CN106957358A

CN106957358A - 禾谷孢囊线虫Ha34609蛋白、编码基因及其应用

Info

Publication number: CN106957358A
Application number: CN201710356556.8A
Authority: CN
Inventors: 彭德良; 李新; 彭焕; 黄文坤; 孔令安; 王高峰; 崔江宽; 刘敬; 乔芬; 罗书介
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-05-16
Filing date: 2017-05-16
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2037-05-16
Also published as: CN106957358B

Abstract

本发明涉及禾谷孢囊线虫Ha34609蛋白、编码基因及其应用。禾谷孢囊线虫的Ha34609蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码基因的其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。利用dsRNA处理沉默Ha34609基因后，白雌虫的长度、宽度与对照eGFP dsRNA相比显著减小(t检验，置信区间95％)，表明该基因在禾谷孢囊线虫寄生致病过程中具有重要作用，可作为植物抗线虫工程的靶标基因。本发明对于孢囊线虫致病机理研究以及抗线虫植物制备具有重大价值。

Description

禾谷孢囊线虫Ha34609蛋白、编码基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于禾谷孢囊线虫的Ha34609蛋白、编码基因及其应用。

背景技术

小麦作为我国三大重要粮食作物之一，保障小麦的安全生产对我国粮食安全举足轻重。小麦禾谷孢囊线虫(Cereal cyst nematodes，简称CCNs)是一种严重危害小麦(Triticum aestivum)，大麦(Hordeum vulgare)和燕麦(Avena sativa)等禾谷类作物的重要病原线虫(Meagher J W.World dissemination of the cereal-cyst nematode(Heterodera avenae)and its potential as a pathogen of wheat.Journal ofNematology,1977,9(1):9-15.)。自1874年在德国首次发现后，现已在亚、非、欧、美、澳等40多个国家和地区均有发生与危害(Rivoal R,Nicol J M.Past research on the cerealcyst nematode complex and future needs.Cereal cyst nematodes:status,researchand outlook.Proceedings of the First Workshop of the International CerealCyst Nematode Initiative,Antalya,Turkey,21-23October 2009.2009:3-10.)。在澳大利亚的维多利亚和南澳大利亚，CCN危害面积达200万公顷，一般损失23-50％，严重时产量损失高达73-89％，每年造成7000万美元经济损失(Brown R H.Ecology and Control ofCereal Cyst Nematode(Heterodera avenae)in Southern Australia[J].Journal ofNematology,1984,16(3):216-222.)。在印度，CCN引起小麦和大麦的“Molya”病害，在印度拉贾斯坦，CCN造成的产量损失小麦为47.2％，大麦为87.2％(Rivoal R,Cook R,Evans K,Trudgill D L,Webster J M.Nematode pests of cereals[J].Plant ParasiticNematodes in Temperate Agriculture,1993,259-303.)。我国1989年在湖北省天门县岳口镇首次发现该病原线虫(陈品三，王明祖，彭德良.我国小麦禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae Wollenweber)的发现与鉴定初报[J].中国农业科学,1991,24(5):89.)。随着农业机械化和小麦跨区联合收割，小麦孢囊线虫病发生范围迅速扩大，危害程度日趋严重，目前已扩散至我国包括河北、河南、青海、内蒙古等16个省市自治区的小麦种植区(Cui J K,Huang W K,Peng H,Liu S M,Wang G F,Kong L A,Peng D L.A new pathotypecharacterization of Daxing and Huangyuan populations of cereal cyst nematode(Heterodera avenae)in China.Journal of Integrative Agriculture(农业科学学报(英文)),2015,14(4):724-731.)，成为我国小麦上发生严重的线虫病害之一，其中尤以黄淮麦区危害最严重；危害面积达6000余万亩，年产量损失在23％-50％以上，严重地块减产达73％-89％，甚至毁种绝收，且有不断加速蔓延的趋势(Peng D L,Nicol J M,Li H M,HouS Y,Li H X,Chen S L,Ma P,Li H L,Riley I T.Current knowledge of cereal cystnematode(Heterodera avenae)on wheat in China.Cereal cyst nematodes:status,research and outlook.Proceedings of the First Workshop of the InternationalCereal Cyst Nematode Initiative,Antalya,Turkey,21-23October 2009.2009:29-34.)。由于缺乏有效、迅速、经济的防治措施，如若小麦孢囊线虫病暴发成灾，将会对我国小麦产量造成严重损失，从而对我国粮食安全构成重大威胁。因此，针对我国小麦主产区禾谷孢囊线虫危害严重的现实问题，积极开展CCN内源靶标基因研究，从分子水平解析小麦禾谷孢囊线虫与寄主互作的分子机理，对采取科学合理的措施防控小麦禾谷孢囊线虫的爆发，具有十分重要的理论价值和实用意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于禾谷孢囊线虫的Ha34609蛋白，实验表明该蛋白基因与禾谷孢囊线虫的生长发育有关，可以利用该基因或蛋白进行生物防控。

禾谷孢囊线虫的Ha34609蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

编码权利要求1所述的Ha34609蛋白的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种DNA分子，其编码Ha34609蛋白，且与权利要求2所述的基因序列具有90％以上的同源性。

根据上述核苷酸序列设计的dsRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

上述基因或上述蛋白在防治禾谷孢囊线虫中的应用。

所述的应用，为将针对权利要求2所述的Ha34609蛋白的基因序列设计dsRNA片段，使禾谷孢囊线虫摄入dsRNA片段影响禾谷孢囊线虫的生长发育，从而防治禾谷孢囊线虫。

所述dsRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

含有上述Ha34609基因及其同源基因的重组表达载体、干扰载体、超表达载体、重组病毒、dsRNA、转基因细胞系、转基因植物或组织、重组菌、重组基因表达盒均属于本发明的保护范围。

含有Ha34609基因的重组表达载体包括双元农杆菌载体，病毒载体，细菌表达载体及酵母表达载体等，具体可以为pDGR，pGDG，pGADT7等。含有Ha34609基因的载体在构建过程中，可以单独或者多个组合使用诱导型、增强型、组成型、组织特异型启动子。载体可以包括抗生素或抗化学试剂的抗性筛选标记，也可以含有产生颜色变化的酶，比如GUS，或者荧光标记蛋白，例如红色或绿色荧光蛋白。构建的载体可以转化细菌，真菌及单双子叶植物，具体可以为大肠杆菌，酵母，烟草，拟南芥及小麦，大麦。

抑制Ha34609基因的表达为本发明的保护范围，本发明还保护用于抑制Ha34609基因表达的物质在制备产品中的应用。所述产品功能为抑制孢囊线虫对植物的寄生和/或抑制孢囊线虫对植物的致病和/或抑制孢囊线虫的发育。用于抑制Ha34609基因表达的物质具体可以为抑制Ha34609基因表达的dsRNA，干扰载体，以及病毒载体。所述植物可以为单子叶植物或双子叶植物，具体可以为小麦温麦19，大麦Golden Promise等。

本发明保护Ha34609蛋白在抑制孢囊线虫对植物的寄生与危害，和/或抑制孢囊线虫对植物的致病性，和/或抑制孢囊线虫发育中的应用。

本发明还保护用于抑制Ha34609蛋白活性的物质在制备产品中的应用。所述产品功能为抑制孢囊线虫对植物的寄生和/或抑制孢囊线虫对植物的致病和/或抑制孢囊线虫的发育。所述植物可以为单子叶植物或双子叶植物，具体可以为小麦温麦19，大麦GoldenPromise等。

本发明还保护Ha34609蛋白在植物中的表达，所述寄主植物具体可以为烟草、小麦和大麦，例如本氏烟，小麦温麦19，大麦Golden Promise。

植物内寄生线虫的食道腺由两个亚腹食道腺细胞和一个背食道腺细胞组成，能够编码和表达分泌蛋白，并通过口针释放到植物体内，在线虫侵染寄主、建立并维持取食位点的过程中起重要作用。本发明提供的Ha34609基因，在禾谷孢囊线虫食道腺表达，在侵染前2龄幼虫、侵染后2龄线虫和3龄幼虫中均有明显表达，其中侵染后2龄幼虫中表达量最高；亚细胞定位实验结果表明Ha34609蛋白定位于烟草叶片细胞的液泡膜上。利用dsRNA处理沉默Ha34609基因后，禾谷孢囊线虫的白雌虫量与对照eGFP dsRNA相比，无显著差异；而在白雌虫大小统计中，经DS2dsRNA浸泡处理后的白雌虫的长度、宽度与对照eGFP dsRNA相比显著减小(t检验，置信区间95％)，表明该基因在禾谷孢囊线虫寄生致病过程中具有重要作用，可作为植物抗线虫工程的靶标基因。本发明对于孢囊线虫致病机理研究以及抗线虫植物制备具有重大价值，为解析禾谷孢囊线虫效应蛋白与寄主的互作机制提供理论基础，为开发防控新技术提供新的策略。

附图说明

图1为实施例2的结果。Ha34609基因在禾谷孢囊线虫2龄幼虫中组织定位分析。A：反链探针杂交结果表明Ha34609基因由食道腺细胞分泌；B：正链探针杂交结果为负对照，SvG：亚腹食道腺细胞；S：口针；M：中食道腺；

图2为实施例3的结果，通过qRT-PCR检测Ha34609基因在6个龄期中的发育表达。相对表达分析的方法为2^-ΔΔCt法，内参基因为GAPDH。卵(Egg)的RQ＝1。Egg：卵；J2：侵染前2龄幼虫；PJ2：侵染后2龄幼虫；J3：3龄幼虫；J4：4龄幼虫；F：雌成虫。

图3为实施例4的结果，通过亚细胞定位显示Ha34609蛋白定位于烟草叶片细胞的液泡膜上而并非过氧化物酶体上。A：Ha34609^+SP定位于液泡膜；B：Ha34609^-SP定位于液泡膜C：Ha34609^+SP不定位于过氧化物酶体；D：Ha34609^-SP不定位于过氧化物酶体。

图4为实施例5中平均每各处理禾谷孢囊线虫在接种50天后白雌虫数量的统计结果。

图5为实施例5中平均每各处理禾谷孢囊线虫在接种50天后白雌虫大小的统计结果。A：白雌虫长度；B：白雌虫宽度。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的，同时本申请人可以对公众发放。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、Ha34609蛋白以及Ha34609基因的发现

1、收集禾谷孢囊线虫2龄幼虫(约5000头)，使用DEPC处理水洗2-3次，转入1.5ml离心管，加入1ml Trizol(Invitrogen)，液氮中速冻30S，37℃水浴30S，重复冻融4-5次，然后在室温下静置5min，提取总RNA，采用DNA-free^TM DNA Removal Kit试剂盒去除总RNA中残存的DNA，反转录获得cDNA。

2、以cDNA为模板，采用引物Ha34609-F和Ha34609-R进行PCR扩增，具体序列如下：

上游引物Ha34609-F：5’-ATGAGTTTATCAATATTTTTGTGGTTGT-3’，

下游引物Ha34609-R：5’-TCAAGTGCAAAATGGCCAGAA-3’；

扩增体系为10×PCR Ex Buffer(Mg²⁺)，5μl；dNTP(10mM)，4μl；上游引物(10mM)，下游引物(10mM)各1μl；Ex Taq，0.5μl；cDNA第一链模板，1μl；去离子水，35.5μl，总体积50μl。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃，30sec，54℃，30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。3、将pMD19-T载体与步骤2中的PCR扩增产物连接，然后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞中，测序。测序结果表明，扩增产物中具有序列表的SEQ ID NO:2所示的开放阅读框，编码序列表的SEQ ID NO:1所示的蛋白质。将序列表的SEQ ID NO:1命名为Ha34609蛋白，将其编码基因命名为Ha34609基因。

实施例2、Ha34609基因的组织定位分析

1、以Ha34609基因克隆载体为模板通过常规PCR扩增靶标序列，以上游引物Ha34609-yw-F：5’-AAGGCGTTGAAAATGGGTGC-3’和下游引物Ha34609-yw-R：5’-CCCAGGGCCTTGTTCGATAA-3’，进行PCR反应，体系如下10×PCR Ex Buffer(Mg²⁺)，2.5μl；dNTP(10mM)，4μl；上游引物(10mM)，下游引物(10mM)各1μl；Ex Taq，0.3μl；质粒模板，1μl；去离子水，16.2μl，总体积25μl。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃，30sec，57℃，30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化。2、以单引物PCR合成地高辛标记的正链探针和反链探针。以Ha34609-yw-F或Ha34609-yw-R为引物，以步骤1回收的目的片段为模板进行PCR扩增扩增，得到反链探针/正链探针。体系如下10×PCR Ex Buffer(Mg²⁺)，2.5μl；地高辛标记的dNTP mix(10mM)，1μl；Ha34609-yw-F或Ha34609-yw-R(10mM)，1μl；Ex Taq，0.3μl；PCR产物(上步骤获得)，1μl；去离子水，19.2μl，总体积25μl。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃，30sec，57℃，30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。按照说明书进行原位杂交。结果见图1。结果显示，反链探针有杂交信号，杂交信号位于亚腹食道腺，表明Ha34609基因为亚腹食道腺细胞表达基因。

实施例3、Ha34609基因的发育表达分析

参考Long等(Long H B,Peng D L,Huang W K,Peng H,Wang G F.Molecularcharacterization and functional analysis of two newβ-1,4-endoglucanase genes(Ha-eng-2,Ha-eng-3)from the cereal cyst nematode Heterodera avenae[J].PlantPathology,2013,62(4):953-960.)所述方法，在温麦19感病小麦根部大量接种禾谷孢囊线虫2龄幼虫，通过控制接种时间结合酶裂解处理分离获得6种不同发育阶段的禾谷孢囊线虫(侵染前2龄幼虫、侵染后2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、雌虫和卵)。采用磁珠法分别提取6个龄期的mRNA，反转录成第一链cDNA作为模板，采用primer 5.0软件设计Ha34609基因特异性上游引物Ha34609-q-F：5’-TTTACTACATCCGCCGCTTC-3’，和下游引物Ha34609-q-R：5’-ACCGCAAGTTTGCCCATTTG-3’。采用Real time PCR相对定量技术检测靶基因在不同龄期的表达量，以GAPDH基因(Chen C L,Liu S S,Liu Q,Niu J H,Liu P,Zhao J L,Jian H.AnANNEXIN-Like Protein from the Cereal Cyst Nematode Heterodera avenaeSuppresses Plant Defense[J].Plos One,2015,10(4):e122256.)作为内参基因，采用Select Master Mix试剂盒(Takara)，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行Real-timeRT-PCR检测，分别进行三次生物学重复实验，采用2^-△△Ct法分析结果，从而明确Ha34609基因在小麦禾谷孢囊线虫不同发育阶段表达情况。

反应体系(20μl)：SYBR Premix Ex TaqⅡ，10μl；ROX Refence DyeⅡ，0.4μl；上游引物(10μM)和下游引物(10μM)各1μl；模板，1μl；ddH₂O补足。反应程序：50℃/2min，95℃/2min；95℃/15s，58℃/15s，72℃/30s，40个循环；95℃/15s，60℃/1min，95℃/30s，60℃/15s。结果见图2。相对于卵时期的表达量，Ha34609基因在侵染前2龄幼虫、侵染后2龄线虫和3龄幼虫中均有明显表达，其中侵染后2龄幼虫中表达量最高。结果显示Ha34609基因主要在禾谷孢囊线虫侵染和寄生初期表达。

实施例4、Ha34609基因的亚细胞定位

1、以Ha34609基因cDNA为模板通过常规PCR扩增靶标序列，包括去信号肽的片段(Ha34609-SP)和含信号肽的片段(Ha34609+SP)。引物具体序列如下：

上游引物Ha-NSP-F：5’-TCTCGAGCTCAAGCTTCGCATAAATCGTATCAACAACAGCAA-3’，

下游引物Ha-NSP-R：5’-TAGATCCGGTGGATCCTCAAGTGCAAAATGGCCAGAAGAA-3’；

上游引物Ha-SP-F：5’-TCTCGAGCTCAAGCTTCGATGAGTTTATCAATATTTTTGTGGTTG-3’，

下游引物Ha-SP-R：5’-TAGATCCGGTGGATCCTCAAGTGCAAAATGGCCAGAAG-3’。

PCR反应体系为：10×PCR Ex Buffer(Mg²⁺)，2.5μl；dNTP(10mM)，2μl；上游引物(10mM)，下游引物(10mM)各0.5μl；Ex Taq，0.5μl；cDNA模板，3μl；去离子水，16μl，总体积25μl。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃/30sec，60℃/30sec，72℃/1.5min；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化，并对扩增片段进行回收、连接、转化、测序。

2、以pGDR为载体(Goodin M M,Dietzgen R G,Schichnes D,Ruzin S,Jackson AO.pGD vectors:versatile tools for the expression of green and red fluorescentprotein fusions in agroinfiltrated plant leaves.[J].Plant Journal,2002,31(3):375-383.)，以Ha34609+SP/-SP为插入片段，构建了Ha34609^+SP-RFP(带信号肽)和Ha34609^-SP-RFP(去信号肽)两个重组载体。将重组载体以及两个Marker质粒：tonoplast-GFP(液泡膜)和peroxisomes-GFP(过氧化物酶体)(Nelson B K,Cai X,Nebenführ A.Amulticolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies inArabidopsis and other plants[J].Plant Journal for Cell&Molecular Biology,2007,51(6):1126-1136.)采用热激法转入EHA105农杆菌感受态细胞中，取适量摇培菌液涂布于含有相应抗生素(包括质粒抗性Kan⁺和农杆菌抗性Rif⁺)的LB平板上，28℃下培养36-48h。

3、将上述转化成功的农杆菌重新划线培养，挑取单菌落接种于适量LB液体培养基中(含相应的抗生素)，28℃振荡培养，室温下离心4000rpm/15min，弃上清后用悬浮缓冲液(含10mM MgCl₂+10mM MES+200μM As的无菌水)重悬菌体，并用悬浮缓冲液调节OD₆₀₀至所需量。混匀后静置3h后，用1ml注射器向烟草(本氏烟)幼苗注射混合菌液，每棵苗注射3-4片叶(苗龄4-5叶期)，注射时先用针尖在叶片上(正反面均可)轻轻划出一个小伤口，再用注射器(去掉针头)平压在伤口处，然后注射，避免叶片破损和流水冲洗。3-4天后，使用Carl Zeiss蔡司激光共聚焦显微镜880观察。见图3。实施结果如图所示，红色荧光显示的Ha34609^+SP/Ha34609^-SP与绿色荧光显示的tonoplast重合，显示为黄色(图3A,B)，而不与绿色荧光显示的peroxisomes重合(图3C,D)，表明Ha34609蛋白定位于烟草叶片细胞的液泡膜上而并非过氧化物酶体上。

实施例5、通过体外RNAi沉默Ha34609基因验证其作为靶标在抗线虫中的应用

1、采用BLOCK-iT^TM RNAi Designer软件设计3对靶基因的特异引物，并在特异引物前面加上T7启动子序列(用下划线显示)，合成dsRNA模板并纯化用于下一步实验，同时以外源基因绿色荧光蛋白eGFP作为对照，具体引物序列见表1：

表1：用于dsRNA模板合成的引物

(带下划线的碱基序列为T7启动子序列)

2、按照Hiscribe T7Quick High Yield RNA synthesis kit说明书，合成Ha34609基因特异的dsRNA，以针对eGFP的dsRNA及水处理为对照，采用章鱼胺与亚精胺刺激小麦禾谷孢囊线虫2龄幼虫摄入dsRNA，将新孵化的小麦禾谷孢囊线虫J2幼虫浸泡在2mg/ml的dsRNA中避光缓慢振荡36h，无菌水洗涤多次后，接种到预培养3-4d的感病小麦温麦19根部。每管种植3株、重复5次。平均每管接种400头，50d后，分离、统计每株根系的白雌虫量和大小，从而确定靶基因沉默后对CCN侵染和发育的影响。见图4、图5。结果表明针对Ha34609的dsRNA处理后，小麦禾谷孢囊线虫的白雌虫量与对照eGFP dsRNA相比，无显著差异；而在白雌虫大小统计中，经DS2dsRNA浸泡处理后的白雌虫的长度、宽度与对照相比显著减小(t检验，置信区间95％)，可以作为线虫防控的靶标基因。序列见SEQ ID NO：3所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 禾谷孢囊线虫Ha34609蛋白、编码基因及其应用

<130> PP17064－ZWB

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 194

<212> PRT

<213> Ha34609蛋白氨基酸序列

<400> 1

Met Ser Leu Ser Ile Phe Leu Trp Leu Phe Thr Ile Val Ser Phe Thr

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ala Ser His Lys Ser Tyr Gln Gln Gln Gln Thr Asn Ser

20 25 30

Glu Pro Met Val Phe Glu Gly Val Glu Asn Gly Cys Asp Leu Ile Lys

35 40 45

Cys Ser Asn Gly Gln Thr Cys Gly Ile Arg Val Gly Leu Ala Lys Phe

50 55 60

Gly Asp Arg Glu Phe Glu Lys Phe Asp Phe Pro Lys Cys Val Thr Ser

65 70 75 80

Lys Ala Glu Leu Asn Arg Asn Thr Asp Asp Asp Gly Asn Gly Arg Ile

85 90 95

Val Thr Asp Gly Pro Gly Cys Asn Thr Val His Cys Ser His Gly Tyr

100 105 110

Lys Cys Gln Val Arg Ile Ser Ile Ser Lys Leu Gly Asp Leu Pro Tyr

115 120 125

Ala Gln Ser Ile Gly Thr Phe Pro Gln Cys Val Gly Pro Asn Gly Thr

130 135 140

Phe Gln Thr Pro Ser Ser Ile Ile Glu Gln Gly Pro Gly Cys Glu Lys

145 150 155 160

Leu Pro Thr Lys Cys Glu Ala Gly Thr Lys Cys Val Thr Ala Val Gly

165 170 175

Ile Ala Lys Tyr Gly Asn Leu Gln Trp Ser Gln Phe Phe Trp Pro Phe

180 185 190

Cys Thr

<210> 2

<211> 585

<212> DNA

<213> Ha34609基因编码序列

<400> 2

atgagtttat caatattttt gtggttgttc accatcgttt cctttactac atccgccgct 60

tcacataaat cgtatcaaca acagcaaaca aacagtgagc cgatggtatt tgaaggcgtt 120

gaaaatgggt gcgatttaat caaatgttca aatgggcaaa cttgcggtat tcgagttggt 180

cttgcaaaat ttggcgacag agaatttgag aaatttgatt ttccaaaatg tgtgacaagc 240

aaagcggaat tgaaccgaaa cacggacgac gatggaaatg ggcgcattgt cacggatgga 300

ccaggatgta atactgtaca ctgtagccac ggttacaaat gccaagtgcg catttcaatt 360

tctaagcttg gcgatttacc gtatgcccaa tcaatcggaa ccttccctca atgtgtgggt 420

ccaaatggca catttcaaac gccaagttca attatcgaac aaggccctgg gtgtgaaaaa 480

cttccgacta aatgtgaagc aggcacaaaa tgtgtcaccg ctgttggaat tgcgaaatat 540

ggaaatttgc aatggtctca gttcttctgg ccattttgca cttga 585

<210> 3

<211> 164

<212> DNA

<213> Ha34609基因的dsRNA片段

<400> 3

ttggcgacag agaatttgag aaatttgatt ttccaaaatg tgtgacaagc aaagcggaat 60

tgaaccgaaa cacggacgac gatggaaatg ggcgcattgt cacggatgga ccaggatgta 120

atactgtaca ctgtagccac ggttacaaat gccaagtgcg catt 164

Claims

1.禾谷孢囊线虫的Ha34609蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述的Ha34609蛋白的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种DNA分子，其编码Ha34609蛋白，且与权利要求2所述的基因序列具有90％以上的同源性。

4.根据权利要求2所述核苷酸序列设计的dsRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.权利要求2所述基因或权利要求1所述蛋白在防治禾谷孢囊线虫中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，为将针对权利要求2所述的Ha34609蛋白的基因序列设计dsRNA片段，使禾谷孢囊线虫摄入dsRNA片段影响禾谷孢囊线虫的生长发育，从而防治禾谷孢囊线虫。

7.根据权利要求6所述的应用，所述dsRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。