CN111575296A

CN111575296A - 大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN111575296A
Application number: CN202010559543.2A
Authority: CN
Inventors: 尤佳; 王从丽; 胡岩峰
Original assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Current assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2040-06-18
Also published as: CN111575296B

Abstract

大豆孢囊线虫Hg‑flp‑1基因及其编码蛋白和应用，涉及一种大豆孢囊线虫神经肽基因及其编码蛋白和应用。是要解决现有大豆孢囊线虫的化学防治方法存在环境污染的问题。该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。本发明神经肽基因Hg‑flp‑1，经过dsRNA处理后，侵染根内的二龄幼虫数量及侵染21天后根表雌虫数量分别下降25％和28.9％。本发明大豆孢囊线虫Hg‑flp‑1基因应用于大豆孢囊线虫防治领域。

Description

大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及一种大豆孢囊线虫神经肽基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

大豆是重要的粮食和油料作物，也是植物蛋白的主要来源，大豆的品质和产量对我国的农业经济发展至关重要。大豆孢囊线虫病是制约大豆品质和产量的重要因素之一，我国生产大豆的地方都有该病的发生。大豆孢囊线虫属于植物内寄生线虫，主要寄生于豆科，SCN经由寄主植物的根系侵入，造成寄主根部发育迟缓，根瘤减少，严重时导致绝产；此外，大豆孢囊线虫侵染还会加剧大豆疫霉、大豆茎褐腐病的发病程度(Sugawara,1997；Kaitany,2000；Tabor,2003)。当前对大豆孢囊线虫的防治以化学防治法为主，但该方法存在环境污染的问题；轮作及抗性育种的应用又受到轮作品种和顺序，育种年限长等限制。因此，挖掘大豆孢囊线虫的新基因，解析其在大豆孢囊线虫的运动、识别寄主、侵染和发育过程中的作用，以其作为新的靶标开发高效、广谱的新型环境友好型杀线药物，具有重要的理论指导意义和实际应用价值。

发明内容

本发明是要解决现有大豆孢囊线虫的化学防治方法存在环境污染的问题，提供大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因及其编码蛋白和应用。

本发明提供大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一目的是提供大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因的编码蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

进一步的，根据所述大豆孢囊线虫的Hg-flp-1基因设计合成的dsRNA片段，如序列表中SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因在防治大豆孢囊线虫中的应用。

进一步的，所述防治大豆孢囊线虫的方法为：根据大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因设计合成dsRNA片段；将dsRNA片段摄取到大豆孢囊线虫体内。

本发明的有益效果：

提供一种来源于大豆孢囊线虫的Hg-flp-1基因，与大豆孢囊线虫的侵染寄主有关，该基因在线虫的腹神经索表达，在大豆孢囊线虫的寄生期二龄幼虫和雄虫中表达较高。实验显示该基因参与大豆孢囊线虫侵染寄主过程的调节，可作为大豆孢囊线虫防治药物开发的靶标基因。

本发明针对Hg-flp-1基因序列，筛选特定的功能区域合成dsRNA，通过体外干扰的方法测定dsRNA处理对线虫侵染能力以及雌虫指数的影响，验证Hg-flp-1在线虫寄生过程中的作用。本发明神经肽基因Hg-flp-1，经过dsRNA处理后，侵染根内的二龄幼虫数量及侵染21天后根表雌虫数量分别下降25％和28.9％，结果表明该基因在大豆孢囊线虫侵染及发育过程中具有重要作用，可以作为杀线药物开发的靶标基因。

本发明对于大豆孢囊线虫致病机制的研究以及线虫防治具有重大价值。

附图说明

图1为RT-PCR克隆大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因；

图2为原位杂交显示Hg-flp-1在SCN神经细胞的定位；其中s：口针；mb：中食道球；vg：腹神经索；

图3为外源dsRNA处理对二龄幼虫中Hg-flp-1表达量的影响；

图4为幼虫接种48h后大豆根内的二龄幼虫数目；

图5为幼虫接种21天后大豆根表线虫的雌虫数。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

具体实施方式二：本实施方式大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因的编码蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

具体实施方式三：本实施方式根据所述大豆孢囊线虫的Hg-flp-1基因设计合成的dsRNA片段，如序列表中SEQ ID NO：3所示。

具体实施方式四：本实施方式大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因在防治大豆孢囊线虫中的应用。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：所述防治大豆孢囊线虫的方法为：根据大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因设计合成dsRNA片段；将dsRNA片段摄取到大豆孢囊线虫体内，抑制大豆孢囊线虫的侵染，从而减轻大豆孢囊线虫对寄主的寄生。其它与具体实施方式四相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：Hg-flp-1基因的克隆

1、收集新鲜孵化的大豆孢囊线虫二龄幼虫，放入生物冷冻研碎器，加入适量液氮迅速研磨，研磨后将线虫粉末转移到1.5mL的离心管中，加入Trizol 1mL，震荡混匀提取线虫的总RNA。

2、以步骤1的总RNA为模板，使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒合成线虫cDNA，合成后的cDNA保存于-80℃冰箱待用。

3、以步骤2合成的cDNA为模板，用上游引物F1和下游引物R1进行PCR扩增。

上游引物F1：5’-ATGACAGGGGTGACACAACAGC-3’

下游引物R1：5’-TTAGCCAAATCGCAGAAA-3’

扩增反应体系：5×Phusion Green HF Buffer，10μL，Phusion Hot StartΠDNAPolymerase，0.5μL，cDNA模板，2μL，上游引物F1，2μL，下游引物R1，2μL，dNTP，4μL，ddH₂O，29.5μL，总反应体系50μL。

反应条件：98℃变性10min，98℃，5sec，55℃，20sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物应用1％的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，结果如图1所示。

4、将步骤3中的PCR扩增产物连接T载体，并转化大肠杆菌Top 10培养，取500μL菌液测序。测序结果表明，扩增产物中具有序列表中SEQ ID NO：1所示的开放阅读框，编码序列表的序列表中SEQ ID NO：2所示的蛋白质。将序列表中SEQ ID NO：2命名为Hg-FLP-1蛋白，将其编码基因命名为Hg-flp-1基因。

实施例2：Hg-flp-1基因的组织定位分析

按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitI的方法对大豆孢囊线虫二龄幼虫进行组织定位分析。

1、以大豆孢囊线虫的cDNA为模板，用上游引物F1和下游引物R1扩增目的片段。

扩增反应体系：5×Phusion Green HF Buffer，4μL，Phusion Hot StartΠDNAPolymerase，0.2μL，cDNA模板，1μL，上游引物F1，1μL，下游引物R1，1μL，dNTP，1.6μL，ddH₂O，11.2μL，总反应体系20μL。反应条件；98℃变性10min，98℃，5sec，55℃，20sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物应用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化。

2、应用不对称PCR合成地高辛标记的正链探针和反链探针。

以步骤1回收的片段为模板，用上游引物F2和下游引物R2进行PCR扩增，获得正义探针和反义探针。

上游引物F2：5’-ATGACAGGGGTGACACAACAGC-3’

下游引物R2：5’-TTAGCCAAATCGCAGAAAATTTGG-3’

反应体系(25μL)：10×Taq buffer 2.5μL，DIG/dNTP mix(1mM)2.5μL，引物DIG-High Primer 5μL，模板1μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL，DEPC-H₂O补足。反应条件：94℃4min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。

3、进行原位杂交。

原位杂交结果见图2。结果显示，反义链探针标记的Hg-flp-1处理后，位于线虫神经环后的腹神经索部位的组织细胞发生显色反应。结果表明，Hg-flp-1主要在二龄幼虫(H.glycines J2s)的腹神经索组织表达。

实施例3：体外RNAi干扰试验验证Hg-flp-1功能

1、dsRNA的合成：设计目的片段的特异性引物

引物Hg-FLP1-si-F：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGATGACAGGGGTGACACAAC-3’

引物Hg-FLP1-si-R：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGTTAGCCAAATCGCAGAAAAT-3’

在特异性引物的5’端引入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG。以cDNA为模板合成dsRNA，纯化后用于下一步实验。

2、按照MEGAscript^TM RNAi Kit说明书合成dsRNA

反应体系：步骤1模板1μg，10×T7 Reaction buffer 2μL，ATP 2μL，CTP 2μL，GTP2μL，UTP 2μL，T7 Enzyme Mix 2μL，Nuclease-free water补足至20μL，37℃暗处孵育4h，-20℃放置过夜。产物应用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，260nm波长下检测dsRNA浓度，合成的dsRNA在-80℃保存。dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

3、收集新鲜孵化的大豆孢囊线虫二龄幼虫，1/4M9 buffer清洗三遍后待用。

4、大豆孢囊线虫的二龄幼虫体外RNAi干扰参照文章(Urwin PE,Lilley CJ,Atkinson HJ.Ingestion of double-stranded RNA by preparasitic juvenile cystnematodes leads to RNA interference[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2002,15(8):747-752.)中的方法。取500条步骤3收集的二龄幼虫，浸泡在处理液1、处理液2、处理液3中，500条/样本，每个处理重复三次，室温下暗处震荡孵育48h。

处理液1含有50mM章鱼胺、3mM精氨酸、0.05％明胶、2mg/mL dsRNA和0.1mg/mLFITC。

处理液2含有50mM章鱼胺、3mM精氨酸、0.05％明胶和2mg/mL dsRNA。

处理液3含有50mM章鱼胺、3mM精氨酸、0.05％明胶和2mg/mL gfp。

5、移液器吸取数条处理液1组二龄幼虫，使用荧光显微镜在488-525nm波长下检测线虫体内是否可见绿色荧光。

6、提取处理液2和处理液3浸泡大豆孢囊线虫的总RNA并反转为cDNA，应用荧光定量PCR检测Hg-flp-1基因的表达量(以actin基因为内参)，结果如图3，Hg-flp-1的dsRNA处理后，大豆孢囊线虫体内Hg-flp-1表达量显著降低。

荧光定量检测引物：

引物Hg-flp-1F：TCGGTCGCTTCTCCTGTT

引物Hg-flp-1R：GACTGAATGGACGAAATGG

引物Hg-actin F：GCGTGGTTACTCCTTCGTG

引物Hg-actin R：CGGGCAGTTCGTAGCTCTTC

引物GFP F：CAGTGCTTCAGCCGCTACCC

引物GFP R：AGTTCACCTTGATGCCGTTCTT

7、处理液2和处理液3处理后的二龄幼虫300条接种大豆幼苗，暗处培养48h后采用品红法检测侵染率。减去大豆地上部分，清水冲洗干净大豆根后浸泡在15％的次氯酸钠溶液中4min。取出大豆根，用无菌水彻底清洗干净次氯酸钠，将洗后的大豆根浸泡在品红溶液中，加热至溶液沸腾。沸腾30s后室温放置直至品红溶液降至室温。取一棵大豆根用清水清洗表面品红后制做玻片，在体式解剖镜下统计根内线虫数量，计算侵染率。

侵染率计算公式如下：

侵染率＝(侵入根内线虫数/接种线虫数)×100％

8、接种35d后统计根表雌虫数量。

外源Hg-flp-1-dsRNA处理二龄幼虫(H.glycines J2s)后对SCN神经细胞侵染和繁殖的影响如图4和5所示。结果显示，RNAi干扰后，Hg-flp-1表达量下降了68％，侵染率和雌虫指数分别降低了25％和28.9％，结果说明，dsRNA能够干扰Hg-flp-1的表达，Hg-flp-1沉默后影响线虫的侵染和发育，可以作为杀线药物的靶标基因用于线虫防控。

序列表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因及其编码蛋白和应用

<160> 15

<210> 1

<211> 561

<212> DNA

<213> 胞囊线虫属(Heterodera)

<220>

<223>大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因

<400> 1

atgacagggg tgacacaaca gcaacaaaat aatgcaacaa gatttattcg gcgacaacat 60

gcaaatcacg gcactgagca tcggtcgctt ctcctgttcc tcagcctggc cattggttgc 120

tgtgcattgg cacaatcaca tgctgctgat ggtgggacat ccaacggaca ccttgctcca 180

atggtgccga actcgcccat ttcgtccatt cagtcagacc cgaactttct gcgctttgga 240

agaagtaatg gccaactgaa cgaattcaac agtgcatctc agacaccgac aaggacgtcc 300

tcaaattttc tcagattcgg caaatcatcg atgctcgttt ctgagcctaa ttttctccgt 360

tttggccgac aaaaagttgg cggagcaggt ggcggcgttg acccgacctt tctgcgcttt 420

ggacgtgcca aaaataacaa tttcctacgt tttggacgtg ccgtcggcga tgatgcaatg 480

ctcatttctg gtgacgatga tgaaacgccg ttcacgcgcg agtaccgcca ggccaaccca 540

aattttctgc gatttggcta a 561

<210> 2

<211> 186

<212> PRT

<213>胞囊线虫属(Heterodera)

<220>

<223>大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因编码蛋白

<400> 2

Met Thr Gly Val Thr Gln Gln Gln Gln Asn Asn Ala Thr Arg Phe

5 10 15

Ile Arg Arg Gln His Ala Asn His Gly Thr GLu His Arg Ser Leu

20 25 30

Leu Leu Phe Leu Ser Leu Ala Ile Gly Cys Cys Ala Leu Ala Gln

35 40 45

Ser His Ala Ala Asp Gly Gly Thr Ser Asn Gly His Leu Ala Pro

50 55 60

Met Val Pro Asn Ser Pro Ile Ser Ser Ile Gln Ser Asp Pro Asn

65 70 75

Phe Leu Arg Phe Gly Arg Ser Asn Gly Gln Leu Asn Glu Phe Asn

80 85 90

Ser Ala Ser Gln Thr Pro Thr Arg Thr Ser Ser Asn Phe Leu Arg

95 100 105

Phe Gly Lys Ser Ser Met Leu Val Ser Glu Pro Asn Phe Leu Arg

110 115 120

Phe Gly Arg Gln Lys Val Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Asp Phe

125 130 135

Thr Phe Leu Arg Phe Gly Arg Ala Lys Asn Asn Asn Phe Leu Arg

140 145 150

Phe Gly Arg Ala Val Gly Asp Asp Ala Met Leu Ile Ser Gly Asp

155 160 165

Asp Asp Glu Thr Pro Phe Thr Arg Glu Tyr Arg Gln Ala Asn Pro

170 175 180

Asn Phe Leu Arg Phe Gly

185 186

<210> 3

<211> 561

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Hg-flp-1-dsRNA

<400> 3

atgacagggg tgacacaaca gcaacaaaat aatgcaacaa gatttattcg gcgacaacat 60

gcaaatcacg gcactgagca tcggtcgctt ctcctgttcc tcagcctggc cattggttgc 120

tgtgcattgg cacaatcaca tgctgctgat ggtgggacat ccaacggaca ccttgctcca 180

atggtgccga actcgcccat ttcgtccatt cagtcagacc cgaactttct gcgctttgga 240

agaagtaatg gccaactgaa cgaattcaac agtgcatctc agacaccgac aaggacgtcc 300

tcaaattttc tcagattcgg caaatcatcg atgctcgttt ctgagcctaa ttttctccgt 360

tttggccgac aaaaagttgg cggagcaggt ggcggcgttg acccgacctt tctgcgcttt 420

ggacgtgcca aaaataacaa tttcctacgt tttggacgtg ccgtcggcga tgatgcaatg 480

ctcatttctg gtgacgatga tgaaacgccg ttcacgcgcg agtaccgcca ggccaaccca 540

aattttctgc gatttggcta a 561

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物F1

<400> 4

atgacaggggtgacacaacagc 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物R1

<400> 5

ttagccaaatcgcagaaa 18

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物F2

<400> 6

atgacaggggtgacacaacagc 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物R2

<400> 7

ttagccaaatcgcagaaaatttgg 24

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Hg-FLP1-si-F

<400> 8

taatacgactcactatagggagatgacaggggtgacacaac 41

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Hg-FLP1-si-R

<400> 9

taatacgactcactatagggagttagccaaatcgcagaaaat 42

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Hg-flp-1 F

<400> 10

tcggtcgcttctcctgtt 18

<210>11

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Hg-flp-1 R

<400> 11

gactgaatggacgaaatgg 19

<210>12

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Hg-actin F

<400> 12

gcgtggttactccttcgtg 19

<210>13

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Hg-actin R

<400> 13

cgggcagttcgtagctcttc 20

<210>14

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物GFP F

<400> 14

cagtgcttcagccgctaccc 20

<210>15

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物GFP R

<400> 15

agttcaccttgatgccgttctt 22

Claims

1.大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。

2.如权利要求1所述大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因的编码蛋白，其特征在于所述编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因设计合成的dsRNA片段，其特征在于所述dsRNA片段的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求1所述大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因在防治大豆孢囊线虫中的应用。

5.根据权利要求4的应用，其特征在于所述防治大豆孢囊线虫的方法为：根据大豆孢囊线虫Hg-flp-1基因设计合成dsRNA片段；将dsRNA片段摄取到大豆孢囊线虫体内。