CN102367484B - 一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用 - Google Patents
一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102367484B CN102367484B CN 201110350480 CN201110350480A CN102367484B CN 102367484 B CN102367484 B CN 102367484B CN 201110350480 CN201110350480 CN 201110350480 CN 201110350480 A CN201110350480 A CN 201110350480A CN 102367484 B CN102367484 B CN 102367484B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- meloidogyne
- primer
- knot
- root knot
- nematode
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241001143352 Meloidogyne Species 0.000 title abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 7
- 241000533845 Enterolobium cyclocarpum Species 0.000 title abstract description 5
- -1 pplication Species 0.000 title abstract 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 5
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 4
- 241000831628 Meloidogyne enterolobii Species 0.000 claims 5
- 241001677344 Meloidogyne ethiopica Species 0.000 claims 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241001065750 Meloidogyne mayaguensis Species 0.000 description 50
- 241000243785 Meloidogyne javanica Species 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 21
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 241000243786 Meloidogyne incognita Species 0.000 description 10
- 241000243784 Meloidogyne arenaria Species 0.000 description 9
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 7
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 5
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 5
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 5
- 240000008436 Ipomoea aquatica Species 0.000 description 4
- 235000019004 Ipomoea aquatica Nutrition 0.000 description 4
- 241001143337 Meloidogyne graminicola Species 0.000 description 4
- 241000243787 Meloidogyne hapla Species 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000244173 Rhabditis Species 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 3
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000281702 Dioscorea villosa Species 0.000 description 1
- 241000399949 Ditylenchus dipsaci Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001415148 Hirschmanniella oryzae Species 0.000 description 1
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 1
- 241000611260 Meloidogyne chitwoodi Species 0.000 description 1
- 241001151245 Meloidogyne dunensis Species 0.000 description 1
- 241001113272 Meloidogyne exigua Species 0.000 description 1
- 241001237450 Meloidogyne fallax Species 0.000 description 1
- 241001220509 Meloidogyne graminis Species 0.000 description 1
- 241001024148 Meloidogyne hispanica Species 0.000 description 1
- 241001143340 Meloidogyne konaensis Species 0.000 description 1
- 241001143343 Meloidogyne paranaensis Species 0.000 description 1
- 241001331182 Meloidogyne thailandica Species 0.000 description 1
- 241001336635 Meloidogyne trifoliophila Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008135 Piscidia piscipula Species 0.000 description 1
- 241000193945 Pratylenchidae Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000702971 Rotylenchulus reniformis Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 235000000485 Smilax china Nutrition 0.000 description 1
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 1
- 244000305550 Streptopus amplexifolius Species 0.000 description 1
- 235000001231 Streptopus amplexifolius Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- WZRZTHMJPHPAMU-UHFFFAOYSA-L disodium;(3e)-3-[(4-amino-3-sulfonatophenyl)-(4-amino-3-sulfophenyl)methylidene]-6-imino-5-methylcyclohexa-1,4-diene-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C(=N)C(C)=CC1=C(C=1C=C(C(N)=CC=1)S([O-])(=O)=O)C1=CC=C(N)C(S(O)(=O)=O)=C1 WZRZTHMJPHPAMU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 244000079386 endoparasite Species 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用。本发明设计了扩增根结线虫的通用引物MF、MR和扩增象耳豆根结线虫的特异性引物FMe和RMe，以含有根结线虫的单根结DNA为模板进行PCR扩增反应；将PCR扩增反应产物进行脂糖电泳检测，根据条带有无和大小方面地获得检测结果；所述引物的序列分别如表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。本发明一步双重PCR的检测方法在提高分子检测速度和灵敏度的同时且准确，在象耳豆根结线虫检测方面具有很高的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种象耳豆根结线虫的检测方法与应用。
背景技术
植物根结线虫(Meloidogyne)是植物根系专性内寄生物，分布遍及世界大部分地区。因其适应性强、传播途径多样、可侵染多种植物，而成为世界性威胁农业生产的主要病原物，给农业生产者造成极大的经济损失。我国根结线虫种类繁多，分布广泛，除常见的南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、北方根结线虫(M.hapla)和花生根结线虫(M.arenaria)4种主要的根结线虫外，近年来调查表明象耳豆根结线虫(M.enterolobii)在我国南方地区分布较广，并且危害严重。
象耳豆根结线虫是1983年报道于我国海南省儋州的一个新种，原始寄主是象耳豆树。近年来研究发现该线虫可以寄生豆科、茄科、葫芦科中的多种经济作物以及番石榴等热带水果，更为重要的是该线虫还可以侵染携带Mi抗性基因的番茄、辣椒、烟草等。2008年，象耳豆根结线虫首次在欧洲被报道。同年，EPPO报道在中国出口至欧洲的玫瑰花上截获到该线虫，EPPO对该线虫进行风险评估，认为该线虫对中欧地区作物存在较大的风险。值得关注的是，Karssen等在2008年确认玛雅古根结线虫(M.mayaguensis)是象耳豆根结线虫的同种异名。玛雅古根结线虫在非洲、南北美洲及欧洲均有分布，可以寄生的寄主超过8科20种植物，是国际上公认的危害最大的根结线虫之一。可见象耳豆根结线虫已成为全球热带、亚热带地区作物的一个重要病原物，且可能影响到我国的国际贸易。
然而，常规鉴定方法很难对象耳豆根结线虫进行准确鉴定，因为象耳豆根结线虫的会阴花纹同南方根结线虫的会阴花纹非常相似。分子鉴定基本可满足象耳豆根结线虫的检测鉴定，但模板DNA均来自线虫。因此，探索新的灵敏度高的引物、能够直接对单个根结DNA进行稳定扩增从而实现对象耳豆根结线虫快速检测具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有象耳豆根结线虫快速检测技术的不足，提供一种新的象耳豆根结线虫单根结的检测方法。
本发明另一个目的是提供所述检测方法的应用。
本发明的技术问题通过下述技术方案予以实现：
提供一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法，通过优化的聚合酶链反应检测象耳豆根结线虫，包括以下步骤：
(1)设计和合成引物；
(2)培养根结线虫，提取含有根结线虫的单根结DNA；
(3)以含有根结线虫的单根结DNA为模板进行PCR扩增反应；
(4)将PCR扩增反应反应产物进行脂糖电泳检测。
步骤(1)所述引物是根据植物线虫大亚基核糖体DNA(基因登录号为：AF435803、AF435794、AY446970、JN005857、FN429017、GQ375158、EU364890、EU570214、AF435793、AF435802、FJ485651、DQ328713、HQ688681、EU130893和EU368591)的D2D3设计一对根结线虫通用引物MF和MR；再根据根结线虫mtDNA COII和lrRNA基因(基因登录号为：FJ159631、AY635612、GQ266686、GQ266685、AY446970、GQ870255、AY757882、GQ865513、HM161680、AY635609、AY757909、AY942848、AY942851和EU364883)间区域种间差异设计一对扩增象耳豆根结线虫的特异性引物FMe和RMe。所述引物的核苷酸序列为：
MF：5’-GGGGATGTTTGAGGCAGATTTGT-3’；
MR：5’-AACCGCTTCGGACTTCCACCAG-3’；
FMe：5’-CATTCATTTATACCAATTTTAGTTGAGG-3’；
RMe：5’-CAATTATTGAATATTTTTTCCCAAACGA-3’。
步骤(2)所述提取含有根结线虫的单根结DNA的步骤如下：
将单个根结放入加了45μl 50mM NaOH的离心管中，用研磨杵捣碎后以最大速度水平振荡3～5min，短暂离心后95℃水浴10min，然后加入5μl1M Tris-HCl(pH值为8.0)，混匀，12,000g离心30s，直接进行下一步的PCR反应或-20℃保存备用。
步骤(3)所述扩增反应是以步骤(2)提取的DNA作为模板，采用双重PCR法进行扩增。
所述PCR反应体系为：2×PCR buffer12.5μl，dNTPs(2mmol/L)5μl，MF(10μmol/L)0.2μl，MR(10μmol/L)0.2μl，FMe(10μmol/L)0.6μl，RMe(10μmol/L)0.6μl，KOD Fx 0.5U，DNA模板4.0μl和余量ddH2O，共25.0μl。
所述双重PCR扩增反应条件如下：
94℃预变性2min；94℃变性30s，64℃退火30s，68℃延伸30s，共40个循环；最后72℃后延伸5min。
步骤(4)所述琼脂糖电泳检测是将5μl所述扩增反应产物用1％琼脂糖电泳分离，根据条带有无和大小可判定鉴定结果。
本发明提供了所述检测方法的应用，具体是应用于象耳豆根结线虫快速检测方面，可较好地应用于象耳豆根结线虫的田间检测。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种单个根结DNA的快速制备方法并提供象耳豆根结线虫特异性引物序列和根结线虫通用引物序列，基于所述引物组成双重PCR体系一步法快速特异性检测象耳豆根结线虫。进行所述检测的操作人员无需先分离线虫，线虫核酸的提取时间约30min，大大缩减检测时间，在提高分子检测灵敏度的同时且快速准确，在象耳豆根结线虫快速检测方面具有很高的实际应用价值。
附图说明
图1接种象耳豆根结线虫不同时期番茄根结及其内部线虫形态；
图2接种象耳豆根结线虫不同时期黄瓜根结及其内部线虫形态；
图3接种象耳豆根结线虫不同时期雍菜根结及其内部线虫形态；
图4引物MF/MR和FMe/RMe特异性检测双重PCR结果；
图5接种番茄不同根结线虫后不同时期单根结双重PCR扩增结果；
图6接种黄瓜不同根结线虫后不同时期单根结双重PCR扩增结果；
图7接种雍菜不同根结线虫后不同时期单根结双重PCR扩增结果；
图8田间病株单根结双重PCR检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
(1)单根结DNA的获得
播种番茄(夏红一号)、青瓜(新万吉)和蕹菜25天后移苗至直径15cm的装有灭菌土的花盆中，每盆1株。移苗一周后，每株分别接种200条象耳豆根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫的2龄幼虫(J2)，同时保留不接虫的健康植株作为对照，置于光照培养室14h光照，10h黑暗条件下25℃恒温培养。分别于接种后5d、10d、15d、20d、25d、30d染色观察线虫形态。同时提取健康根组织DNA和单根结DNA，每个处理取5个重复，设1个空白对照。
根部组织染色及不同时期线虫形态观察，步骤如下：
(1)洗净根组织，放入150ml的烧杯中；
(2)加入50ml蒸馏水，并加入适量的5.25％(体积比浓度)的次氯酸钠(30～50ml)；
(3)用玻璃棒不断搅拌杯内根部组织；
(4)4min后取出根组织用清水洗45s，然后在ddH2O内浸泡15min；
(5)倒出水，将根组织移入另一个装有30～50ml ddH2O的烧杯中，加入1ml酸性品红溶液；
(6)水浴或微波炉将组织液煮沸30s，(幼根反复煮沸2～3次；老根煮沸2～3min)；
(7)冷却后用水漂洗根组织，4倍镜下测量根结直径，然后解剖镜下压片镜检观察线虫形态并计数。
单根结样品制备：对接种2个南方根结线虫种群(GNs和ZCdg)，2个爪哇根结线虫种群(GNk和ZCf)，1个花生根结线虫种群(YZy)和4个象耳豆根结线虫种群(PY1，HYz，GNj和GNc)的黄瓜(附图1)、番茄(附图2)、蕹菜(附图3)分别于5d、10d、15d、20d、25d、30d用NaOH裂解的方法提取单根结DNA，同时设一个不接虫的健康根组织DNA作为阴性对照，每棵根取10个根结。提取时，将单个根结放入加了45μl 50mM NaOH的离心管中，用研磨杵捣碎后以最大速度水平振荡3～5min，短暂离心后95℃水浴10min，然后加入5μl 1M Tris-HCl(pH8.0)，混匀，12,000g离心30sec，直接PCR或-20℃保存备用。
实施例2
(2)合成引物
根据植物线虫大亚基核糖体DNA(基因登录号为：AF435803、AF435794、AY446970、JN005857、FN429017、GQ375158、EU364890、EU570214、AF435793、AF435802、FJ485651、DQ328713、HQ688681、EU130893和EU36859)的D2D3区设计线虫通用引物MF和MR；根据根结线虫mtDNA COII和lrRNA基因(基因登录号为：FJ159631、AY635612、GQ266686、GQ266685、AY446970、GQ870255、AY757882、GQ865513、HM161680、AY635609、AY757909、AY942848、AY942851和EU364883)间区域种间差异进行设计象耳豆根结线虫的特异引物FMe和Rme。
所述引物的核苷酸序列如下：
MF 5’-GGGGATGTTTGAGGCAGATTTGT-3’；
MR 5’-AACCGCTTCGGACTTCCACCAG-3’；
FMe 5’-CATTCATTTATACCAATTTTAGTTGAGG-3’；
RMe 5’-CAATTATTGAATATTTTTTCCCAAACGA-3’。
引物的特异性检测：先进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)网上比对，发现引物对FMe/RMe只和象耳豆根结线虫和玛雅古根结线虫(GQ870255，FJ159613，FJ159617，AY831967，AY446969-AY446978，AY757907，AY635613和AJ421396)有100％的相似性，而通用引物对MF/MR和M.arenaria(AF435803，U42339和U42342)，M.fallax(FN429017)，M.hispanica(GQ375158和EU443606-EU443608)，M.thailandica(EU364890)，M.silvestris(EU570214)，M.dunensis(EF612712)，M.exigua(AF435795，AF435796和AF435804)，M.paranaensis(AF435798-AF435780)，M.graminicola(AF435793)，M.konaensis(AF435797)，M.chitwoodi(AF435802)和M.trifoliophila(AF435801)有100％的相似性。
分别采用根结线虫通用引物MF/MR和象耳豆根结线虫的特异引物FMe/RMe进行PCR扩增以检测引物的特异性。
PCR反应体系为：10ng模板DNA(提取自根结线虫的J2)，上下游引物各0.2μM，0.2mM dNTPs，含2mM MgCl2的1×PCR缓冲液，1U Taq DNA聚合酶和余量ddH2O，共25μl。
PCR条件为：预变性94℃2min；94℃变性30s，退火30s(FMe/RMe 64℃，MF/MR 59℃)和72℃30s，共30循环；终延伸72℃10min。
将5μl PCR产物用1％琼脂糖电泳分离，结果表明引物对MF/MR扩增南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和象耳豆根结线虫的不同种群均可得到478bp大小的条带，扩增北方根结线虫得到481bp大小的条带，扩增拟禾本科根结线虫(M.graminicola)和禾本科根结线虫(M.graminis)均得到485bp大小的条带，而用作对照的其他植物寄生线虫和秀丽小杆线虫(C.elegans)均没有条带产生。
引物对FMe/RMe只可扩增象耳豆根结线虫不同种群得到194bp大小的条带，而其他根结线虫，植物寄生线虫以及秀丽小杆线虫均没有条带产生。此结果说明所设计引物具有高度特异性。
(3)双重PCR扩增反应体系的建立
分别采用根结线虫通用引物MF/MR和象耳豆根结线虫的特异引物FMe/RMe进行双重PCR扩增以检测象耳豆根结线虫，DNA模板来自根结线虫的J2。按下列体系配置PCR反应体系：
2×PCR buffer 12.5μl；dNTPs(2mmol/L)5μl；MF(10μmol/L)0.2μl；MR(10μmol/L)0.2μl；FMe(10μmol/L)0.6μl；RMe(10μmol/L)0.6μl；KOD Fx 0.5U；DNA模板(提取自单条J2)1.0μl；余量ddH2O，共25μl。
双重PCR反应条件如下：94℃预变性2min，30个循环94℃变性30sec，64℃退火30sec，68℃延伸30sec，最后72℃后延伸5min。PCR反应可在TaKaRa TP600PCR仪上完成。然后用2.0％琼脂糖凝胶加样5μlPCR产物电泳，紫外灯下观察，用凝胶成像分析系统照像。
电泳结果见附图4所示，其中1～3为不同南方根结线虫种群，4～6为爪哇根结线虫不同种群，7～9为花生根结线虫不同种群，10～15为象耳豆根结线虫不同种群，16～17为两个北方根结线虫种群，18为拟禾本科根结线虫，19为禾本科根结线虫，20～27分别为咖啡短体线虫、肾形肾状线虫、半穿刺线虫、相似穿孔线虫、大豆孢囊线虫、水稻潜根线虫、腐烂茎线虫，秀丽小杆线虫，28为清水对照。结果表明该双重PCR体系特异性好。
(4)双重PCR扩增单根结DNA
除PCR循环数为40循环和模板DNA为4.0μl外，其余反应体系和反应条件同前述“双重PCR扩增反应体系的建立”所述。采用通用引物MF/MR以及象耳豆根结线虫的特异性引物FMe/RMe对分别接种了4个不同象耳豆根结线虫种群的黄瓜、番茄、蕹菜单根结DNA进行双重PCR扩增。同时以接种南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫的单根结DNA作为对照，并设一段不接虫的健康根组织DNA作为阴性对照。扩增结果表明：接种在黄瓜和番茄上的4个象耳豆根结线虫种群在5d、10d、15d时有62.5％，77.5％and 92.5％的单根结可以成功扩增到478bp和194bp两条电泳条带，接种在蕹菜上的4个象耳豆根结线虫种群在5d、10d、15d时有12.5％，50％and 77.5％的单根结可以成功扩增到478bp和194bp两条电泳条带。接种20d以后一直到30d，三种寄主植物上所有象耳豆根结线虫形成的根结都可以成功扩增到478bp和194bp两条带，见附图5～附图7所示。附图中，1、2代表南方根结线虫不同种群，3、4代表爪哇根结线虫不同种群，5代表花生根结线虫，6～10代表象耳豆根结线虫不同种群，11为健康根阴性对照，12为清水对照。结果表明该双重PCR体系可直接检测含象耳豆根结线虫的单根结。
实施例2象耳豆根结线虫单根结快速检测方法的田间应用
对采自海南、广东等地的根结线虫新鲜病根样品，首先用雌虫或者二龄幼虫mtDNA-PCR-RFLP确定线虫种类，然后用0.52％的次氯酸钠将病根组织表面消毒。取幼嫩近圆形的单个根结放入含45μl 50mM NaOH的离心管中，用研磨杵捣碎后以最大速度水平振荡3～5min，快速离心后95℃水浴10min，然后加入5μl 1M Tris-HCl(pH8.0)，混匀，12,000g离心30s，取4μl上清液直接进行双重PCR检测，反应条件同前述“双重PCR扩增单根结DNA”所述。检测结果见附图8，附图8中，1～11为田间不同根结样品，Ck-为清水对照。结果表明：1～7泳道的样品双重PCR产生一条478bp大小的根结线虫的通用带和一条194bp大小的象耳豆根结线虫的特异带，说明1～7号样品中含有象耳豆根结线虫，8～11泳道的样品只产生了一条根结线虫约478bp大小的条带，证明了这四个样品都不是象耳豆根结线虫。通用条带的产生可以避免假阴性扩增结果的发生，有效防止结果判断错误。通过形态学和mtDNA-PCR-RFLP结果同样表明1～7泳道的样品为象耳豆根结线虫，而8～10泳道的样品为南方根结线虫，11泳道的样品为爪哇根结线虫。单根结双重PCR的检测结果同形态学和mtDNA-PCR-RFLP验证结果一致，充分说明象耳豆根结线虫单根结双重PCR检测方法的灵敏度和可信度以及准确性。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物MF
<400> 1
ggggatgttt gaggcagatt tgt 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物MR
<400> 2
aaccgcttcg gacttccacc ag 22
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物FMe
<400> 3
cattcattta taccaatttt agttgagg 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物RMe
<400> 4
caattattga atattttttc ccaaacga 28
Claims (4)
1.一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）设计和合成引物；
（2）培养根结线虫，提取含有根结线虫的单根结DNA；
（3）以含有根结线虫的单根结DNA为模板进行PCR扩增反应；
（4）将PCR扩增反应产物进行脂糖电泳检测；
其中，步骤（1）所述引物包括扩增根结线虫的通用引物MF、MR和扩增象耳豆根结线虫的特异性引物FMe和RMe，所述引物MF的核苷酸序列如表SEQ ID NO：1所示，所述引物MR的核苷酸序列如表SEQ ID NO：2所示，所述引物FMe的核苷酸序列如表SEQ ID NO：3所示，所述引物RMe的核苷酸序列如表SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1象耳豆根结线虫单根结的检测方法，其特征在于步骤（3）PCR扩增反应的体系为：2×PCR buffer 12.5 μl，2mmol/L dNTPs 5 μl，10μmol/L MF 0.2μl，10μmol/L MR 0.2μl，10μmol/L FMe 0.6μl，10μmol/L RMe 0.6μl，KOD Fx 0.5 U，DNA模板4.0 μl和余量的ddH2O，共 25.0μl；
PCR扩增反应的条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，64℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40个循环；最后72℃后延伸5 min。
3.根据权利要求1象耳豆根结线虫单根结的检测方法，其特征在于步骤（4）所述琼脂糖电泳检测是将5μl 所述扩增反应产物用1％琼脂糖电 泳分离，根据条带有无和大小获得检测结果。
4.权利要求1～3任一项检测方法的应用，其特征在于应用于快速检测植物感染象耳豆根结线虫方面。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110350480 CN102367484B (zh) | 2011-11-08 | 2011-11-08 | 一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110350480 CN102367484B (zh) | 2011-11-08 | 2011-11-08 | 一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102367484A CN102367484A (zh) | 2012-03-07 |
| CN102367484B true CN102367484B (zh) | 2013-01-30 |
Family
ID=45760074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110350480 Expired - Fee Related CN102367484B (zh) | 2011-11-08 | 2011-11-08 | 一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102367484B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102766687B (zh) * | 2012-07-05 | 2013-12-25 | 华南农业大学 | 直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物及方法 |
| CN103509803B (zh) * | 2013-08-19 | 2015-05-20 | 华南农业大学 | 一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp,相关蛋白及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102102100A (zh) * | 2010-05-12 | 2011-06-22 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对 |
| CN102174650A (zh) * | 2011-02-09 | 2011-09-07 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种象耳豆根结线虫lamp快速检测方法及应用 |
-
2011
- 2011-11-08 CN CN 201110350480 patent/CN102367484B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102102100A (zh) * | 2010-05-12 | 2011-06-22 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对 |
| CN102174650A (zh) * | 2011-02-09 | 2011-09-07 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种象耳豆根结线虫lamp快速检测方法及应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| LONG hai et.al..Development of a PCR Diagnostic for the Root-knot Nematode Meloidogyne enterolobii.《ACTA Phytopathologica SINICA》.2006,第36卷(第2期),109-115. * |
| Onivaldo Randig et.al.A novel species-specific satellite DNA family in the invasive root-knot nematode Meloidogyne mayaguensis and its potential use for diagnostics.《Eur J Plant Pathol》.2009,485-495. * |
| Pablo Castillo et.al.A New Root-Knot Nematode, Meloidogyne baetica n. sp.(Nematoda: Heteroderidae), Parasitizing Wild Olive in Southern Spain.《Phytopathology》.2003,第93卷(第9期),1093-1102. * |
| PabloCastilloet.al.ANewRoot-KnotNematode Meloidogyne baetica n. sp.(Nematoda: Heteroderidae) |
| 卓侃 等.广东省和海南省象耳豆根结线虫的鉴定.《华中农业大学学报》.2008,第27卷(第2期),193-197. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102367484A (zh) | 2012-03-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Alvindia et al. | Lasiodiplodia theobromae causes vascular streak dieback (VSD)–like symptoms of cacao in Davao Region, Philippines | |
| CN102154476B (zh) | 一种香蕉穿孔线虫特异性lamp检测方法及其应用 | |
| Chamkhi et al. | Morphological and molecular characterization of arbuscular mycorrhizal fungal communities inhabiting the roots and the soil of saffron (Crocus sativus L.) under different agricultural management practices | |
| CN102250942B (zh) | 干扰Bx-cpl-2基因表达的dsRNA载体及其在松材线虫防治和研究中的应用 | |
| Basım et al. | Identification and characterization of Didymella bryoniae causing gummy stem blight disease of watermelon (Citrullus lanatus) in Turkey | |
| Poletto et al. | Characterization and pathogenicity of Fusarium oxysporum associated with Carya illinoinensis seedlings | |
| Gibot-Leclerc et al. | Phelipanche ramosa (L.) Pomel populations differ in life-history and infection response to hosts | |
| CN104593502A (zh) | 一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用 | |
| CN102367484B (zh) | 一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用 | |
| Koroch et al. | Rapid staining method to detect and identify downy mildew (Peronospora belbahrii) in basil | |
| CN103014157B (zh) | 用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法 | |
| CN102286509A (zh) | 干扰Bx-cpl-1基因表达的dsRNA载体及其在松材线虫防治和研究中的应用 | |
| CN101805796B (zh) | 用于检测大豆疫霉的引物、试剂盒及方法 | |
| Mishra et al. | In vitro antimycotic and biosynthetic potential of fungal endophytes associated with Schima Wallichii | |
| Hosseini et al. | Quantification of Phytophthora pisi DNA and RNA transcripts during in planta infection of pea | |
| Mathew et al. | First report of Phomopsis stem canker of sunflower (Helianthus annuus) caused by Diaporthe gulyae in Canada | |
| CN107488610A (zh) | 一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法 | |
| Rezaei et al. | Taxonomic and pathogenic characterization of Phytopythium species from West Azarbaijan, Iran, and description of two new species | |
| Belle et al. | Reaction of sugarcane genotypes to parasitism of Meloidogyne javanica and Pratylenchus zeae | |
| CN103276067A (zh) | 一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法 | |
| CN104141015B (zh) | 一种快速检测灰飞虱体内水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的方法 | |
| Chen et al. | First report of Nigrospora leaf spot caused by Nigrospora oryzae on watermelon in China | |
| Oliveira et al. | Damping‐off, root rot and wilting caused by Pythium myriotylum on Acacia crassicarpa in Sumatra, Indonesia | |
| CN105602948A (zh) | 利用荧光定量pcr技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法 | |
| Huang et al. | Identification and observation of infection processes of Colletotrichum species associated with pearl plum anthracnose in Guangxi, China |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211209 Address after: Room 503, building 3, No. 133, development avenue, Tongxiang Economic Development Zone, Tongxiang City, Jiaxing City, Zhejiang Province Patentee after: ZHEJIANG MAIZHI NETWORK TECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 510642 No. five, 483 mountain road, Guangzhou, Guangdong, Tianhe District Patentee before: SOUTH CHINA AGRICULTURAL University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20221216 Address after: 314500 No.1 Gongnong Road, South Gate, Chongfu Town, Tongxiang City, Jiaxing City, Zhejiang Province Patentee after: Jiaxing Zhuoshi Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Room 503, building 3, No. 133, development avenue, Tongxiang Economic Development Zone, Tongxiang City, Jiaxing City, Zhejiang Province Patentee before: ZHEJIANG MAIZHI NETWORK TECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130130 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |