CN108950015A

CN108950015A - 鉴别福寿螺杂交型的多重pcr检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN108950015A
Application number: CN201810886061.0A
Authority: CN
Inventors: 杨倩倩; 俞晓平; 张蓬军; 刘光富; 贺超; 刘苏汶
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2038-08-06
Also published as: CN108950015B

Abstract

本发明公开了一种鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒及其检测方法。包括由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物序列组成的引物对1，以及由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物序列组成的引物对2。首先提取小管福寿螺或斑点福寿螺的基因组DNA，以此为模板，使用两组特异引物对在普通PCR试剂体系和程序下进行多重PCR反应，通过凝胶电泳检测，确定福寿螺的杂交型。本方法快速而准确，只需一个PCR反应，便可以鉴别多种不同的杂交型，具有较强的可重复性和稳定性。与酶切和序列分析方法相比，该方法简易而经济，无需复杂的技术步骤和昂贵的试剂，一般技术人员均可操作，是鉴别福寿螺杂交型的理想方法。

Description

鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种快速精准鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

福寿螺又名苹果螺，隶属于腹足纲，新进腹足目，瓶螺科，福寿螺属(Pomacea)，是世界100种最具威胁的入侵种之一，也是我国首批公布的16种危害极大的外来入侵物种之一。福寿螺原产于南美亚马孙流域，现分布范围广，涉及亚洲、北美洲、欧洲及澳洲的热带、亚热带和温带地域。在我国，福寿螺最早于1981年引入广东中山，迄今已入侵扩散30余年，成为南方水稻种植区的一大灾患。据统计，我国每年有上百万公顷的稻田遭受福寿螺不同程度的危害，水稻单产可减少3～5成，高者可达70％。调研数据表明，福寿螺主要在我国北纬30°以南的地域发生，并以每年8～10千米的速度向北扩散。同时，受气候变化、频繁地种苗调运以及域往来等影响，福寿螺的扩散趋势加剧。当前，福寿螺在我国江苏、浙江、湖南、四川、重庆、江西、云南、贵州、福建、广西、广东，海南等省份均有发生。

世界入侵性福寿螺主要包括两种，即小管福寿螺(P.canaliculata)和斑点福寿螺(P.maculata)，国内外研究学者基于母系遗传的线粒体基因并结合成螺的解剖学特征等对两种福寿螺进行了种类的鉴别。然而，近期研究表明，小管福寿螺和斑点福寿螺种间并未形成完全的生殖隔离，两种间正反杂交后均可产生F1代，且F1代可与亲本小管福寿螺回交产生回交代群体。已有报道显示，在亚洲国家如日本、韩国、越南、菲律宾均已检测到杂交种群的分布。种间杂交和遗传渐渗导致福寿螺等位基因的交换，而发生生物学性状的改变。例如，斑点福寿螺比小管福寿螺的抗寒性低，在温带国家的较高纬度地区无法定殖，通过与小管福寿螺种间杂交与遗传渐渗，斑点福寿螺提升了抗寒性，扩大了其入侵范围。因而，福寿螺种类中的杂交群体的准确鉴别，将为分析福寿螺进化潜力和发展动态提供理论基础，同时可为制定有效的福寿螺防治策略提供科学依据。

然而，基于形态特征难以实现福寿螺杂交种的鉴别。现有的福寿螺杂交检测方法主要有两种。一种方法是通过对检测样品EF1α基因片段进行克隆测序，经序列比对后构建系统发育树，根据系统发育关系进行鉴别。该方法通过克隆测序不仅实验步骤繁琐，测序成本高，而且耗时约需5天，不适合大量样本的检测。另一种方法是一种结合PCR和限制性内切酶酶切的技术，进行杂交型的鉴别。其具体操作为对待测样品核EF1α基因片段进行PCR扩增，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，通过电泳图谱判别。该方法检测约需4～5小时，然而酶切操作易污染，容易出现假阳性，检测的精准度不高。

从上述例子可以看出，虽然目前已有一些检测两种福寿螺杂交型的方法和技术，但是尚有不足之处，如检测步骤繁琐，耗时长，精准度不高，检测成本昂贵等。上述这些严重影响了外来入侵福寿螺杂交种群的准确快速鉴别。针对如上情况，有必要建立一套快速精准鉴别小管福寿螺和斑点福寿螺杂交型的方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于鉴别或辅助鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒及其检测方法。

本发明所提供的鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，包括如下两对引物对：

(1)由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物序列组成的引物对1；

(2)由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物序列组成的引物对2。

较为优选的，所述试剂盒中组成两个引物对的四条引物的摩尔数相等。

所述福寿螺为小管福寿螺、斑点福寿螺。所述引物对1特异于小管福寿螺的鉴别；所述引物组2特异于斑点福寿螺的鉴别。

优选的，所述的鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒还包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。

本发明的再一个目的是提供所述试剂盒的制备方法。

所述试剂盒的制备方法，具体包括如下步骤：将组成所述试剂盒中各引物对的各单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。

本发明还公开了一种福寿螺杂交型的多重PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(a)以待测福寿螺的基因组DNA为模板，用引物对1和引物对2进行PCR扩增；

(b)检测步骤(a)得到的PCR产物的数量及大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测福寿螺的杂交型：

若所述PCR产物中含有且仅含有一条125bp的DNA片段，则所述待测福寿螺为小管福寿螺纯合型；若所述PCR产物中含有且仅含有一条151bp的DNA片段，则所述待测福寿螺为斑点福寿螺纯合型；若所述PCR产物中含有两条DNA片段，长度分别为125bp和151bp，则所述待测福寿螺为小管福寿螺和斑点福寿螺的杂合型。

所述步骤(a)进行PCR扩增的退火温度优选为56℃。

优选的，所述引物对1和引物对2中的四种引物在PCR反应体系中的摩尔比为1:1:1:1。

所述125bp的DNA片段序列如SEQ ID NO.5所示；所述151bp的DNA片段序序列如SEQID NO.6所示。

本发明是在小管福寿螺和斑点福寿螺这两种世界入侵性福寿螺的核基因EF1α序列的基础上，设计并筛选出识别两种福寿螺的特异引物对，形成基于特异引物方法的多重PCR鉴别试剂盒，实现世界入侵性福寿螺杂交型的准确鉴别。本发明所提供的基于特异引物鉴别外来生物福寿螺的试剂盒，不仅特异性强、灵敏度高，而且具有较高的可重复性和稳定性，是鉴别福寿螺杂交型的理想方法。

附图说明

图1为本发明的多重PCR试剂盒对质粒扩增的特异性检测结果。其中泳道M为DNA相对分子量标准(50bp DNA ladder)；其他泳道信息为1：仅插入有小管福寿螺的EF1α序列的质粒DNA；2：仅插入有斑点福寿螺EF1α序列的质粒DNA；3：人工等比例混配的仅插入有小管福寿螺EF1α序列的质粒DNA与仅插入有斑点福寿螺EF1α序列的质粒DNA组成的杂交型质粒DNA；CK为以ddH₂O为阴性对照。

图2为本发明的多重PCR试剂盒对小管福寿螺和斑点福寿螺的杂交型检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(50bp DNA ladder)；其他泳道信息为1～9为不同地理种群的小管福寿螺基因组DNA；10～15为不同地理种群孤岛福寿螺基因组DNA；CK为以ddH₂O为阴性对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

两种外来入侵福寿螺：小管福寿螺和斑点福寿螺。其中，小管福寿螺涉及如下地理种群：浙江绍兴种群、湖南长沙种群、云南昆明种群、广东广州种群、广西桂林种群、广东揭阳种群、云南大理种群、浙江舟山种群、浙江杭州种群；斑点福寿螺涉及如下地理种群：四川遂宁种群、四川成都种群、重庆合川种群、浙江杭州种群、重庆沙坝种群。以上两种福寿螺记载在“周晓农,张仪,吕山.福寿螺学名中译名的探讨.中国寄生虫学与寄生虫病杂志.2009,27(1):62-64.”一文中。

实施例1、针对两种福寿螺EF1α序列的特异引物的设计与合成

一、两种福寿螺EF1α序列的获得

实验材料：小管福寿螺和斑点福寿螺两种外来入侵福寿螺。其中，小管福寿螺涉及如下地理种群：浙江绍兴种群、湖南长沙种群、云南昆明种群、广东广州种群、广西桂林种群、广东揭阳种群、云南大理种群、浙江舟山种群、浙江杭州种群；斑点福寿螺涉及如下地理种群：四川遂宁种群、四川成都种群、重庆合川种群、浙江杭州种群、重庆沙坝种群。

1、福寿螺基因组DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒，提取成螺腹足部肌肉组织的总DNA。参照试剂盒说明书进行，具体如下：

(1)取成螺肌肉组织(10mg)用75％的酒精清洗表面并用蒸馏水清洗两次，于干净的滤纸上晾干。

(2)将处理后的组织转移到1.5mL的PCR管向离心管，加液氮研磨将组织碾碎，加入180μL GA缓冲液(随试剂盒附带)，离心数秒。

(3)加入20μL的蛋白酶K(随试剂盒附带)，震荡混匀，56℃水浴1h，离心数秒。

(4)加入200μL缓冲液GB(随试剂盒附带)，充分颠倒混匀，70℃水浴10min，溶液变清亮，离心30s。

(5)加入200μL无水乙醇，震荡20秒，离心1分钟，将溶液全部转移至吸附柱CB3(随试剂盒附带)中，吸附柱放入收集管，12000rpm/s离心30s，倒掉废液，吸附柱放回收集管。

(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(随试剂盒附带)，12000rpm/s离心30s，倒掉废液，吸附柱放回收集管。

(8)向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW(随试剂盒附带)，12000rpm/s离心30s，倒掉废液，吸附柱放回收集管。

(9)重复步骤(8)。

(10)将吸附柱CB3以12000rpm/s离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置5min。

(11)吸附柱CB3转移至一个干净的1.5mL的离心管中，向吸附柱悬空滴加150μL双蒸水，室温放置2～5min后，12000rpm/s离心2min，获得基因组DNA溶液

(12)将获得DNA溶液保存在-20℃用于后面的研究。

2、EF1α序列的PCR扩增

利用由5′-tgtgaataagatggacagca-3′(SEQ ID NO.7所示)和5′-aatcctaacctccaattttgt-3′(SEQ ID NO.8所示)组成的引物对扩增福寿螺的EF1α序列，扩增产物长度为501bp。反应体系：PCR反应总体积为25μL，其中Premix ExTaq^TM 12.5μL(宝生物工程大连有限公司)，ddH₂O9.5μL，基因组DNA模板1μL(20ng/μL)，上下游引物各1μL，两条引物的浓度均为10μM。扩增条件为：热循环程序为94℃3min，接着进行35个循环(94℃，3min；50℃，30s；72℃，50s)，最后在72℃反应5min后结束。

3、EF1α序列的获得

采用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR产物的质量；并采用Sanprep柱试PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司)回收产物；将回收产物连接到PMD^TM 19-T载体(宝生物工程大连有限公司)上，将连接产物转化到感受态大肠杆菌JM109菌株内，用含氨苄抗抗生素的LB固体培养基(抗生素终浓度为100μg/mL)进行初筛，每个样品各挑取5～10个阳性克隆，采用载体通用引物对(5′-gagcggataacaatttcacacagg-3′SEQ ID NO.9所示)和(5′-cgccagggttttcccagtcacgac-3′SEQ ID NO.10所示)进行菌落PCR，检测阳性克隆。菌落PCR反应条件为：95℃5min，接着进行30个循环(94℃30s，58℃30s，72℃50s)；72℃反应10min后结束。扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，选择其中片段大小正确(插入了扩增片段)的克隆进行测序。将阳性克隆送公司(上海派森诺生物科技股份有限公司)测序，测序采用载体通用引物。

二、特异引物的设计与合成

1、特异引物设计

(1)从GenBank中下载8条参比EF1α序列，包括4条小管福寿螺的序列(注册号为AB629956，AB629977，AB629987和FJ710346)和4条斑点福寿螺的序列(注册号为AB629988，AB629989，AB629994和AB757872)。

(2)将步骤一获得的两种福寿螺(每个种包含多个地理种群)的EF1α序列用DNASP软件进行单倍型型分析，将获得的所有单倍型序列与GenBank中下载的EF1α的序列采用最大似然法构建系统发育树。步骤一获得的序列的单倍型可以分为两个进化枝，一枝与GenBank中下载的小管福寿螺序列聚在一起，为小管福寿螺序列，一枝与GenBank中下载的斑点福寿螺序列聚在一起，为斑点福寿螺序列。

(3)引物设计

将所得小管福寿螺和斑点福寿螺的单倍型序列进行比对，在序列变异较大的序列区段设计引物。引物设计遵循标准如下：

各单条引物包含至少3个特异位点；引物长度为20～25bp；GC含量控制在40％～50％之间；引物退火温度为50℃～60℃；针对小管福寿螺和斑点福寿螺的引物扩增长度均在100bp以上，且两对引物扩增长度相差20bp以上。

根据以上所述，设计并合成得到针对小管福寿螺和斑点福寿螺的特异引物如下(表1)：

表1小管福寿螺和斑点福寿螺扩增EF1α序列的特异引物

实施例2、引物特异性检测

一、实验材料

实验材料：小管福寿螺云南大理地理种群。

二、实验方法

1、基因组DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒，提取成螺腹足部肌肉组织的总DNA。参照试剂盒说明书进行，具体操作同实施例1。

2、EF1α序列的PCR扩增：同实施例1。

3、质粒的制备

采用Sanprep柱试PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司)回收扩增的EF1α序列产物；将回收产物连接到PMD^TM 19-T载体(宝生物工程大连有限公司)上，将连接产物转化到感受态大肠杆菌菌株JM109内，用含氨苄抗抗生素的LB固体培养基(抗生素终浓度为100μg/mL)进行初筛；挑取单克隆子进行菌落PCR，菌落PCR反应条件为及检测方法同实施例1。将测序结果经BLAST比对后，确定单菌落所属的种类。用灭菌的牙签挑取插入EF1α序列片段为小管福寿螺的单菌落和插入片段为斑点福寿螺的单菌落，分别放置于2mL的终浓度为100μg/mL抗生素的LB液体培养基中培养。

选取插入序列为小管福寿螺EF1α序列的单克隆菌液和插入序列为斑点福寿螺EF1α序列的单克隆菌液为材料，采用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(美国Axygen公司)进行质粒提取。提取方法参照说明书，具体如下：

(1)取2mL在LB液体培养基中培养过夜的菌液，11000rpm/min离心1min，弃尽上清。

(2)加入250μL Buffer S1(随试剂盒附带)悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀。

(3)加250μL Buffer S2(随试剂盒附带)，温和并充分地上下翻转4～6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。

(4)加350μL Buffer S3(随试剂盒附带)，温和并充分地上下翻转混合6～8次，11000rpm/min离心10min。

(5)取步骤(4)中的离心上清并转移到制备管(置于2mL离心管中)，11000rpm/min离心1min，弃滤液。

(6)将制备管置回离心管，加500μL W1(随试剂盒附带)，11000rpm/min离心1min，弃滤液。

(7)将制备管置回离心管，加700μL W2(随试剂盒附带)，11000rpm/min离心1min，弃滤液。

(8)重复步骤(7)。

(9)将制备管置回2mL离心管中11000rpm/min离心1min。

(10)将制备管移入新的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加入75μL灭菌水(预热至65℃)，室温静置1min，11000rpm/min离心1min。

(11)将获得质粒溶液保存在-20℃用于后面的研究。

4、引物特异性检测

以所得质粒为模板，采用实施例1所设计的针对小管福寿螺和斑点福寿螺的EF1α序列特异引物(表1)中的引物对EFFc/EFRc(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和EFFm/EFRm(SEQID NO.3和SEQ ID NO.4)组合成多重PCR扩增，从而检测实施例1所设计的引物(表1)的特异性。

(1)扩增体系：PCR反应总体积为25μL，其中Premix ExTaq^TM12.5μL(宝生物工程大连有限公司)，ddH₂O 7.5μL，DNA模板1μL(20ng/μL)，4条引物各1μL(浓度为10μM)。上游引物和下游引物在PCR反应体系中的终浓度均为0.4μM。

同时设置以水代替模板的阴性对照。

(2)扩增条件：94℃预变性 3min

(3)扩增产物检测：反应结束后，取PCR产物5μL点样于3.5％～4.0％的琼脂糖凝胶进行电泳35min，采用溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统中观察并成像。

三、实验结果

多重PCR检测结果如图1所示。

利用自行设计获得的引物对EFFc/EFRc和EFFm/EFRm来检测多重PCR方法下该引物对的特异性。多重PCR从插入片段为小管福寿螺EF1α序列的质粒扩增出一条125bp条带；从插入片段为斑点福寿螺EF1α序列的质粒扩增出一条151bp条带；从两种质粒的混合DNA中扩增出两条大小分别为125bp和151bp的条带。

综合以上实验结果，可见实施例1所设计的针对福寿螺EF1α序列特异引物(表1)具有较高的特异性。

实施例3、针对小管福寿螺和斑点福寿螺的杂交型检测

一、实验材料

二、实验方法

采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒，提取成螺腹足部肌肉组织的总DNA。参照试剂盒说明书进行，具体操作同实施例1。以所得基因组DNA为模板，采用实施例1所设计的针对小管福寿螺和斑点福寿螺的EF1α序列特异引物(表1)中的引物对EFFc/EFRc(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和EFFm/EFRm(SEQ ID NO.3和SEQID NO.4)组合成多重PCR扩增，从而检测小管福寿螺和斑点福寿螺不同地理种群样品的杂交型。

1、扩增体系：PCR反应总体积为25μL，其中Premix ExTaq^TM12.5μL(宝生物工程大连有限公司)，ddH₂O 7.5μL，模板1μL(20ng/μL)，4条引物各1μL(浓度为10μM)。上游引物和下游引物在PCR反应体系中的终浓度均为0.4μM。

同时设置以水代替模板的阴性对照。

2、扩增条件：94℃预变性3min

3、扩增产物检测：反应结束后，取PCR产物5μL点样于3.5％～4.0％的琼脂糖凝胶进行电泳35min，采用溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统中观察并成像。

三、实验结果

如图2所示，为本发明的多重PCR试剂盒对小管福寿螺和斑点福寿螺的杂交型检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(50bp DNA ladder)；其他泳道信息为1～9为不同地理种群的小管福寿螺基因组DNA；10～15为不同地理种群孤岛福寿螺基因组DNA；CK为以ddH₂O为阴性对照。

1、小管福寿螺的杂交型

利用自行设计获得的引物对EFFc/EFRc(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和EFFm/EFRm(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)扩增质粒DNA来检测多重PCR方法下该引物对的特异性。多重PCR从小管福寿螺浙江绍兴种群、湖南长沙种群、云南昆明种群扩增出一条125bp条带，为小管福寿螺纯合型；从广东广州种群、广西桂林种群、广东揭阳种群扩增出一条151bp片段，为斑点福寿螺纯合型；从云南大理种群、浙江舟山种群、浙江杭州种群扩增出两条大小分别为125bp和151bp的条带，为小管福寿螺-斑点福寿螺杂合型。

2、斑点福寿螺的杂交型

利用自行设计获得的引物对EFFc/EFRc(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和EFFm/EFRm(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)来检测多重PCR方法下该引物对的特异性。多重PCR从斑点福寿螺四川遂宁种群、四川成都种群、重庆合川种群扩增出一条125bp条带，为小管福寿螺纯合型；从浙江杭州种群、重庆沙坝种群和四川遂宁种群扩增出两条大小分别为125bp和151bp的条带，为小管福寿螺-斑点福寿螺杂合型。

综合以上实验结果，可见实施例1所设计的针对福寿螺EF1α序列特异引物(表1)具有较高的特异性，可以从不同地理种群的小管福寿螺和斑点福寿螺中鉴别出不同的杂交型。

本发明的有益效果主要体现在：本发明建立的方法通过多个特异性的保守位点设计特异性引物来区分两种福寿螺的EF1α基因片段，精准度上高于单一位点酶切的方法。通过建立多重PCR技术快速鉴别入侵我国小管福寿螺和斑点福寿螺杂交型，在检测时间和减低成本方面均优于传统的测序方法。

综上所述，本发明可以快速精准鉴别入侵我国小管福寿螺和斑点福寿螺杂交型。特异性引物设计来源于我国广大地理种群测序分析，且对福寿螺卵粒和成螺基因组DNA均可很好的检测，适用面广；本发明操作简便、成本低、检测精准，在技术解决了杂交型检测成本高、测不准、耗时长的问题，可用于检验检疫，海关，农业和植物保护部门以及高校研究所等检测研究。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒及其检测方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaccttagct gttagaactg 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtgtgcaga gaaattgctc ttcg 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtgaggta agtttcattc 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atatggcgtg cacaggaatt gttg 24

<210> 5

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaccttagct gttagaactg ggctgtgtgg tttatgcatt acattttgtg tccattggta 60

ccgtactagg gggagatgca aggaacaatt gaccacatta acgaagagca atttctctgc 120

acaca 125

<210> 6

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagtgaggta agtttcattc aaaacctaag atgttaaaac taggatgtgt ggttcatgca 60

ttacattttg tgtccattgg gaccatacat gtggaagctg caaggaacaa ttaaccacat 120

taatgaacaa caattcctgt gcacgccata t 151

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtgaataag atggacagca 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aatcctaacc tccaattttg t 21

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagcggataa caatttcaca cagg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

Claims

1.一种鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于包括如下两对引物对：

(1)由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物序列组成的引物对1；

(2)由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物序列组成的引物对2。

2.根据权利要求1所述的鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中组成两个引物对的四条引物的摩尔数相等。

3.根据权利要求1或2所述的鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述福寿螺为小管福寿螺、斑点福寿螺。

4.权利要求1所述的鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于还包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。

5.一种福寿螺杂交型的多重PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(a)进行PCR扩增的退火温度为56℃。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述引物对1和引物对2中的四种引物在PCR反应体系中的摩尔比为1:1:1:1。

8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于所述125bp的DNA片段序列如SEQID NO.5所示；所述151bp的DNA片段序序列如SEQ ID NO.6所示。