CN103509803B - 一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp,相关蛋白及应用 - Google Patents
一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp,相关蛋白及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物基因工程技术领域，具体公开了一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp，相关蛋白及应用。所述效应基因Me-tctp核苷酸序列如SEQ ID NO:1～3所示，其相关蛋白ME-TCTP的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明研究了Me-tctp基因在线虫不同阶段表达情况；构建该基因过表达载体，转化到农杆菌EHA105中，侵染番茄叶片，荧光观察发现ME-TCTP蛋白定位在植物细胞质上；利用离体RNAi的方法沉默Me-tctp基因，分析结果显示该基因的沉默能够显著的降低象耳豆根结线虫的侵染能力；构建病毒诱导重组RNAi载体，将该载体导入植物，在植物中产生Me-tctp的dsRNA，该植株能显著抑制根结线虫的寄生。通过本发明可获得强抗象耳豆根结根结线虫的植物。
Description
技术领域
本发明属生物基因工程技术领域，具体涉及一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp，相关蛋白及应用。
背景技术
根结线虫是一类非常重要的植物寄生线虫，广泛分布于世界各地，能侵染超过3000种不同植物。根结线虫每年造成大概770亿美元的经济损失，随着作物复种指数的提高和设施农业的发展，根结线虫的发生和危害将会不断的加剧。由于根结线虫的根内寄生、寄主范围广泛的特性以及抗根结线虫种质资源的缺乏限制了化学防治、轮作和抗病育种等防治方法在控制根结线虫危害中的应用。而且现有的化学防治方法污染严重，因此，寻找其他绿色安全有效的防治根结线虫的方法是植物生产所长期面临的艰巨任务。
RNA干扰技术（RNAi）的出现使得开发更为有效的防治根结线虫的方法成为可能。RNAi能通过靶向抑制根结线虫特定基因功能而限制根结线虫侵染、寄生和繁殖因而能高效地减少根结线虫的危害而且对其他非靶标生物较为安全。RNAi现象最早在秀丽小杆线虫中发现，随后在植物、无脊椎动物和脊椎动物中都相继发现了这种现象。RNAi技术通过dsRNA特异性的降解靶mRNA，影响或抑制该目的基因功能，从而影响该种生物的生长、发育、繁殖甚至能杀死该种生物。该技术相比其他防治方法的最大优点是能定向作用于特定的某种（某类）害虫而不会影响在该生境中的其他生物。
应用农杆菌介导的病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术相对于传统的使用组织培养方法获得RNAi转基因植株更加简单快速，使得我们并不需要通过复杂的组培方法就可快速获得抗线虫植株。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中缺乏绿色安全有效的防治根结线虫的方法的缺陷，提供一种新的象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp。
本发明的另一目的是提供一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp的相关蛋白ME-TCTP。
本发明的又一目的是提供一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种象耳豆根结线虫（Meloidogyne javanica）效应基因Me-tctp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～3任意一条所示。其中SEQ ID NO：1为全基因序列（包括5’端非编码区、3’端非编码区、内含子和外显子），SEQ ID NO：2为编码区序列（包括内含子和外显子），SEQ ID NO：3为编码序列（即cDNA序列，仅为外显子）。
在严格条件下与上述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp杂交且编码与象耳豆根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子，或者与上述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp有90%以上同源性且编码象耳豆根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子，也在本发明的保护范围之内。所述严格条件为：可在0.1×SSC、0.1% SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
一种象耳豆根结线虫效应蛋白ME-TCTP，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，或该氨基酸序列经过一个或一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且与象耳豆根结线虫寄生相关的衍生蛋白。
为了使象耳豆根结线虫效应蛋白ME-TCTP便于纯化，可以在该序列（SEQ ID NO：4）的氨基末端或羧基末端连接上特定的标签，所述特定标签为5～6个精氨酸，或2～12个组氨酸，或如SEQ ID NO：5所示序列，或如SEQ ID NO：6所示序列，或如SEQ ID NO：7所示序列。如表1，但不限于表1：
表1 标签序列
| 标签 | 残基数量 | 序列 |
| Poly-Arg | 5～6（常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2～12（常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDK（SEQ ID NO：5） |
| Strep-TagⅡ | 8 | WSHPQFEK（SEQ ID NO：6） |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL（SEQ ID NO：7） |
上述蛋白可以人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
一种重组表达载体，是由出发载体的多克隆位点插入上述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp，或该基因的部分外显子片段如SEQ ID NO:8～9任一所示序列构建而成。其中，SEQ ID NO：8所示序列为Me-tctp基因编码序列（SEQ ID NO:3）的第1至594核苷酸序列；SEQ ID NO：9所示序列为Me-tctp基因编码序列（SEQ ID NO:3）的第91至594核苷酸序列。
上述表达载体的出发载体可以是一般表达载体或RNAi载体，可以根据需要选择。对于制备转基因抗病植物，载体pTRV2较优，该载体是一种植物RNAi载体，将含有象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp的该RNAi载体导入植物，可以在植物中产生所述基因的dsRNA，当根结线虫侵染该植株后，dsRNA进入根结线虫的体内，使所述基因的mRNA降解，引发所述基因的失活，严重的减弱了线虫的寄生能力，从而抑制线虫的侵染、寄生、繁殖和传播。
对于含有上述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp的重组基因表达盒、转基因细胞系或重组菌，也属于本发明的保护范围。
上述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp在制备转基因植物中的应用，所述转基因植物的目的植物优选为茄科和葫芦科植物，尤其是番茄，如番茄夏红1号。
作为上述应用的一个方面，可以将含有象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp的重组表达载体利用农杆菌导入至目的植物中，或者通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导入或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株，得到抗根结线虫的转基因植物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的有利于提高植物抗根结线虫活性的基因序列及其编码蛋白，为进一步培育有广谱抗虫性的植物新品种奠定基础。
附图说明
图1为3’RACE 扩增获得的片段的电泳结果；2为3’RACE的电泳结果；M为分子量标记。
图2为5’RACE 扩增获得的片段的电泳结果； 2、3、4为5’RACE的电泳结果；M为分子量标记。
图3为扩增Me-tctp基因的电泳结果； 2为扩增Me-tctp基因的电泳结果；M为分子量标记。
图4为象耳豆根结线虫不同发育阶段Me-tctp基因的相对表达量。
图5 为pCambia-GFP-tctp（TCTP-OE） 载体示意图。
图6为GFP荧光观察ME-TCTP蛋白在寄主番茄中的组织定位情况。
图7为Me-tctp基因沉默效率检测。
图8为离体RNAi方法沉默Me-tctp 基因对植株抗根结线虫能力差异的影响。
图9为pTRV2-tctp 载体示意图。
图10为病毒表达检测：1～6是pTRV-TCTP载体的CP基因，7是空白对照植株的CP基因，8是空载体pTRV载体的CP基因，9为阴性对照；10～15是pTRV-TCTP载体的actin基因，16是空白对照植株的actin基因，17是空载体pTRV载体的actin基因,18为阴性对照。
图11为Me-tctp基因沉默效率检测：CK为空白对照；TRV为空载体对照；TRV-TCTP为pTRV-TCTP载体。
图12为in planta RNAi方法沉默Me-tctp 基因对植株抗根结线虫能力差异的影响。
具体实施方式
下面通过说明书附图和具体实施例进一步详细解释本发明，但具体实施例对本发明不做任何形式的限定。实施例中无特殊说明，均为本领域常规实验方法；所用实验材料如无特殊说明，均购自常规生化试剂商店。实施例中定量实验均设置三次重复，结果取平均值。
生物材料来源如下：
番茄夏红一号：购于华南农业大学科技发展有限公司；
象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）：华南农业大学资源环境学院植物线虫室保存；
以下生物材料为发明人获赠得到：
载体pTRV1和载体pTRV2：参考文献：Dubreuil, G., M. Magliano, M. P. Dubrana, et al. Tobacco rattle virus mediates gene silencing in a plant parasitic root-knot nematode. Journal of Experimental Botany, 2009, 60(14): 4041-4050。
载体pGFP为华南农业大学资源环境学院植物线虫室保存；
根癌农杆菌EHA105：参考文献：Ryu, C. M., A. Anand, L. Kang, et al. Agrodrench: a novel and effective agroinoculation method for virus-induced gene silencing in roots and diverse Solanaceous species. Plant Journal, 2004, 40(2): 322-331。
以上生物材料公众可以从申请人处获得。
实施例1象耳豆根结线虫ME-TCTP蛋白及其编码基因的克隆
S1.使用TRIZOL 法提取象耳豆根结线虫二龄幼虫RNA，然后使用Clontech RACE试剂盒将RNA反转录为cDNA。
S2.依据NCBI数据库TCTP同源基因设计特异引物TCTP2-F：CTCCTCCGACTCTTATCCG（SEQ ID NO:10）和TCTP2-R：CTTGCCCTTCTCCCTTTCC（SEQ ID NO:11），以步骤S1获得的cDNA为模板进行扩增，获得Me-tctp的EST序列。
S3. 3’RACE片段的获得：使用特异引物Tctp3t1：GCCAAGTTGTTCGAAAGGAAGGAG（SEQ ID NO:12），Tctp3t2：GGTAATTGTGGAGGAGCAGGATAT（SEQ ID NO:13），或Tctp3t3：TGAAGAAGGTTATTGAGATATGCAG，（SEQ ID NO:14）和Clontech RACE试剂盒的锚定引物UPM或NUP，以步骤S1获得的cDNA为模板进行扩增。PCR扩增体系：cDNA 2μL，两条引物各3μL，10×KOD plus Buffer 5μL，MgSO4 2μL，dNTP 5μL，Kod plus Neo DNA polymerase 1μL， ddH2O 34μL。PCR扩增程序：94℃ 3min，30×（94℃ 30s，65℃ 30s，68℃ 2min），68℃ 5min，20℃保存。琼脂糖电泳检测扩增结果，见图1。
S4. 5’RACE片段的获得：使用引物Tctp5t1：CTGCATATGCTCAATAACCTTCTTCA（SEQ ID NO:15），Tctp5t2：ATATCCTGCTCCTCCACAATTACC（SEQ ID NO:16） ，或Tctp5t3：CCTTCATCCATCTCTTCAGCTGAC，（SEQ ID NO:17）和Clontech RACE试剂盒的锚定引物LAD1-1/1-2/1-3/1-4，以步骤S1获得的cDNA为模板进行扩增。PCR扩增体系：cDNA 2μL，两条引物各3μL，10× KOD plus Buffer 5μL，MgSO4 2μL，dNTP 5μL，Kod plus Neo DNA polymerase 1μL，ddH2O 34μL。PCR扩增程序同S3，20℃保存。琼脂糖电泳检测扩增结果，见图2。
S5. 对3’RACE片段、5’RACE片段和获得的EST片段进行拼接后获得Me-tctp的基因全长，再以DNA为模板，使用引物对TctpcdsF: ATGATATGGTCAATGTTTGATCCGC（SEQ ID NO:18）和TctpdnaR: TTAGCACTTCACCTCTTCCAAAG（SEQ ID NO:19） 进行扩增，验证序列正确性，PCR扩增程序同S3，结果见图3，测序后获得的序列如SEQ ID NO:1 所示，并命名为Me-tctp；以cDNA为模板，使用引物对TctpcdsF: ATGATATGGTCAATGTTTGATCCGC（SEQ ID NO:18）和TctpcdsR：TTAGCACTTCACCTCTTCCAAAGCTTCTTTAA（SEQ ID NO:20），测序得到cDNA序列如SEQ ID NO:3，该基因编码的蛋白命名为ME-TCTP，ME-TCTP蛋白序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例2 Me-tctp基因在象耳豆根结线虫不同发育阶段的表达分析
S1.使用TRIZOL 法提取不同发育阶段的象耳豆根结线虫的RNA，并将RNA反转录为cDNA。
S2.使用引物qmetctpF：CTTTGTTAGCTAAGGATCGTTTCA （SEQ ID NO:21）和qmetctpR：TAGAGTTGGAACTTCCTCATCAC（SEQ ID NO:22）对Me-tctp进行荧光定量PCR分析，以象耳豆根结线虫β-actin基因为内参，引物为qmeactF：GTCATGGTCGGTATGGGACAGA（SEQ ID NO:23）和qmeactR：CTTGCTTGGAGATCCACATCTGTTGGAAG（SEQ ID NO:24）。反应条件：94℃ 30s，40×（94℃ 30s， 58℃ 30s，72℃ 1min）。结果见图4。图4结果表明，Me-tctp 基因在象耳豆根结线虫各个发育阶段均有表达，在侵染前二龄幼虫时期表达量最低，侵染后表达量明显升高，三龄阶段（侵染番茄10天后）表达量最高。证明该基因在象耳豆根结线虫的寄生中发挥重要作用。
实施例 3 ME-TCTP蛋白的亚细胞定位情况
S1.构建Me-tctp基因瞬时表达载体，转化农杆菌（EHA-105）侵染番茄，利用荧光显微镜进行观察。
S2.使用TRIZOL 法提取爪哇根结线虫二龄幼虫RNA，并将RNA反转录为cDNA。
S3.使用引物对：TctpFSal： ACGCGTCGAC ATGATATGGTCAATGTTTGATCCGC（SEQ ID NO:25，下划线部分为Sal I酶切位点）和TctpRNco：CATGCCATGGGCACTTCACCTCTTCCAAAGCTTCTTTAA（SEQ ID NO:26，下划线部分为Nco I酶切位点）进行PCR扩增，PCR扩增程序：94℃ 3min，30×（94℃ 30s，60℃ 30s，68℃ 2min），68℃ 5min。将得到的PCR产物使用限制性内切酶Sal I和Nco I进行酶切，并纯化回收。
S4.同时使用限制性内切酶Sal I和Nco I酶切载体TPV，并纯化回收。
S5.将S3和S4得到的产物进行连接，获得重组表达质粒TPV-tctp。
S6.以S5得到的重组质粒TPV-tctp为模板，使用引物对35sBam：CGCGGATCCGCGGCGAGGCGGTTTGCGTATTGGCTAG（SEQ ID NO:27）和nosBam：CGCGGATCCGCGTTCCCCGATCGTTCAAACATT（SEQ ID NO:28）进行PCR扩增，PCR扩增程序：94℃ 3min，30×（94℃ 30s，60℃ 30s，68℃ 2min），68℃ 5min。将得到的PCR产物使用限制性内切酶BamHI-HF进行单酶切，并纯化回收。
S7.同时使用限制性内切酶BamHI-HF对PECambia1300载体进行单酶切，并纯化回收。
S8.将S6和S7得到的产物进行连接，获得重组表达载体pCambia-GFP-tctp（TCTP-OE）。根据测序结果，对重组表达载体pCambia-GFP-tctp进行结构描述如下：骨架为TPV，在骨架载体Sal I和Nco I酶切位点之间插入了双链DNA片段A（来自序列SEQ ID NO:3的5’端第1至594核苷酸所示的DNA分子），如图5。并将载体pCambia-GFP-tctp（TCTP-OE）转化根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌。
S9.植物材料和生长条件：番茄品种为华南农业大学的金宝（市面销售）。种子经一下方法消毒并播种培养：a、浸泡4～8小时之后，无菌水清洗数次，b、75%酒精浸泡5min，无菌水清洗数次，c、20% NaClO浸泡20min，无菌水清洗数次，无菌水浸泡5min，d、灭菌滤纸将种子吸干水，播种在MS培养基上，25～28℃培养。
S10 Me-tctp基因诱导表达及农杆菌侵染： 40mL含pCambia-GFP-tctp（TCTP-OE）质粒的农杆菌28℃培养至OD值为0.5左右，菌液4000g离心5min，弃上清。FAst溶液悬浮沉淀，4000g离心5min，弃上清。最后40mL的FAst溶液、40μL AS和2μL Silwetl-77悬浮沉淀，混匀之后浸泡4～7天的番茄苗子叶（子叶浸入液体一半），25℃放置48h。
S11.荧光观察：撕取番茄子叶下表皮细胞，在荧光显微镜下观察。观察结果显示，Me-TCTP蛋白在寄主番茄中定位在细胞质部位，如图6。
实施例 4 利用in vitro RNAi分析Me-tctp基因在象耳豆根结线虫寄生中的作用
S1.外源dsRNA的获得参照Li等（2011）的方法进行。
Me-tctp 基因正反义链合成使用引物对：FT7：GGATCC TAATACGACTCACTATAGGGGACGAGCTCTCCTCCGACTCT（SEQ ID NO:29）和R：GCAAGAGTTTTGAAACGATCCTTA（SEQ ID NO:30），以及F：GACGAGCTCTCCTCCGACTCT（SEQ ID NO:31）和RT7：GGATCC TAATACGACTCACTATAGGGGCAAGAGTTTTGAAACGATCCTTA（SEQ ID NO:32），PCR扩增退火温度60℃，1min的延伸时间。
阳性对照GFP基因正反义链合成使用引物对：GFPA：TCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG（SEQ ID NO:33）和GFPST7：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC（SEQ ID NO:34），以及GFPS: GGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC（SEQ ID NO:35）和GFPAT7：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG（SEQ ID NO:36），PCR扩增退火温度55℃，1min的延伸时间。
dstctp和dsGFP的合成参照ScriptMAX Thermo T7 Transcription Kit说明书进行操作。
S2. dsRNA的纯化按如下方法进行：（1）加入1/10体积的8moL/L氯化锂，2倍体积的无水乙醇，混匀，-70 ℃放置10 h；（2）4 ℃ 12000g离心10 min，弃去上清；（3）加入1mL预冷的70%乙醇洗涤，4 ℃ 12000g离心5 min，弃去上清；（4）重复步骤（3）一次；（5）37 ℃放置数分钟烘干酒精；（6）加入40 μL DEPC水溶解；（7）电泳检测产物，余下的dsRNA置于-70 ℃保存。
S3. 使用浸泡方法沉默象耳豆根结线虫的tctp基因，具体方法如下：将新鲜孵化的20000条二龄幼虫收集到DEPC处理过的离心管中，对照组和实验组各收集约20000条二龄幼虫，M9 buffer清洗两遍后，吸干水，对照组分别加入50μL的M9 buffer，50 μL的dsGFP，实验组直接浸泡在50μL的含有dsRNA（2 μg/μL）的溶液中，20 ℃浸泡4 h，每隔一段时间轻微的摇动试管。浸泡结束后用M9 buffer清洗两次。然后提取RNA及进行反转录实验，再用引物对：QtctpF：CTTTGTTAGCTAAGGATCGTTTCA（SEQ ID NO：37）和QtctpR：TAGAGTTGGAACTTCCTCATCAC（SEQ ID NO：38），通过定量PCR方法验证沉默效果，结果如图7；从图7可以看出：经过dsRNA处理的二龄幼虫体内的Me-tctp基因表达量明显降低，表明基因沉默成功。
S4.把不同处理（dstctp、dsGFP、CK）的象耳豆根结线虫接种到35 d苗龄番茄上，每个处理接种30株，每株番茄接种200条根结线虫。分别在接种5 d、10 d、15 d、20 d、25 d和30d后，每个处理取5株番茄根洗净后进行染色，参照冯志新（2000年）介绍的次氯酸钠-酸性品红染色法，统计番茄根部线虫（包括各个龄期的线虫）的数量，分析沉默后象耳豆根结线虫侵染能力的变化，结果如图8，结果表明Me-tctp基因的沉默，能显著地抑制象耳豆根结线虫的寄生能力。
实施例 5 利用in planta RNAi分析Me-tctp基因在象耳豆根结线虫寄生中的作用
S1.使用TRIZOL 法提取象耳豆根结线虫二龄幼虫RNA，并将RNA反转录为cDNA。
S2.使用引物对TctpRXba：CTAGTCTAGAGCACTTCACCTCTTCCAAAGCTTCTTTAA（SEQ ID NO:39，下划线部分为XbaI酶切位点）和TctpFSal：ACGCGTCGACATGATATGGTCAATGTTTGATCCGC（SEQ ID NO:25，下划线部分为Sal I酶切位点）进行PCR扩增，PCR扩增程序：94℃ 3min，30×（94℃ 30s，60℃ 30s，68℃ 2min），68℃ 5min。将得到的PCR产物使用限制性内切酶Xba I和Sal I进行酶切，并纯化回收。
S3.同时使用限制性内切酶Xba I和Sal I酶切载体pTRV2，并纯化回收。
S4.将S2和S3得到的产物进行连接，获得重组表达载体pTRV2-tctp。根据测序结果，对重组表达载体pTRV2-tctp进行结构描述如下：骨架为pTRV2，在骨架载体Xba I和Sal I酶切位点之间插入了双链DNA片段B（来自序列SEQ ID NO:3的5’端第91至594核苷酸所示的DNA分子），如图9。将载体pTRV1（编码TRV病毒的RNA聚合酶1，为病毒侵染植株所必须）转化根癌农杆菌EHA105到重组农杆菌A，将载体质粒pTRV2-tctp转化根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌B，将载体pTRV2转化根癌农杆菌EHA105得到对照农杆菌。
S5.植物材料和生长条件：番茄品种为华南农业大学的夏红一号（市面销售）。种子经0.5%次氯酸钠消毒20min，清水冲洗数次后播入经高压灭菌的沙中，转入温室培养，条件：温度22～25℃，16h日照/8h黑暗。14天后，幼苗长出第4或第5片真叶，进行农杆菌侵染：参照S. Mysore（2004）的方法用农杆菌侵染。具体步骤：重组农杆菌A、B及对照农杆菌培养16～24h，4℃ 4000g离心5min收集菌体，用诱导液（0.01M PBS pH=5.2，100uM AS，10mM MgCl2）悬浮菌体至OD600 =1，28℃诱导4～6h。等体积混合pTRV1和pTRV2系列菌液，分别接种混合菌液及pTRV2-TCTP菌液于植株根部，每株番茄接种2～3mL菌液，3d后用清水冲洗一次，7d后重复一次。首次接种农杆菌14天后，取新长出的叶片提取RNA，反转成cDNA，用引物pTRVCPF：CTGGGTTACTAGCGGCACTGAATA（SEQ ID NO:40）和pTRVCPR：TCCACCAAACTTAATCCCGAATAC（SEQ ID NO:41）检测病毒表达，结果如图10。
S6.首次接种农杆菌21天后，接种象耳豆根结线虫新鲜孵化的2龄幼虫，每株番茄接种200条。接种后，保持温度在28℃。接种5d后，使用TRIZOL 法提取含有线虫的番茄根RNA，并将RNA反转录为cDNA。
S7.使用引物对TctpcdsF: ATGATATGGTCAATGTTTGATCCGC（SEQ ID NO:18）和TctpcdsR:TTAGCACTTCACCTCTTCCAAAGCTTCTTTAA（SEQ ID NO:20）进行qPCR扩增，检测Me-tctp基因沉默效率，PCR扩增程序：94℃ 3min，30×（94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min），72℃ 5min。结果如图11，从图11可以看出：实验组的线虫Me-tctp基因表达与对照组相比显著下降，表明基因沉默成功。
S8.分别在接种后15d和30d后统计根内线虫数，每个处理十个重复，结果取平均值。结果如图12。结果表明，表达沉默象耳豆根结线虫的Me-tctp基因后，能显著地减少每株植株上侵染虫的数量，即沉默Me-tctp基因后，能显著地抑制根结线虫的寄生能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp，相关蛋白及应用
<130>
<160> 41
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1598
<212> DNA
<213> 效应基因Me-tctp全基因序列
<400> 1
attgaaccag ccaaaaaggt ggaagagaag gaagagtctg atgacgatat gggctttggg 60
ttgtttgatt aaaatggaag tttttggtga aataattaat ttgttgctat tctgttgaaa 120
atatatttta agctgttttt tggttgaact ttttcatttg tttatttttc aaacatattt 180
atcttttctt tttatgttta atctttattt ttaagcttaa ttttagatac tttttaaaga 240
catttttgaa gaaatatgat tatttacaag gacgttttca caggtatatg tttttaattt 300
agggttgggt gtttctaagg ttggtactcc ccatttttct gtagcatgat atggtcaatg 360
tttgatccgc tgaattgtgg ggataagggg ttttgggaac aacaaaggat taatctttat 420
caatatttag aggacgagct ctcctccgac tcttatccga tgaaacttgt ggacgatctc 480
atttttgagt tcaaaggacg ccaagttgtt cgaaaggaag gagatattgc tttggctggg 540
gcaaacccgt cagctgaaga gatggatgaa ggaactgaag aacatgttga aagaggtatt 600
gactttgtac tcaatcatcg tcttcaggag atgaattgtt atgaggtaaa aatttttttt 660
ggtaattgtg gaggagcagg atattttttt aagacaatcc gagttaaaag tcattccacc 720
tcaaattgtg ctgggcctac ttattaatgt ttacagacaa tgtcgggtgc tggatattgg 780
gtattttgtg ccgcggctct aaaaaatcca cgcaaatgac aaaaatctta tccttattta 840
aacttcaaaa tttctttttc aaaggatcaa gcaactttca aagcttacat aaaagatttt 900
atgaagaagg ttattgagca tatgcagaaa caaggaaagt ctgctgaaca agttgatgct 960
tttaagaaga aaattcagtc ttgggttgtt tctttgttag ctaaggatcg tttcaaaact 1020
cttgcatttt tcattggtat ttttttttaa ttttattttt gaatttaaaa aaattttaag 1080
gtgagaacat ggctgaggga aagggagaag ggcaagtagc aattgttgaa tatcgtcaag 1140
agggtgatga ggaagttcca actctaatgc taattaaaga aggttttgaa tttttagata 1200
atatattttc tgtaatagag cttgggcttt tgcttgggtt atttgattgt tttttaagag 1260
cccatatagc tctatttttc agccaaccac aaagggaagt tatattaatg agcggagggg 1320
attaggctct aaaacagacg gggtagattt caaccattcc ataggatttt tatcagaggg 1380
taaaggacta atacaattat tatttttcaa tttaataatt tttttattta gctttggaag 1440
aggtgaagtg ctaatgtttt ttgattgaca aggagaggag agaaaaaatg gaaatttttt 1500
tgaaattata taattgattc aagaattata taaaaaattg ttgtttttgg ttaatataaa 1560
tattgtttga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1598
<210> 2
<211> 1109
<212> DNA
<213> 效应基因Me-tctp编码区序列
<400> 2
atgatatggt caatgtttga tccgctgaat tgtggggata aggggttttg ggaacaacaa 60
aggattaatc tttatcaata tttagaggac gagctctcct ccgactctta tccgatgaaa 120
cttgtggacg atctcatttt tgagttcaaa ggacgccaag ttgttcgaaa ggaaggagat 180
attgctttgg ctggggcaaa cccgtcagct gaagagatgg atgaaggaac tgaagaacat 240
gttgaaagag gtattgactt tgtactcaat catcgtcttc aggagatgaa ttgttatgag 300
gtaaaaattt tttttggtaa ttgtggagga gcaggatatt tttttaagac aatccgagtt 360
aaaagtcatt ccacctcaaa ttgtgctggg cctacttatt aatgtttaca gacaatgtcg 420
ggtgctggat attgggtatt ttgtgccgcg gctctaaaaa atccacgcaa atgacaaaaa 480
tcttatcctt atttaaactt caaaatttct ttttcaaagg atcaagcaac tttcaaagct 540
tacataaaag attttatgaa gaaggttatt gagcatatgc agaaacaagg aaagtctgct 600
gaacaagttg atgcttttaa gaagaaaatt cagtcttggg ttgtttcttt gttagctaag 660
gatcgtttca aaactcttgc atttttcatt ggtatttttt tttaatttta tttttgaatt 720
taaaaaaatt ttaaggtgag aacatggctg agggaaaggg agaagggcaa gtagcaattg 780
ttgaatatcg tcaagagggt gatgaggaag ttccaactct aatgctaatt aaagaaggtt 840
ttgaattttt agataatata ttttctgtaa tagagcttgg gcttttgctt gggttatttg 900
attgtttttt aagagcccat atagctctat ttttcagcca accacaaagg gaagttatat 960
taatgagcgg aggggattag gctctaaaac agacggggta gatttcaacc attccatagg 1020
atttttatca gagggtaaag gactaataca attattattt ttcaatttaa taattttttt 1080
atttagcttt ggaagaggtg aagtgctaa 1109
<210> 3
<211> 597
<212> DNA
<213> 效应基因Me-tctp编码序列
<400> 3
atgatatggt caatgtttga tccgctgaat tgtggggata aggggttttg ggaacaacaa 60
aggattaatc tttatcaata tttagaggac gagctctcct ccgactctta tccgatgaaa 120
cttgtggacg atctcatttt tgagttcaaa ggacgccaag ttgttcgaaa ggaaggagat 180
attgctttgg ctggggcaaa cccgtcagct gaagagatgg atgaaggaac tgaagaacat 240
gttgaaagag gtattgactt tgtactcaat catcgtcttc aggagatgaa ttgttatgag 300
gatcaagcaa ctttcaaagc ttacataaaa gattttatga agaaggttat tgagcatatg 360
cagaaacaag gaaagtctgc tgaacaagtt gatgctttta agaagaaaat tcagtcttgg 420
gttgtttctt tgttagctaa ggatcgtttc aaaactcttg catttttcat tggtgagaac 480
atggctgagg gaaagggaga agggcaagta gcaattgttg aatatcgtca agagggtgat 540
gaggaagttc caactctaat gctaattaaa gaagctttgg aagaggtgaa gtgctaa 597
<210> 4
<211> 198
<212> PRT
<213> 效应蛋白ME-TCTP
<400> 4
Met Ile Trp Ser Met Phe Asp Pro Leu Asn Cys Gly Asp Lys Gly Phe
1 5 10 15
Trp Glu Gln Gln Arg Ile Asn Leu Tyr Gln Tyr Leu Glu Asp Glu Leu
20 25 30
Ser Ser Asp Ser Tyr Pro Met Lys Leu Val Asp Asp Leu Ile Phe Glu
35 40 45
Phe Lys Gly Arg Gln Val Val Arg Lys Glu Gly Asp Ile Ala Leu Ala
50 55 60
Gly Ala Asn Pro Ser Ala Glu Glu Met Asp Glu Gly Thr Glu Glu His
65 70 75 80
Val Glu Arg Gly Ile Asp Phe Val Leu Asn His Arg Leu Gln Glu Met
85 90 95
Asn Cys Tyr Glu Asp Gln Ala Thr Phe Lys Ala Tyr Ile Lys Asp Phe
100 105 110
Met Lys Lys Val Ile Glu His Met Gln Lys Gln Gly Lys Ser Ala Glu
115 120 125
Gln Val Asp Ala Phe Lys Lys Lys Ile Gln Ser Trp Val Val Ser Leu
130 135 140
Leu Ala Lys Asp Arg Phe Lys Thr Leu Ala Phe Phe Ile Gly Glu Asn
145 150 155 160
Met Ala Glu Gly Lys Gly Glu Gly Gln Val Ala Ile Val Glu Tyr Arg
165 170 175
Gln Glu Gly Asp Glu Glu Val Pro Thr Leu Met Leu Ile Lys Glu Ala
180 185 190
Leu Glu Glu Val Lys Cys
195
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> FLAG标签
<400> 5
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Strep-TagⅡ标签
<400> 6
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> c-myc标签
<400> 7
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 594
<212> DNA
<213> Me-tctp基因编码序列的第1至594核苷酸序列
<400> 8
atgatatggt caatgtttga tccgctgaat tgtggggata aggggttttg ggaacaacaa 60
aggattaatc tttatcaata tttagaggac gagctctcct ccgactctta tccgatgaaa 120
cttgtggacg atctcatttt tgagttcaaa ggacgccaag ttgttcgaaa ggaaggagat 180
attgctttgg ctggggcaaa cccgtcagct gaagagatgg atgaaggaac tgaagaacat 240
gttgaaagag gtattgactt tgtactcaat catcgtcttc aggagatgaa ttgttatgag 300
gatcaagcaa ctttcaaagc ttacataaaa gattttatga agaaggttat tgagcatatg 360
cagaaacaag gaaagtctgc tgaacaagtt gatgctttta agaagaaaat tcagtcttgg 420
gttgtttctt tgttagctaa ggatcgtttc aaaactcttg catttttcat tggtgagaac 480
atggctgagg gaaagggaga agggcaagta gcaattgttg aatatcgtca agagggtgat 540
gaggaagttc caactctaat gctaattaaa gaagctttgg aagaggtgaa gtgc 594
<210> 9
<211> 504
<212> DNA
<213> Me-tctp基因编码序列的第91至594核苷酸序列
<400> 9
gagctctcct ccgactctta tccgatgaaa cttgtggacg atctcatttt tgagttcaaa 60
ggacgccaag ttgttcgaaa ggaaggagat attgctttgg ctggggcaaa cccgtcagct 120
gaagagatgg atgaaggaac tgaagaacat gttgaaagag gtattgactt tgtactcaat 180
catcgtcttc aggagatgaa ttgttatgag gatcaagcaa ctttcaaagc ttacataaaa 240
gattttatga agaaggttat tgagcatatg cagaaacaag gaaagtctgc tgaacaagtt 300
gatgctttta agaagaaaat tcagtcttgg gttgtttctt tgttagctaa ggatcgtttc 360
aaaactcttg catttttcat tggtgagaac atggctgagg gaaagggaga agggcaagta 420
gcaattgttg aatatcgtca agagggtgat gaggaagttc caactctaat gctaattaaa 480
gaagctttgg aagaggtgaa gtgc 504
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物TCTP2-F
<400> 10
ctcctccgac tcttatccg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物TCTP2-R
<400> 11
cttgcccttc tccctttcc 19
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物tctp3t1
<400> 12
gccaagttgt tcgaaaggaa ggag 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物Tctp3t2
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ggtaattgtg gaggagcagg atat 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 引物Tctp3t3
<400> 14
tgaagaaggt tattgagata tgcag 25
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物Tctp5t1
<400> 15
ctgcatatgc tcaataacct tcttca 26
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物Tctp5t2
<400> 16
atatcctgct cctccacaat tacc 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物Tctp5t3
<400> 17
ccttcatcca tctcttcagc tgac 24
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物TctpcdsF
<400> 18
atgatatggt caatgtttga tccgc 25
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物TctpdnaR
<400> 19
ttagcacttc acctcttcca aag 23
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物TctpcdsR
<400> 20
ttagcacttc acctcttcca aagcttcttt aa 32
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物qmetctpF
<400> 21
ctttgttagc taaggatcgt ttca 24
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物qmetctpR
<400> 22
tagagttgga acttcctcat cac 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物qmeactF
<400> 23
gtcatggtcg gtatgggaca ga 22
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物qmeactR
<400> 24
cttgcttgga gatccacatc tgttggaag 29
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 引物TctpFSal
<400> 25
acgcgtcgac atgatatggt caatgtttga tccgc 35
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物TctpRNco
<400> 26
catgccatgg gcacttcacc tcttccaaag cttctttaa 39
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物35sBam
<400> 27
cgcggatccg cggcgaggcg gtttgcgtat tggctag 37
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物nosBam
<400> 28
cgcggatccg cgttccccga tcgttcaaac att 33
<210> 29
<211> 47
<212> DNA
<213> 引物FT7
<400> 29
ggatcctaat acgactcact ataggggacg agctctcctc cgactct 47
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物R
<400> 30
gcaagagttt tgaaacgatc ctta 24
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物F
<400> 31
gacgagctct cctccgactc t 21
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 引物RT7
<400> 32
ggatcctaat acgactcact ataggggcaa gagttttgaa acgatcctta 50
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物GFPA
<400> 33
tcacttgtac agctcgtcca tgccg 25
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 引物GFPST7
<400> 34
ggatcctaat acgactcact ataggggtga gcaagggcga ggagctgttc 50
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<211> 25
<212> DNA
<213> 引物GFPS
<400> 35
ggtgagcaag ggcgaggagc tgttc 25
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<211> 50
<212> DNA
<213> 引物GFPAT7
<400> 36
ggatcctaat acgactcact ataggtcact tgtacagctc gtccatgccg 50
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<211> 24
<212> DNA
<213> 引物QtctpF
<400> 37
ctttgttagc taaggatcgt ttca 24
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<213> 引物QtctpR
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tagagttgga acttcctcat cac 23
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<211> 39
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<213> 引物TctpRXba
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ctagtctaga gcacttcacc tcttccaaag cttctttaa 39
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<213> 引物pTRVCPF
<400> 40
ctgggttact agcggcactg aata 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 引物pTRVCPR
<400> 41
tccaccaaac ttaatcccga atac 24
Claims (2)
1.一种象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3任意一条所示。
2.一种象耳豆根结线虫效应蛋白ME-TCTP，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3. 一种象耳豆根结线虫效应蛋白ME-TCTP，其特征在于在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有特定标签，所述特定标签为5～6个精氨酸，或2～12个组氨酸，或如SEQ ID NO:5所示序列，或如SEQ ID NO:6所示序列，或如SEQ ID NO:7所示序列。
4. 一种重组表达载体，其特征在于，由出发载体的多克隆位点插入权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp，或该基因的部分外显子片段如SEQ ID NO:8～9任一所示序列构建而成。
5. 一种重组基因表达盒，其特征在于，含有权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp。
6. 一种重组菌，其特征在于，含有权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp。
7. 权利要求1所述象耳豆根结线虫效应基因Me-tctp在制备转基因植物中的应用。
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