CN103276067A - 一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法，通过对枣实蝇mtDNA的COI基因片段进行测序，应用种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳(AGE)技术，筛选出了1对枣实蝇的特异性引物，特异引物序列分别为，CarF的引物序列为CTCAACTAAATTATTCCCCAGCA；CarR的引物序列为GGGTATCAATGCACAAATCCA；依据枣实蝇的卵、幼虫、蛹与其它实蝇类害虫形态的相近性，针对常见的实蝇类害虫桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇作为检验引物特异性的阴性对照，证明本发明设计的引物对枣实蝇的特异性，大大缩短了枣实蝇的鉴定周期，具有广泛的实用性。

Description

一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法

发明领域

本发明属于检疫性害虫检测领域，具体的，本发明涉及一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的技术领域。

背景技术

枣实蝇(Carpomya vesuviana Costa)是一种入侵重大检疫性害虫，属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae实蝇亚科Trypetinae实蝇族Trypetini咔实蝇属Carpomya Costa，原产于印度，是枣属植物的重要蛀果害虫，被列入我国“进境植物检疫性有害生物名录”。重大检疫性害虫枣实蝇(Carpomya vesuvianaCosta)于2007年在吐鲁番地区发现，对该地区枣产业造成了毁灭性损失，且疫情有向其它地区扩散的趋势(张润志等，2007；阿地力·沙塔尔等，2008)。随着中国经济的高速发展，无论是国内地区间还是国际间的商业贸易与人员往来都日渐频繁，枣实蝇的扩散几率也越来越高。而一旦枣实蝇入侵新的区域，往往会给入侵地的水果种植业和农业生产带来严重的后果，有的甚至会造成毁灭性的打击。枣实蝇的入侵可能对我国枣产业生产构成毁灭性危害，枣实蝇目前主要分布在意大利、高加索、毛里求斯、巴基斯坦、泰国、阿富汗等国家，在中国仅分布在新疆的吐鲁番地区，且疫情有向其它地区扩散的趋势。可见，当前最大的问题如何实现枣实蝇的快速检测鉴定。因此，枣实蝇的快速检验检疫在农业安全与植物检疫中愈来愈重要。然而，枣实蝇主要以幼虫蛀食果肉，成虫不危害枣果，通常可造成的产量损失高达20％以上，发生严重的可以导致全部枣果受到危害，从而严重影响到红枣的产品质量及其整体的商品价值。迄今为止，实蝇类害虫的种的鉴定主要依据成虫的形态特征，而卵、幼虫、蛹由于其特征差异小，且有些特征在其不同的发育时期不够稳定，因此依据形态学鉴定方法很难保证鉴定的准确度。即使枣实蝇的幼虫能依据形态学进行鉴定，但很大程度上依赖鉴定人员丰富的鉴定经验，这就制约了不同地区相关工作的进一步开展。在口岸检疫工作中，通常要将幼虫培养到成虫再进行鉴定，整个检疫鉴定过程时间长达数周，无法适应实际工作需要(Nakahara S et，2002；Naeo1e CK M et，2003；Muraji M et，2002)。显然，仅仅依靠形态学分析进行实蝇的系统发育关系与种类鉴定的研究，不能与日益增长的水果蔬菜贸易发展相协调，也不利于建立一个高效快速的检疫性实蝇的检测技术体系。从而造成检疫和防控工作具有相当大的困难。因此，非常有必要研究枣实蝇快速鉴定的新方法，特别是枣实蝇幼虫、蛹等未成熟虫态的快速鉴定方法。

目前，检验检疫部门对枣实蝇的鉴定主要以成虫的外部形态特征作为依据。但是，截获的往往是卵、幼虫或蛹等虫态，传统方法是对其进行室内饲养，待成虫羽化后再进行鉴定，这需要5d-15d的检测周期，无法适应检验检疫的快速验放要求。在检疫截获未成熟虫态(幼虫或蛹)的几率较大，一般情况下室内饲养至成虫大约需5d-15d左右的时间，检测周期较长，不能满足贸易性果蔬现场检疫快速通关的需求，因此利用分子生物学技术快速检疫鉴定害虫种类已成为趋势。

种特异引物PCR(species-specific PCR，SS-PCR)扩增技术是与通用引物PCR(universal-primers PCR，UP-PCR)技术相区别而提出来的，种特异引物常规PCR技术的原理与普通PCR扩增相似，只是在根据靶序列进行引物设计时，需要充分考虑引物的特异性，用特异性强的引物扩增未知模板，通过检测目标片段的有无，达到把目标种与其他种鉴别开来的目的。然而，自从枣实蝇发生以来，除了形态学鉴定之外，目前国内外还没有一套枣实蝇特异引物PCR鉴定技术。

发明内容

针对现有技术中未见报道专门针对检疫性害虫枣实蝇公开枣实蝇特异引物PCR鉴定技术现状。本发明为了提供了一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法，能够准确及时对截获的疑似枣实蝇的卵、蛹、幼虫、成虫及残体等进行鉴定，从而建立一种快速鉴定枣实蝇的方法。

本发明的技术方案：本发明通过对枣实蝇mtDNA的COI基因片段进行测序，应用种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳(AGE)技术，筛选出了1对枣实蝇的特异性引物；依据枣实蝇的卵、幼虫、蛹与其它实蝇类害虫形态的相近性，针对桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇等检疫中较常见的实蝇类害虫，作为检验引物特异性的阴性对照，证明在实验涉及到的这些近缘种范围内，本发明设计的引物对枣实蝇的特异性，从而建立了常规PCR鉴定枣实蝇的方法，大大缩短了枣实蝇的鉴定周期。

本发明具体提供了一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法，具体方法如下：

(1)应用种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳(AGE)技术，筛选出了1对枣实蝇的特异性引物CarF和CarR。SS-PCR在定量梯度PCR仪(Biometra)上进行，反应体系：10mmol/L10×Buffer，0.25mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/LdNTP，上下游引物各0.1umol/L，1UTaq酶(Takara)，模板DNA1μL，加水至总体积25μL，反应条件为94℃/5min，95℃/40s，57℃/30s，72℃/1min，33个循环，最后72℃延伸5min；分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30min(90V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度；获得一对特异性引物CarF和CarR，该一对引物可以快速、准确、特异性的检测出枣实蝇的各个虫态甚至是残体，CarF的引物序列为CTCAACTAAATTATTCCCCAGCA；CarR的引物序列为GGGTATCAATGCACAAATCCA。

(2)采用SS-PCR引物的种特异性进行检验：分别以单头桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇的DNA为模板，枣实蝇为阳性对照，检验枣实蝇特异片段扩增引物CarF和CarR的种特异性；为了检查常规PCR方法下CarF和CarR引物的特异性，实验材料中除待鉴定区分的枣实蝇之外，还将桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇等其它5种同源性较高的实蝇一起进行常规PCR反应，筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异性引物CarF/CarR常规PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳之后，除了枣实蝇在205bp处有一条特异性扩增的条带外，阴性对照和其它桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇5种实蝇均无特异性目标片段，从而证明该引物在实验涉及到的这些近缘种范围内，能特异性的鉴定枣实蝇；为此将桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇常见的实蝇类害虫作为检验引物特异性的阴性对照。

具体的，本发明进一步提供了一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法，其具体方法步骤如下：

(1)枣实蝇基因组DNA的提取。选用枣实蝇的标本，采用试剂盒推荐的方法来提取基因组DNA和测序。

(2)枣实蝇的特异性引物设计：以目标枣实蝇线粒体DNA(mtDNA)中COI基因序列为目标序列，序列号为HQ687210，借助常用的CLUSTAL方法，与己知其它种类的实蝇的COI基因序列进行比较分析，序列号为FJ571364.1、FJ571365.1和GQ175824.1，利用primer5人工设计引物，引物用primer5软件检查引物错配、二聚体和发夹结构，并用GenBank中提供的Blast程序检查同源序列，通过筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异引物CarF和CarR对，特异引物序列分别为：

CarF的引物序列为CTCAACTAAATTATTCCCCAGCA；

CarR的引物序列为GGGTATCAATGCACAAATCCA；

引物筛选的原则是所有引物在标准的SS-PCR的反应体系和反应条件下，能特异地鉴定出枣实蝇。

(3)DNA质量检查：枣实蝇DNA提取质量用引物对can-F/can-R来检查。引物序列为can-F：AAGAGCGACGGGCGATG；can-R：CTAGGATTAGATAC CCTATT。该引物对是专门用于检查实蝇类昆虫模板DNA质量的通用引物，经过PCR反应后，分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30min(90V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度，确切的DNA浓度通过核酸蛋白检测仪测定。

(4)SS-PCR引物的种特异性检验：分别以单头桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇的DNA为模板，枣实蝇为阳性对照，检验枣实蝇特异片段扩增引物CarF和CarR的种特异性。SS-PCR在定量梯度PCR仪(Biometra)上进行，反应体系：10mmol/L10×Buffer，0.25mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/LdNTP，上下游引物各0.1umol/L，1UTaq酶(Takara)，模板DNA1μL，加水至总体积25μL，反应条件为94℃/5min，95℃/40s，57℃/30s，72℃/1min，33个循环，最后72℃延伸5min。分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30min(90V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度。

(5)SS-PCR引物对不同虫态的扩增效果以及灵敏度检测：分别以提取的幼虫、蛹和成虫不同虫态的枣实蝇DNA为模板，进行靶标片段扩增效果检验，取不同浓度的成虫DNA模板进行最低检出阈值的测定，SS-PCR方法的检测限度达0.1pg以下，最适模板DNA浓度为1～20ng。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。

(1)本发明通过对枣实蝇mtDNA的COI基因片段进行测序，设计了枣实蝇15对引物基础上，应用种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳(AGE)技术，筛选出了1对枣实蝇的特异性引物CarF和CarR。针对枣实蝇的卵、幼虫、蛹与其它实蝇类害虫形态十分相近，然而桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇属于我国口岸检疫中较常见的实蝇类害虫，所以将这些种类作为检验引物特异性的阴性对照，证明在实验涉及到的这些近缘种范围内，本发明设计的引物对枣实蝇的特异性，从而建立了常规PCR鉴定枣实蝇的方法，大大缩短了枣实蝇的鉴定周期。采用种特异性PCR(species-specificPCR，SS-PCR)进行快速鉴定枣实蝇技术的研究，旨在为有效阻截枣实蝇的进一步传播扩散。

(2)现有技术中，实蝇形态鉴定的周期约需15～25天，由于检测周期较长，不能满足贸易性果蔬的现场检疫快速通关的需求。本发明所设计的引物能对不同虫态能进行特异性扩增，结果准确可靠，表明在试验涉及到的这些近缘种范围内对枣实蝇的特异性，从而建立了常规PCR鉴定枣实蝇的方法。解决了长期困扰口岸检验检疫人员的问题，它不受材料的限制，如个体的残缺、虫态等，只要获得微量的DNA，成虫、幼虫、蛹、卵均能检测，本发明可将枣实蝇的鉴定缩短到一天之内，从而能大大缩短检测周期，技术操作简便快捷，缩短了通关时间，提高了工作效率。因此，该技术体系可以用于枣实蝇的检测鉴定工作，并在检疫性害虫的检疫检验与检测监测中具有重要应用价值。

附图说明

图1为can-F/can-R引物PCR模板DNA质量电泳图，图中，1为桔小实蝇；2为番石榴实蝇；3为瓜实蝇；4为南瓜实蝇；5为桃果实蝇；6为枣实蝇；7为阴性对照(模板为水)；M为DL2000DNA Marker。

图2为特异性引物PCR特异性检测枣实蝇图，图中，1为桔小实蝇；2为番石榴实蝇；3为瓜实蝇；4为南瓜实蝇；5为桃果实蝇；6为枣实蝇；7为阴性对照(模板为水)；M为DL2000DNA Marker。

图3为不同浓度枣实蝇成虫DNA模板常规PCR电泳图，图中，1为40ng；2为20ng；3为10ng；4为1ng；5为0.1ng；6为0.01ng；7为0.001ng；8为阴性对照(模板为水)；M为DL2000DNA Marker。

图4为枣实蝇不同虫态的常规PCR特异性检测图，图中，1为幼虫larval；2为蛹pupa；3为成虫adult；4为阴性对照(模板为水)；M为DL2000DNA Marker。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中设备和材料有：

采用的枣实蝇(幼虫、蛹和成虫)：采自新疆吐鲁番地区的鄯善县，托克逊县及吐鲁番市不同地区地点。桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇为成虫，由新疆出入境检验检疫局提供。所有实蝇标本均用体视显微镜鉴定，以确定种类。用于分子生物实验的实蝇标本用100％酒精浸泡并保存于4℃冰箱。鉴于枣实蝇的卵、幼虫、蛹与其它实蝇类害虫形态十分相似而难以区分，依据桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇属于检疫中较常见的实蝇类害虫，所以将这些种类作为检验引物特异性的阴性对照。采用枣实蝇对照标准标本采用中国科学院动物所提供。

采用的酶及其他试剂：采用的Solution A、SolutionC、RnaseAI、试剂B、Filter cup、DB buffer、Spin column、RinseA、RinseB均包含Takara试剂盒其中，都购自宝生物工程(大连)有限公司，Taq酶、PCR反应体系试剂(dNTP、10×buffer和Mg²⁺)、琼脂糖、EB、2000bp Ladder Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司。动物组织基因组DNA提取试剂盒，Taq酶、PCR反应体系试剂(dNTP、10×buffer和Mg²⁺)、琼脂糖、EB、DL2000DNAMarker均购自庄盟生物有限公司。

主要仪器设备：Biometra定量梯度PCR仪(华粤)、TGL-1613台式高速离心机(上海)、DYY-12C多功能电泳仪(北京市六一仪器厂)、D56-26M型数字图像分析仪(北京市六一仪器厂)、Thermo Nanodrop2000超微量紫外分光光度计(北京科誉兴业科技发展有限公司)、SANYOMLS-3750全自动高压灭菌仪(上海中庸检验设备有限公司)、XMTD-4000水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)、MDF-382E(N)SANYO超低温冰箱(上海中庸检验设备有限公司)等。

本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法

采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法，主要的发明点如下：

(1)应用种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳(AGE)技术，筛选出了1对枣实蝇的特异性引物。SS-PCR在定量梯度PCR仪(Biometra)上进行，反应体系：10mmol/L10×Buffer，0.25mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/LdNTP，上下游引物各0.1umol/L，1UTaq酶(Takara)，模板DNA1μL，加水至总体积25μL，反应条件为94℃/5min，95℃/40s，57℃/30s，72℃/1min，33个循环，最后72℃延伸5min；分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30min(90V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度；获得一对特异性引物CarF和CarR，该一对引物可以快速、准确、特异性的检测出枣实蝇的各个虫态甚至是残体，

CarF的引物序列为：CTCAACTAAATTATTCCCCAGCA；

CarR的引物序列为GGGTATCAATGCACAAATCCA。

(2)采用SS-PCR引物的种特异性进行检验：分别以单头桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇的DNA为模板，枣实蝇为阳性对照，检验枣实蝇特异片段扩增引物CarF和CarR的种特异性；为了检查常规PCR方法下CarF和CarR引物的特异性，实验材料中除待鉴定区分的枣实蝇之外，还将桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇等其它5种同源性较高的实蝇一起进行常规PCR反应，筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异性引物CarF/CarR常规PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳之后，除了枣实蝇在205bp处有一条特异性扩增的条带外，阴性对照和其它桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇5种实蝇均无特异性目标片段，从而证明该引物在实验涉及到的这些近缘种范围内，能特异性的鉴定枣实蝇；为此将桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇常见的实蝇类害虫作为检验引物特异性的阴性对照。

具体的，本发明进一步提供了一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法，其具体步骤如下：

(1)枣实蝇基因组DNA的提取。选用枣实蝇的标本，采用试剂盒推荐的方法来提取基因组DNA和测序。

(2)枣实蝇的特异性引物设计：以目标枣实蝇线粒体DNA(mtDNA)中COI基因序列为目标序列，序列号为HQ687210，借助常用的CLUSTAL方法，与己知其它种类的实蝇的COI基因序列进行比较分析，序列号为FJ571364.1、FJ571365.1和GQ175824.1，利用primer5人工设计引物，引物用primer5软件检查引物错配、二聚体和发夹结构，并用GenBank中提供的Blast程序检查同源序列，通过筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异引物CarF和CarR，特异引物序列分别为，序列具体参见表1，

CarF的引物序列为CTCAACTAAATTATTCCCCAGCA；

CarR的引物序列为GGGTATCAATGCACAAATCCA；

引物筛选的原则是所有引物在标准的SS-PCR的反应体系和反应条件下，能特异地鉴定出枣实蝇。

(3)DNA质量检查：枣实蝇DNA提取质量用引物对can-F/can-R来检查。

引物序列为can-F：AAGAGCGACGGGCGATG；

can-R：CTAGGATTAGATAC CCTATT。

该引物对是专门用于检查实蝇类昆虫模板DNA质量的通用引物，经过PCR反应后，分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30min(90V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度，确切的DNA浓度通过核酸蛋白检测仪测定。

(4)SS-PCR引物的种特异性检验：分别以单头桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇的DNA为模板，枣实蝇为阳性对照，检验枣实蝇特异片段扩增引物CarF和CarR的种特异性。SS-PCR在定量梯度PCR仪(Biometra)上进行，反应体系：10mmol/L10×Buffer，0.25mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/LdNTP，上下游引物各0.1umol/L，1UTaq酶(Takara)，模板DNA1μL，加水至总体积25μL，反应条件为94℃/5min，95℃/40s，57℃/30s，72℃/1min，33个循环，最后72℃延伸5min。分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30min(90V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度。

(5)SS-PCR引物对不同虫态的扩增效果以及灵敏度检测：分别以提取的幼虫、蛹和成虫不同虫态的枣实蝇DNA为模板，进行靶标片段扩增效果检验，取不同浓度的成虫DNA模板进行最低检出阈值的测定，SS-PCR方法的检测限度达0.1pg以下，最适模板DNA浓度为1～20ng。

表1PCR引物(从5’到3’端)

引物名称	引物序列
		CarF	CTCAACTAAATTATTCCCCAGCA
CarR	GGGTATCAATGCACAAATCCA

本发明中，采用的目标枣实蝇线粒体DNA(mtDNA)中COI基因序列(序列号：HQ687210)为目标序列，该序列为申请人首条枣实蝇基因序列；己知其它种类的实蝇的COI基因序列主要为：序列号为FJ571364.1，Carpomya schineriisolate R141cytochrome oxidase subunit I(COI)gene，partial cds；序列号为FJ571365.1，Carpomya schineriisolate R248cytochrome oxidase subunit I(COI)gene，partial cds；以及序列号为GQ175824.1Rhagoletis completa cytochrome coxidase subunit I(COI)gene，partial cds；tRNA-Leu(trnL)gene，complete sequence；and cytochrome c oxidase subunit II(COII)gene，partial cds。

通过上述提供的快速鉴定枣实蝇的方法，通过对枣实蝇mtDNA的COI基因片段进行测序，设计了枣实蝇15对引物基础上，应用种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳(AGE)技术，筛选出了1对枣实蝇的特异性引物CarF和CarR。针对枣实蝇的卵、幼虫、蛹与其它实蝇类害虫形态十分相近，然而桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇属于我国口岸检疫中较常见的实蝇类害虫，所以将这些种类作为检验引物特异性的阴性对照，证明在实验涉及到的这些近缘种范围内，本发明设计的引物对枣实蝇的特异性，从而建立了常规PCR鉴定枣实蝇的方法，大大缩短了枣实蝇的鉴定周期。采用种特异性PCR(species-specific PCR，SS-PCR)进行快速鉴定枣实蝇技术的研究，旨在为有效阻截枣实蝇的进一步传播扩散。

现有技术中，实蝇形态鉴定的周期约需15～25天，由于检测周期较长，不能满足贸易性果蔬的现场检疫快速通关的需求。本发明所设计的引物能对不同虫态能进行特异性扩增，结果准确可靠，表明在试验涉及到的这些近缘种范围内对枣实蝇的特异性，从而建立了常规PCR鉴定枣实蝇的方法。解决了长期困扰口岸检验检疫人员的问题，它不受材料的限制，如个体的残缺、虫态等，只要获得微量的DNA，成虫、幼虫、蛹、卵均能检测，本发明可将枣实蝇的鉴定缩短到一天之内，从而能大大缩短检测周期，技术操作简便快捷，缩短了通关时间，提高了工作效率。因此，该技术体系可以用于枣实蝇的检测鉴定工作，并在检疫性害虫的检疫检验与检测监测中具有重要应用价值。

实施例二：DNA质量检查

枣实蝇DNA提取质量用引物对can-F/can-R来检查。该引物对是专门用于检查实蝇类昆虫模板DNA质量的通用引物，定量梯度PCR仪反应体系包括10×Buffer(不含Mg²⁺)2.5μL，25mmol Mg²⁺2.5μL，2.5mmol dNTP2.5μL，10μmol上下游引物各1μL，1UTaq酶，模板DNA1μL，加水至总体积25μL，反应条件为94℃/5min，95℃/40s，55℃/30s，72℃/1min，30个循环，最后72℃延伸7min。PCR反映结束后，分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30min(90V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度，确切的DNA浓度通过核酸蛋白检测仪测定(吴佳教等，2005；Jamnonglik W et，2003)。

为了避免假阴性现象的出现，枣实蝇DNA提取质量用引物can-F/can-R来检查，六种实蝇模板DNA扩增结果参见附图1。由附图1可知：COI基因通用引物对阴性对照组成功扩增，在600-700bp之间目标片段的位置有一条扩增带，亮度差异表示模板浓度的差异。DNA确切浓度和纯度通过核酸蛋白检测仪来测定。

实施例三：SS-PCR鉴定枣实蝇

引物特异性验证：本发明通过筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异性引物1对，为了检查常规PCR方法下该引物的特异性，实验材料中除待鉴定区分的枣实蝇之外，还将桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇等其它5种同源性较高的实蝇一起进行常规PCR反应，筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异性引物CarF/CarR，常规PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳，参见附图2。由附图2可知，除了枣实蝇在205bp处有一条特异性扩增的条带外，阴性对照和其它5种实蝇均无特异性目标片段，从而证明该引物在实验涉及到的这些近缘种范围内，能特异性的鉴定枣实蝇。

SS-PCR方法的检测灵敏度：SS-PCR方法的检测灵敏度分别用40ng，20ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng0.001ng等7种不同浓度的枣实蝇DNA模板来确定，参见附图3。由附图3可见当模板浓度为0.001ng时，没有扩增出特异性条带，当模板浓度为0.01ng时仅出现了微量的目标条带，扩增带十分弱，然而当模板浓度大于0.1ng时，均能产生特异性条带。结果表明，SS-PCR方法的检测限度达0.1pg以下，最适模板DNA浓度为1～20ng。本研究所设计的引物能对不同虫态能进行特异性扩增，结果准确可靠，表明在试验涉及到的这些近缘种范围内对枣实蝇的特异性，从而建立了常规PCR鉴定枣实蝇的方法。

SS-PCR在枣实蝇快速鉴定上的应用：特异性引物常规PCR的可靠性分别用枣实蝇幼虫、蛹和成虫三种不同的虫态来验证。实验结果表明，常规PCR不受虫态限制，不同虫态均能特异性扩增参见附图4.说明特异引物常规PCR的特异性与引物的特异性和模板的浓度决定，而与标本的虫态及存活状态无关。

SS-PCR产物测序：除了对SS-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查枣实蝇特异引物扩增的特异片段大小是否有预期的一致外，同时分别对特异引物的SS-PCR产物进行测序并进行序列分析，将序列与原序列进行比较，进一步确认产物的特异性。实验结果表明，PCR产物的测序结果与原序列一致，序列均如下所示：

CTCAACTAAATTATTCCCCAGCAATATTATGAGCTTTAGGATTTGTATTTTTATTTACAGTAGGAGGATTAACAGGAGTAGTATTAGCAAATTCATCAGTTGATATTATTCTTCATGACACTTATTATGTAGTTGCTCATTTTCATTATGTACTATCAATAGGAGCTGTATTTGCTATTATAGCTGGATTTGTGCATTGATACCC

实施例四：枣实蝇的形态鉴定

对枣实蝇幼虫和蛹进行形态学观察，解剖镜下观察幼虫的头部特征、气门形状、尾部特征，蛹的气门特征等，并进行拍照，同时对多余的幼虫和蛹进行室内培养。枣实蝇标本的鉴定根据枣实蝇的形态学特征，用体式显微镜观察各鉴定部位包括头部、复眼、喙、中胸背板、翅脉、臀条、腹部、雌雄虫生殖器、根据《实蝇类重要害虫鉴定图册》外部形态进行鉴定，从而确定本发明所用的材料均为枣实蝇。

实施例五：采用实蝇模式标本试剂盒的方法来提取枣实蝇基因组DNA

取四头枣实蝇的蛹放入冰浴预冷的收集管(collection Tube)中，用研磨棒快速研磨成糊状，加入350μl的Solution A和0.9μl的RnaseAI后用研磨棒加速研磨成匀浆，再加入350μl的Solution A将研磨棒上的匀浆冲入collectionTube中，充分振荡混匀后65℃保温5min后，加入4μl的试剂B，经充分混匀后，加入1ml事先在4℃冰箱里预冷的溶液SolutionC，充分混合后12000rpm离心3min，除去上面一层清液，再加入1ml事先在4℃冰箱里预冷的溶液SolutionC，震荡混合后12000rpm离心2min；除去上面一层带有蓝色有机相清液，然后将无色下层的水相溶液转置于collection Tube上面的Filter cup中，12000rpm离心1min，除去Filter cup，在滤液中加入DB buffer400μl并充分混匀，将试剂盒中的Spin column安放于collection Tube上，12000rpm离心lmin，除去过滤后剩余的液体；将500μl的RinseA加入至Spin column中12000rpm离心30sec，除去过滤后剩余的液体；在Spin column中加入700μl的RinseB进行离心12000rpm30sec，除去过滤后剩余的液体；试剂盒中的Spin column安置于collection Tube上，12000rpm离心1min，除去过滤后剩余的液体；将Spin column安置于1.5ml的离心管上，静置几分钟，等酒精挥发完后，将60-100μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer在Spin column膜的中央处加入，在室温条件下放置1min，经12000rpm离心1min，洗脱DNA。

上述步骤中，因为上层(有机相)带有蓝色，必须除尽。为了防止DNA结合到DNA制备膜上，不必考虑相间沉淀，在过滤时将会被去除。

上述步骤中，请确认是否已将指定体积的无水乙醇加入RinseB中。加入时应沿着Spin column管壁四周，这样可以完全将粘附在管壁上的盐分冲洗干净。

上述步骤中，应将Elution Buffer或者灭菌后的蒸馏水加热至65℃，这样使用时有利于提高洗脱效率。

Claims (1)

1.一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法，其特征在于，具体方法步骤如下：

(1)枣实蝇基因组DNA的提取：选用枣实蝇的标本，采用试剂盒推荐的方法来提取基因组DNA和测序；

(2)枣实蝇的特异性引物设计：以目标枣实蝇线粒体DNA(mtDNA)中COI基因序列为目标序列，序列号为HQ687210，借助常用的CLUSTAL方法，与己知其它种类的实蝇的COI基因序列进行比较分析，序列号为FJ571364.1、FJ571365.1和GQ175824.1，利用primer5人工设计引物，引物用primer5软件检查引物错配、二聚体和发夹结构，并用GenBank中提供的Blast程序检查同源序列，通过筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异引物CarF和CarR一对，特异引物序列分别为：

CarF的引物序列为CTCAACTAAATTATTCCCCAGCA；

CarR的引物序列为GGGTATCAATGCACAAATCCA；

引物筛选的原则是所有引物在标准的SS-PCR的反应体系和反应条件下，能特异地鉴定出枣实蝇；

(3)DNA质量检查：枣实蝇DNA提取质量用引物对can-F/can-R来检查；引物序列为can-F：AAGAGCGACGGGCGATG；can-R：CTAGGATTAGATACCCTATT；该引物对是专门用于检查实蝇类昆虫模板DNA质量的通用引物，经过PCR反应后，分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30min(90V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度，确切的DNA浓度通过核酸蛋白检测仪测定；

(4)SS-PCR引物的种特异性检验：分别以单头桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇的DNA为模板，枣实蝇为阳性对照，检验枣实蝇特异片段扩增引物CarF和CarR的种特异性；SS-PCR在定量梯度PCR仪(Biometra)上进行，反应体系：10mmol/L10×Buffer，0.25mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/LdNTP，上下游引物各0.1umol/L，1UTaq酶(Takara)，模板DNA1μL，加水至总体积25μL，反应条件为94℃/5min，95℃/40s，57℃/30s，72℃/1min，33个循环，最后72℃延伸5min；分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30min(90V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度；

(5)SS-PCR引物对不同虫态的扩增效果以及灵敏度检测：分别以提取的幼虫、蛹和成虫不同虫态的枣实蝇DNA为模板，进行靶标片段扩增效果检验，取不同浓度的成虫DNA模板进行最低检出阈值的测定，SS-PCR方法的检测限度达0.1pg以下，最适模板DNA浓度为1～20ng。

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