利用上述基因芯片检测植原体的方法，包括以下步骤：

(1)植物DNA样品提取；

(2)利用通用引物对样品特异性片段扩增并对产物进行标记；

(3)杂交：将待测标记的样品加入杂交缓冲液中，混匀成杂交混合液，将混合液滴加入基因芯片的杂交区域，放入杂交盒杂交；

(4)取出杂交后的芯片并干燥后，进行扫描及数据分析，判断样品中有无植原体的存在。

检测植原体的方法中，第(2)步扩增及标记包括以下工艺步骤：

1)PCR扩增：

其中特异性扩增反应体系：

DNA样品                       0.1μg

扩增引物对                    1μL

10×PCR Buffer                2μL

2.5mM d(AGT)TP mix            2μL

0.25mM dCTP                   2μL

25μM Cy3-dCTP                2μL

rTaqase                       0.3μL

加灭菌水至终体积              20L

特异性扩增反应条件：95℃×5分钟；95℃×15秒，55℃×15秒，72℃×15秒共40个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却；

2)采用QIAquick PCR Purification Kit纯化扩增标记产物，步骤如下：

a)加入5倍体积的Buffer PB，混匀后，转移到mini spin纯化柱中；

b)离心13000rpm×1分钟，弃收集套管中的液体；

c)加入500μL缓冲液PE，离心13000rpm×1min，弃收集套管中的液体；

d)重复操作c)一次；

e)不加试剂，离心13000rpm×1min，弃去收集套管，换成1.5ml的离心管；

f)加入Buffer EB 40μL，离心13000rpm×1min；

g)再加入Buffer EB 20μL，离心13000rpm×1min，合并纯化产物。

检测植原体的方法中，步骤(2)中所用扩增引物结构如表2所示的通用引物，其中针对序列表SEQ ID NO.1-2，以及SEQ ID NO.4-11的10种植原体的6对通用扩增引物为：Sense1、Antisense1、Sense2、Antisense2、Sense3、Antisense3、Sense4、Antisense4、Sense5、Antisense5、Sense6、Antisense6；针对序列表中SEQ ID NO.3的葡萄金黄色植原体，编号AY197663的扩增引物为：76631sense、76631antisense、76632sense、76632antisense；阳性对照为外参照通用引物1和2。

检测植原体的方法中，第(3)步骤杂交工艺进一步包括以下步骤：

1)预杂交或预处理：将芯片放入盛有预杂交缓冲液的染色缸中进行预处理20-30分钟，之后取出芯片并吹干表面；

2)杂交：将标记好的样品抽干后重溶于3μL灭菌水，95℃水浴变性5分钟，冰上冷却5分钟，加入32μL杂交缓冲液，混匀成杂交混合液，将混合液滴加入基芯片的杂交区域，盖上盖玻片，将芯片放入杂交盒进行杂交处理；

3)洗片：杂交结束后取出芯片，放入盛有去离子水的染色缸中洗片，再放入盛有洗脱液的染色缸中洗片，之后取出芯片并吹干表面。

本发明的有益效果如下：本发明的特异性探针针对11种植原体具有较强的特异性，利用所述探针点样制用基因芯片，能快速、高效、高通量检测植原体，有效地解决了现有检测方法存在的问题，弥补了现有检测方法的缺陷。

本发明的基因芯片及其检测方法，具有高度的特异性，检出率可高达99.99％，一次杂交可检测2种以上，最多达11种待检植原体，能够适应高通量检测的要求。利用该芯片可以在数小时内完成对待测样品中多种植原体的杂交检测。另外，基于芯片检测结果的分析容易与计算机图像处理和定量分析软件结合，对检测结果输出规范化。

附图说明

图1是本发明基因芯片上一个小矩阵示意图。

图2是本发明基因芯片一个点样区的探针排列模式图。

图3是本发明基因芯片检测广州桑树植原体探针混合杂交信号扫描图。

图4是本发明芯片针对广州桑树植原体的多条探针杂交检测结果比较。

具体实施方式

本发明的基因芯片可以用于以下11种植原体的检测：椰子致死黄化类菌原体Coconut lethal yellowing MLO(Lethal yellowing disease of coconut Plant)，编号：DQ645636；苹果丛生植原体apple proliferation Phytoplasma，编号：AF248958；榆树黄化植原体Elm yellow Phytoplasma，编号：AF122910；葡萄金黄色植原体Grapevine flavescence dore′e Phytoplasma，编号：AY197663；桃X植原体Peach X Phytoplasma，编号：L33733；梨衰退植原体Pear declinePhytoplasma，编号：DQ011588；甘蔗白叶植原体Sugarcane white leafPhytoplasma，编号：AB052874；番茄顽固植原体Tomato stolbur Phytoplasma；tomato big-bud disease，编号DQ387052；柑桔顽固螺原体Citrus stubbornnSpiroplasma，编号：AM157769；广州桑树植原体Mulberry dwarf phytoplasma 16Sribosomal RNA gene，partial sequence；16S-23S intergenic spacer and tRNA-Ile gene，complete sequence；and 23S ribosomal RNA gene，partial sequence，编号：AY685056；云南泡桐丛枝病植原体Paulownia witches′-broom phytoplasma clonePaWB-Qujing 16S ribosomal RNA gene，partial sequence，编号：AY647460。该11种植原体的16sRNA序列具体参照系列表SEQ ID NO.1-11。

本发明的基因芯片包含至少一种植原体的特异性探针，也可包含上述十一种植原体的特异性探针，以下实例中以包含上述11种植原体的特异性探针。本发明的基因芯片还包含阴性对照和阳性对照，阴性对照探针选取了一段人类基因的保守序列，与植原体序列没有同源性；外参照阳性对照探针分别来自于5个小鼠管家基因序列。

请同时参照图1及图2，本发明的基因芯片规格为上下两个重复的点样区，可以同时完成两次样品检测。每个独立的点样区包括四个小的矩阵，每个矩阵包括8行19列共152个探针点，其中每一列为同一个探针的重复(即8次重复)，本实施例中，探针的具体点样排列见表3，但不限于表3的位置分布，可以根据实际需要进行排列。

本发明的基因芯片基质选自玻片、硅片、金属片和膜，优选为玻片。本发明的实施例中采用Fullmoon公司生产的PowerMatrix oligo芯片片基。

本发明通过Genebank获得上述11种植原体的16sRNA核苷酸序列，进而进行保守序列分析，从而对每种植原体设计相应的1对引物和2-9条特异性探针来制备本发明的基因芯片。这些探针选自根据包含上述11种植原体的16sRNA的核苷酸序列进行保守性序列分析而设计的探针，其中针对11种植原体(以对应的编号来描述)的特异性探针为：AB052874的特异性探针有AB052874-1、AB052874-2、AB052874-5、AB052874-6、AB052874-7、AB052874-8的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1-2的第2-3列，矩阵3-4的第2列；针对AF122910有AF122910-2、AF122910-5、AF122910-6、AF122910-7的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1-2的第4列，矩阵3-4的第3列；针对AF248958的特异性探针序列有AF248958-2、AF248958-5、AF248958-6、AF248958-7、AF248958-8、AF248958-9、AF248958-10的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1的第5-6列，矩阵2的第5列，矩阵3-4的第4-5列；针对AM157769的特异性探针有AM157769-2、AM157769-4、AM157769-5、AM157769-6、AM157769-7、AM157769-8的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1的第7列，矩阵2-3的第6-7列，矩阵4的第6列；针对AY197663的特异性探针序列有AY197663-11、AY197663-12、AY197663-21、AY197663-22的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1-3的第8列，矩阵4的第7列；针对AY647460的特异性探针序列有AY647460-2、AY647460-4、AY647460-5、AY647460-6、AY647460-7的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1-3的第9列，矩阵4的第8-9列；针对AY685056的特异性探针序列有AY685056-1、AY685056-2、AY685056-4、AY685056-5、AY685056-6、AY685056-8、AY685056-9、AY685056-10、AY685056-11的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1的第10-12列，矩阵2-4的第10-11列；针对DQ011588的特异性序列有DQ011588-2、DQ011588-5、DQ011588-6、DQ011588-7、DQ011588-8、DQ011588-9、DQ011588-11的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1的第13列，矩阵2-4的第12-13列；针对DQ387052的特异性探针序列有DQ387052-1、DQ387052-2、DQ387052-5、DQ387052-6、DQ387052-7、DQ387052-8的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1-2的第14-15列，矩阵3-4的第14列；针对DQ645636的特异性探针序列有DQ645636-4、DQ645636-5、DQ645636-7、DQ645636-8、DQ645636-9、DQ645636-10的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1-2的第16列，矩阵3-4的第15-16列；针对L33733的特异性探针序列有L33733-2、L33733-3、L337334、L33733-5、L33733-7、L33733-8的核苷酸序列，点样位置如表3中所示矩阵1-2的第17-18列，矩阵3-4的第17列。这些特异性探针的核苷酸序列为其对应的植原体核苷酸序列的一部分，具体见下表1所示；而阴性对照的人类基因的保守序列如序列表中SEQ ID NO.17-20，阴性对照探针选自其对应的人类保守序列中的一段，具体见表1中H28302128、H34916057、H4504152、H47060296对应的序列，点样位置如表3中所示矩阵1-4的第1列。阳性对照的5个小鼠管家的基因序列如序列表中SEQ ID NO.12-16，阳性对照的探针选自其对应的5个小鼠管家的基因序列中的一段，具体见表1中M3116F01，M3116F10，M3116E05，M3116D01，M3157F03对应的序列，点样位置如表3中所示矩阵1-2的第19列，矩阵3的第18-19列，矩阵4的第1列。矩阵4的第19列为空白孔。

表1 11种植原体及阴阳对照的特异性探针序列

本发明的基因芯片可以通过以下步骤制备：首先通过Genebank获得上述11种植原体的16sRNA核苷酸序列，进而进行保守序列分析，从而针对11种植原体分别合成2-9条特异性探针，探针序列见上表1。将合成好的探针溶解于1×点样缓冲液(购自Fullmoon biosystems)中，探针浓度为20μM。芯片生产使用Amersham pharmacia公司生产的芯片点样仪(GenIII Array spotter)，片基采用Fullmoon公司生产的PowerMatrix oligo芯片片基，按照标准的oligo芯片生产工艺生产。各条探针重复点样；点样完毕之后，干燥，之后用SDS漂洗，再用双蒸水漂洗，最后室温凉干。制备好的芯片放于4摄氏度冰箱保存备用。具体各探针在基片上的排列模式、排列方式见图1、图2以及下页表3。

另外，根据11种植原体的16sRNA核苷酸序列，设计并合成针对除葡萄金黄色植原体(编号AY197663)外其他10种植原体的6对通用扩增引物为：Sense1、Antisense1、Sense2、Antisense2、Sense3、Antisense3、Sense4、Antisense4、Sense5、Antisense5、Sense6、Antisense6；针对AY197663的扩增引物为：76631sense、76631antisense、76632sense、76632antisense。阳性对照为外参照通用引物1和2。引物的具体序列见下表2：

表2 11种植原体及阳性对照的通用引物序列表

用本发明基因芯片测样品中植原体的方法，主要包括以下步骤：

1)植物RNA提取：取1-2g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5mL离心管中，用常规CTAB法提取样品总RNA，具体操作步骤如下：

(a)检测样品置于液氮中进行研磨，加入预热至65℃的适当体积的CTBA裂解液，温育60分钟，不时混匀；

(b)向裂解液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提，4℃、7500g离心5分钟。

(c)回收上层水相加入1/10体积预热至65℃的CTBA/NaCl溶液混匀，用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提，4℃、7500g离心5分钟，回收上清液。

(d)加入等体积CTBA沉淀液，65℃温育30分钟，4℃、500g离心5分钟。

(e)去上清，以高盐TE缓冲液重悬沉淀，待沉淀溶解后加入0.6体积的异丙醇沉淀，4℃、7500g离心15分钟。

(f)加入1毫升75％乙醇悬起沉淀，7500g离心5分钟，弃上清，室温晾干。

(g)加入适量灭菌水溶解沉淀，测定DNA样品浓度和总量，样品保存于-20℃归档。

2)植原体特异性片段扩增：提取的样品DNA采用PCR扩增方法进行标记，外参照阳性对照质粒样品按等量混合后，利用通用引物进行PCR扩增，并在PCR扩增过程加入标记的Cy3-dCTP同时对产物进行标记，采用QIAquick PCRPurification Kit纯化扩增标记产物，即得待测样品：

(1)PCR扩增：

特异性扩增反应体系(20μL)：

DNA样品                          0.1μg

扩增引物对(5μM)                1μL

10×PCR Buffer                  2μL

2.5mM d(AGT)TP mix              2μL

0.25mM dCTP                     2μL

25μM Cy3-dCTP                  2μL

rTaqase                         0.3μL

加灭菌水至终体积                20μL

特异性扩增反应条件：95℃×5分钟；95℃×15秒，55℃×15秒，72℃×15秒共40个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却。具体地讲：PCR反应采用40循环，杂交前变性反应条件为95度变性5min，退火温度为55℃，退火时间为15S，72℃延伸15S，循环结束后72℃延伸反应5min。

(2)采用QIAquick PCR Purification Kit纯化扩增标记产物，步骤如下：

a)加入5倍体积的Buffer PB，混匀后，转移到mini spin纯化柱中；

b)离心13000rpm×1分钟，弃收集套管中的液体。

c)加入500μL缓冲液PE，离心13000rpm×1min，弃收集套管中的液体。

d)重复操作(c)一次。

e)不加试剂，离心13000rpm×1min，弃去收集套管，换成1.5ml的离心管。

f)加入Buffer EB 40μL，离心13000rpm×1min；

g)再加入Buffer EB 20μL，离心13000rpm×1min，合并纯化产物。

3)杂交

(1)预杂交或预处理

将芯片放入片夹(小片夹最多能放6张玻片)，向染色缸中倒入200-250毫升预杂交缓冲液，将片夹放入染色缸，置于摇床上于室温缓慢摇晃20-30分钟；取出片夹，取出玻片立刻甩干，同时用气罐轻轻吹干表面直至玻片完全干燥。预杂交缓冲液是市售的产品，本发明的预杂交缓冲液购自Fullmoon biosystems，其主要成分是：6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt，100ug/ml鲑鱼精DNA。预杂交目的是封闭芯片上能与DNA非特异性结合位点，阻断检测样本中可能与芯片上探针产生非特异性结合的位点。

(2)杂交

将标记好的待测样品(检测样品，阳性对照或混合样品)抽干后重溶于3μL灭菌水，95℃水浴变性5分钟，冰上冷却5分钟，加入32μL杂交缓冲液，混匀成杂交混合液，将混合液滴加入芯片的杂交区域，芯片上每个独立的杂交区域可以加上15μL杂交混合液，盖上盖玻片，将芯片放入杂交盒，并在底部加上少量灭菌水保湿，用封口膜密封杂交盒，置于48℃孵箱中水平摇床上缓慢摇晃2小时。交缓冲液是市售的产品，本发明所用的杂交缓冲液也是购自Fullmoon biosystems，其主要成分是：6×SSC，0.01mol/l的EDTA，0.5％SDS，5×Denhardt，100ug/ml鲑鱼精DNA。

(3)洗片

杂交结束后，取出玻片放于片夹上，将片夹放入预先放满去离子水的染色缸中，让盖玻片垂直并自然滑落；取出片夹，迅速放入另一个预先盛有200-250毫升洗脱液I(0.1％SSC)的染色缸中，将染色缸置于摇床上于室温缓慢摇晃20分钟；取出片夹，再重复洗涤一次后，取出玻片立刻甩干，同时用气罐轻轻吹干表面直至玻片完全干燥。

4)扫描

玻片完全干燥后，放入扫描片夹中，利用扫描仪(晶芯LuxScan 3.0，北京博奥)进行扫描，扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号(GenePix Pro6.0)，随后进行数据分析和处理。Cy3标记用532nm激光管扫描，Cy5标记用635nm激光管扫描，PMT为900。

5)数据分析，判断样品中有无植原体的存在。

例一

以检测广州桑树植原体为例进一步说明本发明的基因芯片检测样品步骤，样品检测步骤如下：

1)植物RNA提取：取1-2g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5mL离心管中，用常规CTAB法提取样品总RNA。

2)植原体特异性片段扩增：提取的样品DNA采用PCR扩增方法进行标记，外参照阳性对照质粒样品按等量混合后利用通用引物进行PCR扩增和标记：

(1)PCR扩增：

特异性扩增反应体系(20μL)：

DNA样品                           0.1μg

扩增引物对(5μM)                  1μL

10×PCR Buffer                    2μL

2.5mM d(AGT)TP mix                2μL

0.25mM dCTP                       2μL

25μM Cy3-dCTP                    2μL

rTaqase                     0.3μL

加灭菌水至终体积            20μL

特异性扩增反应条件：95℃×5分钟；95℃×15秒，55℃×15秒，72℃×15秒共40个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却。

(2)采用QIAquick PCR Purification Kit纯化扩增标记产物，步骤如下：

a)加入5倍体积的Buffer PB，混匀后，转移到mini spin纯化柱中；

b)离心13000rpm×1分钟，弃收集套管中的液体。

c)加入500μL缓冲液PE，离心13000rpm×1min，弃收集套管中的液体。

d)重复操作(c)一次。

e)不加试剂，离心13000rpm×1min，弃去收集套管，换成1.5ml的离心管。

f)加入Buffer EB 40μL，离心13000rpm×1min；

g)再加入Buffer EB 20μL，离心13000rpm×1min，合并纯化产物。

3)杂交

(1)预杂交或预处理

将芯片放入片夹(小片夹最多能放6张玻片)，向染色缸中倒入200-250毫升预杂交缓冲液，将片夹放入染色缸，置于摇床上于室温缓慢摇晃20-30分钟；取出片夹，取出玻片立刻甩干，同时用气罐轻轻吹干表面直至玻片完全干燥。

(2)杂交

将标记好的探针抽干后重溶于3μL灭菌水，95℃水浴变性5分钟，冰上冷5分钟，加入32μL杂交缓冲液(Fullmoon公司提供)，混匀。芯片上每个独立的杂交区域可以加上15μL杂交混合液，盖上盖玻片，将芯片放入杂交盒，并在底部加上少量灭菌水保湿，用封口膜密封杂交盒，置于48℃孵箱中水平摇床上缓慢摇晃2小时。

(3)洗片

杂交结束后，取出玻片放于片夹上，将片夹放入预先放满去离子水的染色缸中，让盖玻片垂直并自然滑落；取出片夹，迅速放入另一个预先盛有200-250毫升洗脱液I(0.1％SSC)的染色缸中，将染色缸置于摇床上于室温缓慢摇晃20分钟；取出片夹，再重复洗涤一次后，取出玻片立刻甩干，同时用气罐轻轻吹干表面直至玻片完全干燥。

4)扫描

玻片完全干燥后，放入扫描片夹中，利用扫描仪(晶芯LuxScan 3.0，北京博奥)进行扫描，扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号(GenePix Pro6.0)，随后进行数据分析和处理。Cy3标记用532nm激光管扫描，Cy5标记用635nm激光管扫描，PMT为900。

5)数据分析：扫描结果见图3，其中图3(A)是杂交混合液中无添加桑树样品，杂交信号显示的只是阳性对照样品(小鼠基因)的杂交信号，对应芯片中阳性对照探针的点样阵列(结合表3)有四条荧光信号显示。图3(B)是杂交混合液中既有阳性对照也有桑树样品，对应基因芯片中针对广州桑树植原体AY685056的9条特性探针的点样区有6条显示较强杂交信号。图4所示为针对AY685056的9条特异性探针的检测信号强度值，其中检测出较强杂交信号的6条特异性探针是AY685056-1、AY685056-2、AY685056-5、AY685056-6、AY685056-10、AY685056-11。由图3及图4的结果可判断样品中有广州桑树植原体的存在。图3(B)中其它位置的荧光信号为广州桑树植原体与是其它类植原体探针的非特异结合，不过信号相对较弱。

序列表

<110>深圳职业技术学院

<120>植原体探针、基因芯片以及检测植原体的方法

<130>09F10566HL02

<160>20

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1830

<212>DNA

<213>广州桑树植原体，编号：AY685056，(Mulberry dwarfphytoplasma)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1830)

<400>1

aagagtttga tcctggctca ggattaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa    60

cggaagttta agcaattaaa ctttagtggc gaacgggtga gtaacgcgta agcaatctgc    120

ccctaagacg aggataacag ttggaaacga ctgctaagac tggataggag acaagaaggc    180

atcttcttgt ttttaaaaga cctagcaata ggtatgctta gggaggagct tgcgtcacat    240

tagttagttg gtggggtaaa ggcctaccaa gactatgatg tgtagccggg ctgagaggtt    300

gaacggccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa    360

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tacgtaaagt tcttttatta gggaagaata aatgatggaa aaatcattct gacggtacct    480

aatgaataag ccccggctaa ctatgtgcca gcagccgcgg taatacatag ggggcaagcg    540

ttatccggaa ttattgggcg taaagggtgc gtaggcggtt aaataagttt atggtctaag    600

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aagttaacac attaagtact ccgcctgagt agtacgtacg caagtatgaa acttaaagga    900

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cctcaccagg tcttgacatg cttctgcaaa gctgtagaaa cacagtggag gttatcagtt  1020

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atctcaaaaa aacagtctca gttcggattg aagtctgcaa ctcgacttca tgaagttgga  1320

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ggaaggtggg gatggatcac ctcctttcta aggaaacaat tatcatcttc agttttgaga  1560

gacttaagaa agtttttcat tgtaacttgc ttgcaaattg tatttgcaac attttaatct  1620

ttttaagatt aagggcctat agctcagttg gttagagcac acgcctgata agcgtgaggt  1680

cggtggttca agtccattta ggcccaccat aaccacaaat aggcaaagtc ttaaaaaagc  1740

tctttgaaaa gtagataaac gaaggttaaa aaatcaaagg aactaagggc gcacagtgga  1800

tgccctggca ctaagagccg atgaaggacg                                   1830

<210>2

<211>1249

<212>DNA

<213>云南泡桐丛枝病植原体，编号：AY647460(Paulownia witches′-broomphytoplasma)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1249)

<400>2

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tagcaatagg tatgcttagg taggagcttg cgtcacatta gttagttggt ggggtaaagg    120

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acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatt ttcggcaatg gaggaaactc    240

tgaccgagca acgccgcgtg aacgatgaag tatttcggta cgtaaagttc ttttattagg    300

gaagaataaa tgatggaaaa atcattctga cggtacctaa tgaataagcc ccggctaact    360

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aaacgatgag tactaaacgt tgggtaaaac cagtgttgaa gttaacacat taagtactcc    720

gcctgagtag tacgtacgca agtatgaaac ttaaaggaat tgacgggact ccgcacaagc    780

ggtggatcat gttgtttaat tcgaaggtac ccgaaaaacc tcaccaggtc ttgacatgct    840

tctgcaaagc tgtagaaaca cagtggaggt tatcagttgc acaggtggtg catggttgtc    900

gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttattgtta    960

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tggggacgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacaaacgt gatacaatgg    1080

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tcggattgaa gtctgcaact cgacttcatg aagttggaat cgctagtaat cgcgaatcag    1200

catgtcgcgg tgaatacgtt ctcggggttt gtacacaccg cccgtcaaa                1249

<210>3

<211>1198

<212>DNA

<213>葡萄金黄色植原体，编号：AY197663(Grapevine flavescence dore′ePhytoplasma)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1198)

<400>3

aggcgataaa aaagtttcaa aaaaataatt taaagaaggt atttatatga aagttaaagc    60

tgtaacaagt ccaataccta ttactcctag aaaagcacgt ttagttgctg atttaatacg    120

tggtaagcat gttaaagaag cagaagctat tttaatgttt acttctaaat cgtctgctcc    180

tgttattttt aaattattaa aaagtgctgt tgcaaatgct gttcataatt ttaattttaa    240

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aaaaaagcac gtcttaatat aatcaaaata ggggtacata atatattatg ttaatgcc      1198

<210>4

<211>1804

<212>DNA

<213>椰子致死黄化类菌原体，编号：DQ645636(Coconut lethal yellowingMLO)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1804)

<400>4

aacgctggcg gcgtgcttaa tacatgcaag tcgaacggaa atcttttaga ttttagtggc    60

gaacgggtga gtaacacgta agcaacctgc ctttaagacg agaataacaa ttggaaacag    120

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aaggtatgct taaagagggg cttgcgtcac attagttagt tggtagggta aaggcctacc    240

aagacgatga tgtgtagctg gactgagagg ttgaacagcc acattgggac tgagacacgg    300

cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aattttcggc aatggaggaa actctgaccg    360

agcaacgccg cgtgaacgac gaagtacttc ggtatgtaaa gttcttttat tgaagaagaa    420

acaatagtgg aaaaactatc ttgacgttat tcaatgaata agccccggct aactatgtgc    480

cagcagccgc ggtaatacat agggggcgag cgttatccgg aattattggg cgtaaagggt    540

gcgtaggcgg tttaataagt ctctagttta atttcaacgc ttaacgttgt cctgctagag    600

aaactgttta actagagtga gatagaggta agcggaattc catgtgtagc ggtaaaatgt    660

gtaaatatat ggaggaacac cagaggcgta ggcggcttac tgggtcttta ctgacgctga    720

tgcacgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacta    780

tgagtactaa gtgtcggggt taaactcggt actgaagtta acacattaag tactccgcct    840

gagtagtacg tacgcaagta tgaaacttaa aggaattgac gggatcccgc acaagcggtg    900

gatcatgttg tttaattcga agatacacga aaaaccttac caggtcttga catactctgc    960

aaagctatag aaatatagtg gaggttatca gggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag    1020

ctcgtgtcgt gagatgttag gttaagttct aaaacgagcg caacccctgt cgttaattgc    1080

cagcacgtta tggtggggac tttagcgaga ctgccaatga aaaattggag gaaggtgggg    1140

attacgtcaa atcatcatgc cccttatgat ctgggctaca aacgtgatac aatggctatt    1200

acaaagagta gctgaaacgc gagtttttgg caaatctcaa aaaaatagtc tcagttcgga    1260

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cgcggtgaat acgttctcgg ggtttgtaca caccgcccgt caaaccacga aagtggacaa    1380

tacccgaaag cgacagccta actgcgtaag cagagggaat cgtctaaggt agggtcgatg    1440

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ctaaggaaat tttttaaaat catcatcttc agttttggaa gacttaagtt aatttaaaaa    1560

ataagttttt cgtttttttc attagttaat tcttttaata taatattctt taagatttta    1620

agggcctata gctcagttgg ttagagcaca cgcctgataa gcgtgaggtc ggtggttcaa    1680

gtccatttag gcccaccagt ctaaatgtac tgaaaatcaa aaaagttctt tgaaaagtag    1740

ataaacaacg taaattctca aaataatgaa gaaaataagg gcgtacagtg gatgccttgg    1800

cact                                                                 1804

<210>5

<211>1513

<212>DNA

<213>苹果丛生植原体，编号：AF248958(apple proliferation Phytoplasma)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1513)

<400>5

aagagtttga tcctggctca ggattaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa    60

cggaaacttt tagtttcagt ggcgaacggg tgagtaacac gtaagtaacc tgcctcttag    120

acgaggataa cagttggaaa cgactgctaa gactggatag gaagttttaa ggcatcttga    180

aacttttaaa agacccgcaa gggtatgcta agagatgggc ttgcggcaca ttagttagtt    240

ggtaaggtaa cggcttacca agactatgat gtgtagctgg actgagaggt tgaacggcca    300

cattgggatt gagatacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaagga attttcggca    360

atggaggaaa ctctgaccga gcaacgccgc gtgaacgatg aaatatttag gtatgtaaag    420

ttcttttatt aaagaagaaa aaatgatgga aaaatcattc tgacggtatt taatgaataa    480

gccccggcta actatgtgcc agcagctgcg gtaatacatg gggggcaagc gttatccgga    540

tttattgggc gtaaagggtg tgtaggcggt ttaataagtc tatggtataa gttcaacgct    600

taacgttgtg atgctatgga aactgtttga ctagagttgg atagaggcaa gtggaattcc    660

atgtgtagcg gtaaaatgcg taaatatatg gaggaacacc agtagcgaag gcggcttgct    720

gggtcttaac tgacgctgag gcacgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg    780

tagtccacgc cgtaaacgat gagtactaag tgttgggtta aaccagtgct gaagttaaca    840

cattaagtac tccgcctgag tagtacgtac gcaagtatga aacttaaagg aattgacggg    900

actccgcaca agcggtggat catgttgttt aattcgaaga tacacgaaaa accttaccag    960

gtcttgacat actctgcaaa gctatagaaa tatagtggag gttatcaggg atacaggtgg    1020

tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa    1080

cccttatcgc tagttaccat catttagttg ggcactttag tgagactgcc aatgataaat    1140

tggaggaagg tggggattac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacaaacgt    1200

gatacaatgg ctgttacaaa gagtagctga agcgtgagtt tttagcaaat ctcaaaaaaa    1260

cagtctcagt tcggattgaa gtctgcaact cgacttcatg aagtcgggat cgctagtaat    1320

cgcgaatcag catgtcgtgg tgaatacgtt ctcggggttt gtacacaccg cccgtcaaac    1380

catgaaagtt gacaatactc gaaaccagta gcctaacttg taaaagaggg aactgtctaa    1440

ggtagggtcg atgattgggg ttaagtcgta acaaggtatc cctaccggaa ggtggggatg    1500

gatcacctcc ttt                                                       1513

<210>6

<211>1520

<212>DNA

<213>榆树黄化植原体，编号：AF122910(Elm yellow Phytoplasma)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1520)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1408)..(1408)

<223>n is a，c，g，or t

<220>

<221>misc_feature

<222>(1495)..(1496)

<223>n is a，c，g，or t

<400>6

tttgatcctt ggctcaggat tacgctggcg cgcgcctaat acatgcaagt cgaacggaga    60

cccttcaaaa ggtcttagtg gcgaacgggt gagtaacacg taagtaacct acctttaaga    120

cgaggataac aatcggaaac ggttgctaag actggatagg aaacagaaag gcatcttttt    180

gtttttaaaa gaccttcttc ggagggtatg cttaaagagg ggcttgcgcc acattagtta    240

gttggtgagg taaaggctta ccaagattat gatgtgtagc tggactgaga ggttgaacag    300

ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaattttcg    360

gcaatggagg aaactctgac cgagcgacgc cgcgtgaacg atgaagtatt tcggtatgta    420

aagttctttt attgaagaag aaaaaatagt ggaaaaacta tcttgacgtt attcaatgaa    480

taagccccgg ctaactatgt gccagcagcc gcggtaagac atagggggcg agcgttatcc    540

ggaattattg ggcgtaaagg gtgcgtaggc ggttagataa gtctataatt taatttcagt    600

gcttaacgct gtcttgttat agaaactgtc ttgactagag tgagatagag gcaagcggaa    660

ttccatgtgt agcggtaaaa tgtgtaaata tatggaggaa caccagaagc gtaggcggct    720

tgctgggtct ttactgacgc tgaggcacga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc    780

ctggtagtcc acgctgtaaa cgatgagtac taagtgtggg gaaactcggt actgaagtta    840

acacattaag tactccgcct gagtagtacg tacgcaagta tgaaacttaa aggaattgac    900

gggactccgc acaagcgtgg atcatgttgt ttaattcgaa gatacacgaa aaaccttacc    960

aggtcttgac atactctgca aagctataga aatatagtgg aggttatcag ggatacaggt    1020

ggtgcatggt tgtcgtcgag ttcgtgtcgt gagatgttag gttaagtcct aaaacgaacg    1080

caacccctgt cgttagttgc cagcacgtaa tggtggggac tttagcgaga ctgccaatta    1140

aacattggag gaaggtgggg ataacgtcaa atcatcatgc cccttatgat ctgggctaca    1200

aacgtgatac aatggctatt acaaagagta gctgaaacgc gagtttttag ccaatctcaa    1260

aaaggtagtc tcagtacgga ttgaagtctg caactcgact tcatgaagct ggaatcgcta    1320

gtaatcgcga atcagcatgt cgcggtgaat acgttctcgg ggtttgtaca caccgcccgt    1380

caaaccacga aagttagcaa tacccganag cagtggctta acttggcaag aggagggagc    1440

tgtctaaggt agggttgatg attgggttaa gtcgtaacaa ggtatcctta ccggnnggtg    1500

aggataggat cacctccttt                                                1520

<210>7

<211>1493

<212>DNA

<213>桃X植原体，编号：L33733(Peach X Phytoplasma)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1493)

<220>

<221>misc_feature

<222>(730)..(759)

<223>n is a，c，g，or t

<220>

<221>misc_feature

<222>(773)..(773)

<223>n is a，c，g，or t

<400>7

ctaatacatg caagtcgaac ggaaaccttc gggttttagt ggcgaacggg tgagtaacac    60

gtaagcaacc tgcccttaag acgaggataa caattggaaa cagttgctaa gactggatag    120

gaaaagtaaa ggcatcttta cttttttaaa agatcttctt tgaaggtatg cttaaggagg    180

ggcttgcgac acattagtta gttggtaggg taaaggccta ccaagactat gatgtgtagc    240

tggactgaga ggttgaacag ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag    300

gcagcagtag ggaattttcg gcaatggagg aaactctgac cgagcaacgc cgcgtgaacg    360

atgaagtacc tcggtatgta aagttctttt attaaggaag aaaaaagagt ggaaaaactc    420

ccttgacggt acttaatgaa taagccccgg ctaattatgt gccagcagcc gcggtaatac    480

ataaggggcg agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagg gtgcgtaggc ggtttaataa    540

gtctatagtt taatttcagt gcttaacgct gttgtgctat agaaactgtt ttactagagt    600

gagatagagg caagcggaat tccatgtgta gcggtaaaat gcgtaaatat atggaggaac    660

accagaggcg taggcggctt gctgggtctt tactgacgct gaggcacgaa agcgtgggga    720

gcaaacaggn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna tgagtactaa gtntcgggta    780

aaactggtac tgaagttaac acattaagta ctccgcctga gtagtacgta cgcaagtatg    840

aaacttaaag gaattgacgg gactccgcac aagcggtgga tcatgttgtt taattcgaag    900

atacacgaaa aaccttacca ggtcttgaca ttttcttgcg aagttataga aatataatgg    960

aggtcatcag gaaaacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttagg    1020

ttaagtccta aaacgagcgc aacccttgtc gttagttgcc agcatgtaat gatggggact    1080

ttaacgagac tgccaatgaa aaattggagg aaggtgggga ttacgtcaaa tcatcatgcc    1140

ccttatgatc tgggctacaa acgtgataca atggttgata caaagagtag ctgaaacgcg    1200

agttcttagc caatctcaaa aaatcaatct cagttcggat tgaagtctgc aactcgactt    1260

catgaagttg gaatcgctag taatcgcgaa tcagcatgtc gcggtgaata cgttctcggg    1320

gtttgtacac accgcccgtc aaaccacgaa agttggcaat accccaaagc ggtcacctaa    1380

cttcgcaaga agaaggatcc gtctaaggta gggtcgataa atccgtctaa ggtagggtcg    1440

ataattgggg ttaagtcgta acaaggtatc cctaccggaa ggtggggatg gat           1493

<210>8

<211>1505

<212>DNA

<213>梨衰退植原体，编号：DQ011588(Pear decline Phytoplasma)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1505)

<400>8

aagagtttga tcctggctca ggattaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa    60

cggaaacttt tagttttagt ggcgaacggg tgagtaacac gtaagtaacc tgcctctcag    120

acgaggataa cagttggaaa cgactgctaa gactggatag gaagttttaa ggcatcttaa    180

aacttttaaa agacccgcaa gggtatgctg agagatgggc ttgcggcaca ttagttagtt    240

ggtaaggtaa cggcttacca agactatgat gtgtagctgg actgagaggt tgaacggcca    300

cattgggact gagatacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaagga attttcggca    360

atggaggaaa ctctgaccga gcaacgccgc gtgaatgacg aagtatttag gtatgtaaag    420

ttcttttatt aaagaagaaa aaatgatgga aaaatcattc tgacggtatt taatgaataa    480

gccccggcta actatgtgcc agcagctgcg gtaatacatg gggggcaagc gttatccgga    540

tttattgggc gtaaagggtg cgtaggcggt taaataagtc tatggtataa gttcaacgct    600

taacgttgtg atgctataga aactgtttga ctagagttgg atagaggcaa gtggaattcc    660

atgtgtagcg gtaaaatgcg taaagatatg gaggaacacc agtagcgaag gcggcttgct    720

gggtcttaac tgacgctgag gcacgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg    780

tagtccacgc tgtaaacgat gagtactaag tgttgggtta aaccagtgct gaagttaaca    840

cattaagtac tccgcctgag tagtacgtac gcaagtatga aacttaaagg aattgacggg    900

actccgcaca agcggtggat catgttgttt aattcgaaga tacacgaaaa accttaccag    960

gtcttgacat actctgcaaa gctatagaaa tatagtggag gttatcaggg atacaggtgg    1020

tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa    1080

cccttatcgc tagttaccat catttagttg ggcactttag tgagactgcc aatgataaat    1140

tggaggaagg tggggattac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacaaacgt    1200

gatacaatgg ctgttacaaa gagaagctga agcgtgagtt tttagcaaat ctcaaaaaaa    1260

cagtctcagt tcggattgaa gtctgcaact cgacttcatg aagtcggaat cgctagtaat    1320

cgcgaatcag catgtcgtgg tgaatacgtt ctcggggttt gtacacaccg cccgtcaaac    1380

catgaaagtt gacaataccc gaaaccagta gcctaacttg caaaagaggg aactgtctaa    1440

ggtagggttg atgattgggg ttaagtcgta acaaggtatc cctaccggaa ggtggggatg    1500

gatca                                                                1505

<210>9

<211>1520

<212>DNA

<213>甘蔗白叶植原体，编号：AB052874(Sugarcane white leafPhytoplasma)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1520)

<400>9

gtttgatcct ggctcaggat aaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgaacgga    60

aatcttcgga ttttagtggc gaacgggtga gtaacacgta agcaacctgc ctttaagacg    120

aggataacaa ttggaaacag ttgctaagac tggataggaa ataaaaaggc atctttttat    180

ttttaaaaga cctttttcgg aaggtatgct taaagagggg cttgcgtcac attagttagt    240

tggcagggta aaggcctacc aagactatga tgtgtagctg gactgagagg ttgaacagcc    300

acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aattttcggc    360

aatggaggaa actctgaccg agcaacgccg cgtgaacgat gaagtatttc ggtatgtaaa    420

gttcttttat tgaagaagaa aaaatagtgg aaaaactatc ttgacgatat tcaatgaata    480

agccccggca aactatgtgc cagcagccgc ggtaatacat agggggcgag cgttatccgg    540

aattattggg cgtaaagggt gcgtaggcgg tttaataagt ctatagttta atttcagtgc    600

ttaacactgt cctgctatag aaactattag actagagtga gatagaggca agtggaattc    660

catgtgtagc ggtaaaatgc gtaaatatat ggaggaacac cagaggcgta ggcggcttgc    720

tgggtcttta ctgacgctga ggcacgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg    780

gtagtccacg ccgtaaacga tgagtactaa gtgtcgggat tactcggtac tgaagttaac    840

acattaagta ctccgcctga gtagtacgta cgcaagtatg aaacttaaag gaattgacgg    900

gactccgcac aagcggtgga tcatgttgtt taattcgaag atacacgaaa aaccttacca    960

ggtcttgaca tactctgcaa agctatagca atatagtgga ggttatcagg gatacaggtg    1020

gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttaggt taagtcctaa aacgagcgca    1080

acccttgtca ttagttgcca gcatgtcatg atgggcactt taatgagact gccaatgaaa    1140

aattggagga aggtgaggat cacgtcaaat catcatgccc cttatgatct gggctacaaa    1200

cgtgatacaa tggctgttac aaagagtagc tgaaacgcaa gtttatagcc aatctcataa    1260

aagcagtctc agttcggatt gaagtctgca actcgacttc atgaagttgg aatcgctagt    1320

aatcgcgaat cagcatgtcg cggtgaatac gttctcgggg tttgtacaca ccgcccgtca    1380

aaccacgaaa gttggtaata ctcaaaaacg gtagcctaac ttcttcggaa gagggaaccg    1440

tctaaggtag gatcgatgat tggggttaag tcgtaacaag gtatccctac cggaaggtgg    1500

ggatggatca cctcctttct                                                1520

<210>10

<211>1415

<212>DNA

<213>番茄顽固植原体，编号DQ387052(Tomato stolbur Phytoplasma)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1415)

<400>10

tttgatcctg gctcaggatt aacgctgcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgaacggaaa    60

cctttgggtt ttagtggcga acgggtgagt aacacgtaag caacctaccc taaagacgag    120

gataaccatt ggaaacagtg gctaagacct tccccaaagg ggaaaagctc tggtatcttt    180

ttaaagacct agttataggt atactttagg acgggcttgc gccatattag ttaccttggt    240

agggtaatgg cctaccaaga cgatgatgtg tagctggact gagaggttga acagccacat    300

tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatt ttcggcaatg    360

gaggaaactc tgaccgagca acgccgcgtg aatgacgaag tactttggta tgtaaagttc    420

ttttatcaag gaagaaaagc aagtggcgaa ccatttgttt gccggtactt gatgaataag    480

ccccggctaa ttatgtgcca gcagccgcgg taagacataa ggggcaagtg ttatccggaa    540

ttattgggcg taaagggtga tggaggaaca ccagaggcgt aggcggctcg ctgggcttaa    600

ctgacgttga ggcacgaaag cgtggggagc aaacaggatt agatactctg gtagttcacg    660

ccgtaaacga tgagtaataa gtgtcgggtc aaaccggtac ggaagtttaa cacatttaag    720

tactccgcct gagtagtacg tacgcaagta tgaaacttaa aggaattgac gctccgcaca    780

agcggtggat catgttgttt aatttgaaga tacccgaaaa accttaccag gtcttgacat    840

gtttttgcga aacggtagta atatcgtgga ggttatcaga aacacaggtg gtgcatggtt    900

gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgttg gttaagtcct aaaacgagcg aacccttatc    960

ttagttgcca gcacgttatg gtggggactt taacgacact gccagtgata aactggagga    1020

aggtgaggat tcacgtcaaa tcagcatgcc ccttatgacc tgggctacaa acgtgataca    1080

atggctgtta caaagggtat gaaacgcaag tttttggcca atccccaaaa acagtttcag    1140

tccggatgaa gtctgcaact cgacttcatg aagttggaat cgctagtaat cgcgatcagc    1200

atttgcgaat tccgtatctt cctgaaactg tcgcggtgaa tacgttctcg gggtttgtac    1260

acaccgcccg tcaaaccacg aaagttggca ataccccaaa acggtagtct aactcgttta    1320

ttcgagaggg cgccgtctaa ggtagggtcg atgattgggg ttaagtcgta acaaggtatc    1380

cctaccggaa ggtggggatg gatcacctcc tttct                               1415

<210>11

<211>1529

<212>DNA

<213>柑桔顽固螺原体，编号：AM157769(Citrus stubbornn Spiroplasma)

<220>

<221>genomic DNA

<222>(1)..(1529)

<400>11

ttttaatgag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcatgcct aatacatgca    60

agtcgaacgg ggtgcttgca cccagtggcg aacgggtgag taacacgtat ctaatctacc    120

cattagcggg ggataacagt tggaaacgac tgataatacc gcatacgaca ttttctggca    180

tcagagaatg ttaaaaggtc cgtttggatc actaatggat gaggatgcgc cgtattagtt    240

agttggtggg gtaatggcct accaagacaa tgatacgtag ccgaactgag aggttgatcg    300

gccacatcgg gactgagaca cggcccgaac tcctacggga ggcagcagta gggaattttt    360

cacaatgggc gaaagcctga tggagcaatg ccgcgtgact gaagacggtc ttcggattgt    420

aaaagtctgt tgtaagggaa gaacagtaag tataggaaat gatacttatt tgacggtacc    480

ttaccagaaa gccacggcta actatgtgcc agcagccgcg gtaatacata ggtggcaagc    540

gttatccgga tttattgggc gtaaagcgtg cgcagacggt ttaacaagtt tggggtcaaa    600

tcctggagct caactccagt tcgccttgaa aactgttaag ctagagtgta ggaaaggtcg    660

atggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc agtggcgaag    720

gcggtcgact ggcctatcac tgacgtttag gcacgaaagc gtagggagca aataggatta    780

gataccctag tagtctacgc cgtaaacgat gagtactaag tgtcggacta agttcggtgc    840

tgcagctaac gcattaagta ctccgcctga gtagtatgct cgcaagagtg aaactcaaag    900

gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag    960

aaccttacca aggcttgaca tccagtgcaa agctgtagaa atacagtgga ggttaacatt    1020

gagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgccgtga ggtgtttggt taagtccagt    1080

aacgagcgca acccttgccg ttagttactc cattaagttg agatactcta acaggactgc    1140

tagtgtaagc tagaggaagg tggggatgac gtcaaatcag catgcccctt atatcttggg    1200

ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa cagttgcgat ctcgtaagag ggagctaatc    1260

tgaaaaagcc gatctcagtt cggattgagg gctgcaactc gccctcatga agccggaatc    1320

gctagtaatc gcgaatcagc aatgtcgcgg tgaatacgtt ctcgggtctt gtacacaccg    1380

cccgtcacac catgagagct gataatacca gaagtcggta ttctaaccgc aaggaggaag    1440

ccgcccaagg taggattgat gattagggtg aagtcgtaac aaggtatccg tacgagaacg    1500

tgcggatgga tcacctcctt tctatggag                                      1529

<210>12

<211>333

<212>DNA

<213>阳性对照的小鼠管家的基因序列，编号：M3116F01(Mouse)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(333)

<400>12

atatgtaagt acactgtagc tgtcttcaga cactccagaa gagggcgtca gatcttgtta    60

cagatggttg tgagccacca tgtggttgct gggatttgaa ctccggacac cttcggaaga    120

acagtcgggt gctcttacca ctgagccatc tcaccagccc ctattttaaa ctttttaaat    180

ttggatgttc atggacgttc agcagctgag cgttttttgg catccccaca cttacactat    240

atatgcttca gtgaagtgga agaatcctat gacaggccaa tggcatggat ccaaccctgt    300

actcatgggg acgaggtcac atttgtgttt ttt                                 333

<210>13

<211>319

<212>DNA

<213>阳性对照的小鼠管家的基因序列，编号：M3116F10(Mouse)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(319)

<400>13

gttgtgagta ttgtgaatgt tggctttgcg gcctcagttc catatagtgg tttgcagact    60

tcagcacagg acggaaccaa ccttagtgtc tgttctccag actctccatc tgttggctca    120

cacctttcag cctccttatt taacttaata gggacactat taaaaactgc aaagcaagcc    180

gggcgtggtg gcgcatgcct ttaatcccag cactcgggag gcagaggcag gtggatttct    240

gagttcgagg ccagcctggt ctacaaagta agttccagga cagccagggc tatacagaga    300

aaccctgtct cgaaaaacc                                                 319

<210>14

<211>258

<212>DNA

<213>阳性对照的小鼠管家的基因序列，编号：M3116E05(Mouse)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(258)

<400>14

gctagacaag ctggccagat tagaggaagg acaagtctct gggaaaccaa ctaggtcagt    60

ctcaaaagcc actgcctaga tttttaccac tcagaacata tgaaaggccc tgtggctcct    120

tcttatggtc tcacagtcaa tgcagccaat tacaacataa ttaactgtgc acagtgataa    180

cttttaacga agccttcatc ttcctggaaa ggaagcacct tagattgtcc ccataatcaa    240

caagctcaat atgaagtg                                                  258

<210>15

<211>326

<212>DNA

<213>阳性对照的小鼠管家的基因序列，编号：M3116D01(Mouse)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(326)

<400>15

tctatattta ttttaattag gtaaaggaaa ttacagactt attgtagctt ttgttttcaa    60

tcttaaaagt gaaattttat ggaaatccaa tgtattactt aatttttaac tcaaatgatg    120

aatacaagga atatatggat gctttctgct tttactgttt gtgtaaaatg gtgtcatgac    180

atttaggagc tgagacatgt acaggttaaa tctgccttaa gtgtgctgtg agtttactta    240

aagacaaact tgtgatataa gagtgtaaga gctattacca agccaggatt ataaaacaaa    300

tactttaatt aaaaacatga aaacat                                         326

<210>16

<211>324

<212>DNA

<213>阳性对照的小鼠管家的基因序列，编号：M3157F03(Mouse)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(324)

<400>16

aaaggttcta tattttatta ctggacaaac atcctaattc aagacacgaa gagtctccag    60

gtttaaatgt tgaaatccat ctggtaggac tgattgatga caattcagta taaatcctca    120

gtcttgccat tgtgtgaatc cttacagacc cagcttcgtt ctcctccagt gtcttctctt    180

agagttgtac ctgattttgt taccagtttt catccggatc cactgaggaa tagggcgatt    240

ttgcttttgt ttcttggcca ggaatcgctt gattcggaaa gtcttgtgag aagacatggc    300

gagaagccga atcaagaata gcgc                                           324

<210>17

<211>396

<212>DNA

<213>阴性对照的人类基因的保守序列，编号：H28302128(Homo sapiens)

<220>

<221>mRNA

<222>(1)..(396)

<400>17

gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac    60

aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat    120

cctgagaact tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc    180

aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat    240

gccctggccc acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt    300

cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct    360

ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgc                              396

<210>18

<211>565

<212>DNA

<213>阴性对照的人类基因的保守序列，编号：H34916057(Homo sapiens)

<220>

<221>mRNA

<222>(1)..(565)

<400>18

ttcgtgcacc cacttgggcg ctggaccccc tctcagcaat ggccaccggc cggctgcaca    60

cgacttcccc ctggggcggc agctccccag caggactacc ccgaccctgg gtcttgagga    120

agtgctgagc agcagggact gtcaccctgc cctgccgctt cctcccggct tccatcccca    180

cccggggccc aattacccat ccttcctgcc cgatcagatg cagccgcaag tcccgccgct    240

ccattaccaa gagctcatgc cacccggttc ctgcatgcca gaggagccca agccaaagag    300

gggaagacga tcgtggcccc ggaaaaggac cgccacccac acttgtgatt acgcgggctg    360

cggcaaaacc tacacaaaga gttcccatct caaggcacac ctgcgaaccc acacaggtga    420

gaaaccttac cactgtgact gggacggctg tggatggaaa ttcgcccgct cagatgaact    480

gaccaggcac taccgtaaac acacggggca ccgcccgttc cagtgccaaa aatgcgaccg    540

agcattttcc aggtcggacc acctc                                          565

<210>19

<211>521

<212>DNA

<213>阴性对照的人类基因的保守序列，编号：H4504152(Homo sapiens)

<220>

<221>mRNA

<222>(1)..(521)

<400>19

ccgcccccag caatccccgg ctcctgcgag tggcactgct gctcctgctc ctggtagccg    60

ctggccggcg cgcagcagga gcgtccgtgg ccactgaact gcgctgccag tgcttgcaga    120

ccctgcaggg aattcacccc aagaacatcc aaagtgtgaa cgtgaagtcc cccggacccc    180

actgcgccca aaccgaagtc atagccacac tcaagaatgg gcggaaagct tgcctcaatc    240

ctgcatcccc catagttaag aaaatcatcg aaaagatgct gaacagtgac aaatccaact    300

gaccagaagg gaggaggaag ctcactggtg gctgttcctg aaggaggccc tgcccttata    360

ggaacagaag aggaaagaga gacacagctg cagaggccac ctggattgtg cctaatgtgt    420

ttgagcatcg cttaggagaa gtcttctatt tatttattta ttcattagtt ttgaagattc    480

tatgttaata ttttaggtgt aaaataatta agggtatgat t                        521

<210>20

<211>701

<212>DNA

<213>阴性对照的人类基因的保守序列，编号：H47060296(Homo sapiens)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(701)

<400>20

tgaactccta cttcgagcct ccggtggagg agagcgcctt ggaacgccga cctgaaacca    60

tctctgagcc caagacctat gttgacctaa ccaatgaaga aacaactgat tccaccactt    120

ctaaaatcag cccatctgaa gatactcagc aagaaaatgg cagcatgttc tctctcatta    180

cctggaatat tgatggatta gatctaaaca atctgtcaga gagggctcga ggggtgtgtt    240

cctacttagc tttgtacagc ccagatgtga tatttctaca ggaagttatt cccccatatt    300

atagctacct aaagaagaga tcaagtaatt atgagattat tacaggtcat gaagaaggat    360

atttcacagc tataatgttg aagaaatcaa gagtgaaatt aaaaagccaa gagattattc    420

cttttccaag taccaaaatg atgagaaacc ttttatgtgt gcatgtgaat gtgtcaggaa    480

atgagctttg ccttatgaca tcccatttgg agagcaccag agggcatgct gcggaacgaa    540

tgaatcagtt aaaaatggtt ttaaagaaaa tgcaagaggc tccagagtca gctacagtta    600

tatttgcagg agatacaaat ctaagggatc gagaggttac cagatgtggt ggtttaccca    660

acaacattgt ggatgtctgg gagtttttgg gcaaacctaa a                        701

Claims (9)

1.探针，针对选自序列表中SEQ ID NO. 1植原体的16sDNA核苷酸序列，所述的探针序列选自表1中对应植原体AY685056的一条特异性探针序列AY685056-10。

2.如权利要求1所述的探针，其特征在于：进一步包括选自表1中对应植原体AY685056的特异性探针序列AY685056-1、AY685056-11、AY685056-2、AY685056-4、AY685056-5、AY685056-6、AY685056-8、AY685056-9中的一条或几条的组合。

3.基因芯片，包含如权利要求1-2中任一项所述的探针。

4.如权利要求3所述的基因芯片，其特征在于：所述芯片还包含阴性对照和阳性对照，阴性对照探针选取一段人类基因的保守序列选自序列表中SEQ ID NO. 17-20，与植原体序列没有同源性，阴性对照探针选自表1中H28302128、H34916057、H4504152、H47060296对应的序列；阳性对照探针分别来自于5个小鼠管家基因序列选自序列表中SEQ ID NO. 12-16，所述阳性对照探针选自表1中M3116F01、M3116F10、M3116E05、M3116D01、M3157F03对应的序列。

5.如权利要求3所述的基因芯片，其特征在于：所述芯片包括上下两个重复的点样区，每个独立的点样区包括四个小的矩阵，每个矩阵包括8行19列共152个探针点，其中每一列为同一个探针的重复。

6.如权利要求5所述的基因芯片，其特征在于：所述芯片基质选自玻片、硅片、金属片或膜中的一种。

7.一种利用如权利要求3-6中任一项所述的基因芯片检测广州桑树植原体的方法，包括以下步骤：

（1）植物DNA样品提取；

（2）利用通用引物对样品特异性片段扩增并对产物进行标记，所述通用引物选自表2的6对通用扩增引物为：Sense1、Antisense1、Sense2、Antisense2、Sense3、Antisense3、Sense4、Antisense4、Sense5、Antisense5、Sense6、Antisense6；阳性对照为选自表2的外参照通用引物1和2；

（3）杂交：将待测标记的样品加入杂交缓冲液中，混匀成杂交混合液，将混合液滴加入基因芯片的杂交区域，放入杂交盒杂交；

（4）取出杂交后的芯片并干燥后，进行扫描及数据分析，判断样品中有无广州桑树植原体的存在。

8.如权利要求7所述的检测植原体的方法，其特征在于：所述第（2）步扩增及标记包括以下工艺步骤：

1）PCR扩增：

其中特异性扩增反应体系：

DNA样品                       0.1μg

扩增引物对                      1μL

10×PCR Buffer                   2μL

2.5mM d(AGT)TP mix              2μL

0.25mM dCTP                     2μL

25μM Cy3-dCTP                  2μL

rTaqase                         0.3μL

加灭菌水至终体积                20μL

特异性扩增反应条件：95℃×5分钟；95℃×15秒，55℃×15秒，72℃×15秒共40个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却；

2）采用QIAquick PCR Purification Kit纯化扩增标记产物，步骤如下：

a）加入5倍体积的Buffer PB，混匀后，转移到mini spin 纯化柱中；

b）离心13000rpm×1分钟，弃收集套管中的液体；

c）加入500μL缓冲液PE，离心13000 rpm×1 min，弃收集套管中的液体；

d）重复操作c）一次；

e）不加试剂，离心13000 rpm×1 min，弃去收集套管，换成1.5ml的离心管；

f）加入Buffer EB 40μL，离心13000 rpm×1 min；

g）再加入Buffer EB 20μL，离心13000 rpm×1 min，合并纯化产物。

9.如权利要求7所述的检测植原体的方法，其特征在于：所述第（3）步骤杂交工艺进一步包括以下步骤：

1）预杂交或预处理：将芯片放入盛有预杂交缓冲液的染色缸中进行预处理20-30分钟，之后取出芯片并吹干表面；

2）杂交：将标记好的样品抽干后重溶于3μL灭菌水，95℃水浴变性5分钟，冰上冷却5分钟，加入32μL杂交缓冲液，混匀成杂交混合液，将混合液滴加入基因芯片的杂交区域，盖上盖玻片，将芯片放入杂交盒进行杂交处理；

3）洗片：杂交结束后取出芯片，放入盛有去离子水的染色缸中洗片，再放入盛有洗脱液的染色缸中洗片，之后取出芯片并吹干表面。

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