CN113151292A - 大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因及其dsRNA在线虫防治中的应用 - Google Patents

大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因及其dsRNA在线虫防治中的应用 Download PDF

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Abstract

大豆孢囊线虫Hg‑flp‑22基因及其dsRNA在线虫防治中的应用，涉及分子生物学领域，尤其涉及大豆孢囊线虫Hg‑flp‑22基因及其dsRNA在线虫防治中的应用。是要解决现有大豆孢囊线虫的防治方法存在污染环境、受到轮作品种、育种年限限制的问题。该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。该基因的dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。将该基因的dsRNA片段摄取到大豆孢囊线虫体内，抑制大豆孢囊线虫的侵染，从而减轻大豆孢囊线虫对寄主的寄生。本发明应用于线虫防治领域。

Description

大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因及其dsRNA在线虫防治中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因及其dsRNA在线虫防治中的应用。
背景技术
大豆是我国重要的经济作物，作为粮食和油料被广泛种植，同时大豆也是植物蛋白的主要来源。大豆的品质和产量对我国的农业经济发展至关重要。
大豆孢囊线虫病是制约大豆产量和品质的主要因素之一，我国大豆的主产区都有发生。大豆孢囊线虫(Soybean cyst nematode，简称SCN)属于植物内寄生线虫，主要寄生于豆科，大豆孢囊线虫经由寄主植物的根系侵入，造成寄主根部发育迟缓，根瘤减少，甚至绝产。此外，大豆孢囊线虫侵染还会加剧大豆疫霉、大豆茎褐腐病的发病程度(Sugawara,1997；Kaitany,2000；Tabor,2003)。
当前化学防治法是大豆孢囊线虫的主要防治手段，但该方法存在污染环境的问题；轮作及抗性育种等防治方法又受到轮作品种和顺序，育种年限等限制。因此，挖掘大豆孢囊线虫的新基因，解析其在寄主识别、侵染、寄生和繁殖过程中的作用，以其作为新的靶标开发高效、广谱的新型环境友好型杀线药物，具有重要的理论指导意义和实际应用价值。
发明内容
本发明是要解决现有大豆孢囊线虫的防治方法存在污染环境、受到轮作品种、育种年限限制的问题，提供一种大豆孢囊线虫的Hg-flp-22基因及其应用。
本发明提供大豆孢囊线虫的Hg-flp-22基因的核苷酸序列，如序列表中SEQ IDNO：1所示。
本发明以大豆孢囊线虫的Hg-flp-22基因片段为模板，并设计特异性引物，通过MEGAscript RNAi试剂盒合成Hg-flp-22基因dsRNA。
本发明提供大豆孢囊线虫的Hg-flp-22基因的dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
本发明大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因的dsRNA在线虫防治中的应用。
进一步的，具体方法为：将大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因的dsRNA片段摄取到大豆孢囊线虫体内，抑制大豆孢囊线虫的侵染，从而减轻大豆孢囊线虫对寄主的寄生。
进一步的，所述摄取方法为将大豆孢囊线虫浸泡在含有dsRNA的处理液中。
优选的，所述处理液中dsRNA的浓度为2mg/mL。
本发明的有益效果：
本发明大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因，该基因在大豆孢囊线虫的神经肌肉组织表达，预寄生期二龄幼虫中表达最高，实验显示该基因参与大豆孢囊线虫侵染和寄生寄主过程的调节，可作为大豆孢囊线虫防治药物开发的靶标基因。
本发明针对Hg-flp-22基因序列，筛选特定的功能区域合成dsRNA，通过体外干扰的方法测定dsRNA处理对线虫侵染能力以及雌虫指数的影响，验证Hg-flp-22在线虫寄生过程中的作用。本发明神经肽基因Hg-flp-22，经过dsRNA处理后，侵染根内的二龄幼虫数量及侵染21天后根表雌虫数量分别下降50.1％和41.1％，结果表明该基因在大豆孢囊线虫侵染及发育过程中具有重要作用，可以作为杀线药物开发的靶标基因。
本发明的大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因用于线虫防治，不污染环境，也不受到轮作品种、育种年限限制。本发明对于大豆孢囊线虫致病机制的研究以及线虫防治具有重大价值。
附图说明
图1为RT-PCR克隆大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因
图2为原位杂交显示Hg-flp-22在SCN神经肌肉细胞的定位。
图3为外源dsRNA处理对J2s中Hg-flp-22表达的影响。
图4为外源Hg-flp-22-dsRNA处理的H.glycines J2接种24h后大豆根内的J2幼虫数目。
图5为外源Hg-flp-22-dsRNA处理的H.glycines J2接种21天后大豆根表线虫的雌虫数。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、Hg-flp-22基因的发现
1、收集新鲜孵化的大豆孢囊线虫二龄幼虫，放入生物冷冻研碎器，加入适量液氮迅速研磨，将研磨后的线虫粉末转移到1.5mL的离心管中，加入1mL Trizol，震荡混匀提取线虫的总RNA。
2、以步骤1的总RNA为模板，使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒合成线虫cDNA，合成后的cDNA保存于-80℃冰箱待用。
3、以步骤2合成的cDNA为模板，用上游引物F1和下游引物R1进行PCR扩增。
上游引物F1：5'-AATGGTCGTCGTTCTGTCG-3'
下游引物R1：5'-GTTTGCCTTGTGGGCGCTGC-3'
扩增反应体系5×Phusion Green HF Buffer，10μL；Phusion Hot StartΠDNAPolymerase，0.5μL；cDNA模板，2μL；上游引物，2μL；下游引物，2μL；dNTP，4μL；ddH2O，29.5μL；总反应体系50μL。反应条件；98℃变性10min，98℃，5sec，55℃，20sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物应用1％的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，如图1所示。
4、将步骤3中的PCR扩增产物连接T载体，并转化大肠杆菌DH5α培养，取500μL菌液测序，见序列表中序列1。
测序结果表明，扩增产物中具有序列表中SEQ ID NO：1所示的开放阅读框，将其命名为Hg-flp-22基因。
实施例2、Hg-flp-22基因的组织定位分析
按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitI的方法对大豆孢囊线虫二龄幼虫进行组织定位分析。
1、以大豆孢囊线虫的cDNA为模板，用上游引物F2和下游引物R2扩增目的片段。
上游引物F2：5'-AATGGTCGTCGTTCTGTCG-3'
下游引物R2：5'-GTTTGCCTTGTGGGCGCTGC-3'
扩增反应体系5×Phusion Green HF Buffer，4μL，Phusion Hot StartΠDNAPolymerase，0.2μL，cDNA模板，1μL，上游引物，1μL，下游引物，1μL，dNTP，1.6μL，ddH2O，11.2μL，总反应体系20μL。反应条件；98℃变性10min，98℃，5sec，55℃，20sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物应用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化。
2、应用不对称PCR合成地高辛标记的正义链探针和反义链探针。
以步骤1回收的片段为模板，用上游引物F3和下游引物R3进行PCR扩增，获得正义链探针和反义链探针。
上游引物F3：5'-GCTTCTCCGCCGACTTCA-3'
下游引物R3：5'-GATTGCCATTTTCCGCTTTC-3'
反应体系(25μL)：10×Taq buffer 2.5μL，DIG/dNTP mix(1mM)2.5μL，引物DIG-High Primer 5μL，模板1μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL，DEPC-H2O补足。反应条件：94℃4min；94℃30S，60℃30S，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。
进行原位杂交。
结果见图2。结果显示，反义链探针标记的Hg-flp-22处理后，位于线虫围咽神经环后的腹神经索部位以及尾部的神经组织细胞发生显色反应，结果表明，Hg-flp-22主要在J2的头部腹神经索及尾部神经组织表达。
实施例3、体外RNAi干扰试验验证Hg-flp-22功能
1、dsRNA的合成，设计目的片段的特异性引物
Hg-FLP1-si-F：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGTTCTCCGCCGACTTCAC-3'
Hg-FLP1-si-R：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGTCCCAAACCGTACCCAC-3'
在特异性引物的5’端引入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG。以cDNA为模板合成dsRNA，纯化后用于下一步实验。大豆孢囊线虫的Hg-flp-22基因的dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
2、按照MEGAscriptTM RNAi Kit说明书合成dsRNA，反应体系，步骤1模板1μg，10×T7 Reaction buffer 2μL，ATP 2μL，CTP 2μL，GTP 2μL，UTP 2μL，T7 Enzyme Mix 2μL，Nuclease-free water补足至20μL，37℃暗处孵育4h，-20℃放置过夜。产物应用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，260nm波长下检测dsRNA浓度，合成的dsRNA在-80℃保存。
3、收集新鲜孵化的大豆孢囊线虫二龄幼虫，1/4M9 buffer清洗三遍后待用。
4、大豆孢囊线虫的二龄幼虫体外RNAi干扰参照Urwin的方法。取500条步骤3收集的二龄幼虫，浸泡在处理液1、处理液2、处理液3中，室温下暗处震荡孵育48h。
处理液1含有50mM章鱼胺、3mM精氨酸、0.05％明胶、2mg/mL dsRNA，0.1mg/mLFITC。
处理液2含有50mM章鱼胺、3mM精氨酸、0.05％明胶、2mg/mL dsRNA。
处理液3含有50mM章鱼胺、3mM精氨酸、0.05％明胶、2mg/mL gfp。
5、移液器吸取数条处理液1组二龄幼虫，使用荧光显微镜在488-525nm波长下检测线虫体内是否可见绿色荧光。
6、提取处理液2和处理液3浸泡大豆孢囊线虫的总RNA并反转为cDNA，应用荧光定量PCR检测Hg-flp-22基因的表达量(以actin基因为内参)。
荧光定量检测引物：
Hg-flp-22F：5'-GCTTCTCCGCCGACTTCA-3'
Hg-flp-22R：5'-GCCATTTTCCGCTTTCCGA-3'
Hg-actin F：5'-GCGTGGTTACTCCTTCGTG-3'
Hg-actin R：5'-CGGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3'
GFP F：5'-CAGTGCTTCAGCCGCTACCC-3'
GFP R：5'-AGTTCACCTTGATGCCGTTCTT-3'
7、处理液2和处理液3处理后的二龄幼虫200条接种大豆幼苗，暗处培养48h后采用品红法检测侵染率。剪去大豆地上部分，清水冲洗干净大豆根后浸泡在15％的次氯酸钠溶液中4min。取出大豆根，用无菌水彻底清洗干净次氯酸钠，将洗后的大豆根浸泡在品红溶液中，加热至溶液沸腾。沸腾30s后室温放置直至品红溶液降至室温。取一棵大豆根用清水清洗表面品红后制做玻片，在体式解剖镜下统计根内线虫数量，计算侵染率。
8、接种21d后统计根表雌虫数量。
外源dsRNA处理对J2s中Hg-flp-22表达的影响如图3所示，外源Hg-flp-22-dsRNA处理的H.glycines J2接种24h后大豆根内的J2幼虫数目如图4所示，外源Hg-flp-22-dsRNA处理的H.glycines J2接种21天后大豆根表线虫的雌虫数如图5所示。
结果显示，RNAi干扰后，Hg-flp-22表达量下降了55.9％，侵染率和雌虫指数分别降低了50.1％和41.1％，结果说明，dsRNA能够干扰Hg-flp-22的表达，Hg-flp-22沉默后影响线虫的侵染和发育，可以作为杀线药物的靶标基因用于线虫防控。
序 列 表
<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所
<120>大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因及其dsRNA在线虫防治中的应用
<160> 16
<210> 1
<211> 390
<212> DNA
<213> 胞囊线虫属（Heterodera）
<220>
<223>大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因
<400> 1
atggtcgtcg ttctgtcggc actttcctcc ggcacttttc cccctcattt ttcactgcgt 60
tggcattccc tctcattttt gctggtgttc attctgctta cagtttgctt ctccgccgac 120
ttcaccaatt gtcattccgt gccgtcttta atggcatttg accccacaaa attgcgacga 180
cttatgccaa ttcgggaatt tttgagcgac gatcaattgg cattcgaacg cgcaattcgg 240
caacccgcgg gcggcgtcaa atggatgcgc tttgggaaaa ggacgcccca gggcaaatgg 300
atgcgattcg gaaagcggaa aatggcaatc gaagggggca agtgggtacg gtttgggaag 360
agagcggaag agatgcaggg agaggagtga 390
<210> 2
<211> 250
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因的dsRNA序列
<400> 2
uucuccgccg acuucaccaa uugucauucc gugccgucuu uaauggcauu ugaccccaca 60
aaauugcgac gacuuaugcc aauucgggaa uuuuugagcg acgaucaauu ggcauucgaa 120
cgcgcaauuc ggcaacccgc gggcggcguc aaauggaugc gcuuugggaa aaggacgccc 180
cagggcaaau ggaugcgauu cggaaagcgg aaaauggcaa ucgaaggggg caagugggua 240
cgguuuggga 250
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物F1
<400> 3
aatggtcgtcgttctgtcg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物R1
<400> 4
gtttgccttgtgggcgctgc 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物F2
<400> 5
aatggtcgtcgttctgtcg 19
<210>6
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物R2
<400> 6
gtttgccttgtgggcgctgc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物F3
<400> 7
gcttctccgccgacttca 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物R3
<400> 8
gattgccattttccgctttc 20
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物Hg-FLP1-si-F
<400> 9
taatacgactcactatagggagttctccgccgacttcac 39
<210>10
<211> 39
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物 Hg-FLP1-si-R
<400> 10
taatacgactcactatagggagtcccaaaccgtacccac 39
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物Hg-flp-22 F
<400> 11
gcttctccgccgacttca 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物 Hg-flp-22 R
<400> 12
gccattttccgctttccga 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物Hg-actin F
<400> 13
gcgtggttactccttcgtg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Hg-actin R
<400> 14
cgggcagttcgtagctcttc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物GFP F
<400> 15
cagtgcttcagccgctaccc 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物GFP R
<400> 16
agttcaccttgatgccgttctt 22

Claims (6)

1.大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。
2.权利要求1所述的大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因的dsRNA序列，其特征在于所述dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述的大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因的dsRNA在线虫防治中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于dsRNA虫防治线虫的具体方法为：将大豆孢囊线虫Hg-flp-22基因的dsRNA片段摄取到大豆孢囊线虫体内，抑制大豆孢囊线虫的侵染，从而减轻大豆孢囊线虫对寄主的寄生。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述摄取方法为将大豆孢囊线虫浸泡在含有dsRNA的处理液中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述处理液中dsRNA的浓度为2mg/mL。
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