CN108642063A

CN108642063A - 剑麻pgip基因及其应用

Info

Publication number: CN108642063A
Application number: CN201810480427.4A
Authority: CN
Inventors: 张燕梅; 周文剑; 王瑞芳; 杨子平; 鹿志伟; 李俊峰; 陆军迎
Original assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Current assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2038-05-18
Also published as: CN108642063B

Abstract

本发明采用PCR的方法，克隆了2个剑麻PGIP基因，AhPGIP1和AhPGIP2；AhPGIP1全长为1008bp，蛋白分子量约为36.7kD，等电点为8.65；AhPGIP2全长为981bp；通过瞬时表达初步证实PGIP基因可提高剑麻和烟草对烟草疫霉的抗性，既为剑麻遗传改良提供了基因资源和理论依据，又为其它作物抗病相关遗传改良提供了基因资源和理论依据。

Description

剑麻PGIP基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于现有的核酸序列，克隆剑麻PGIP基因，并分别利用实时荧光定量RT-PCR和瞬时表达方法对PGIP基因在不同逆境胁迫下的表达和功能进行研究，属于植物分子生物学技术领域。

背景技术

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIPs）是一类与植物自身免疫相关的多功能蛋白，含有10 个不完整的 e LRR，每一个 e LRR 由 24 个残基组成，且氨基酸序列通常为 LxxLxx Lx Lxx Nx Lt/sgx。其作用机制是通过抑制病原真菌PGs 活性，减少PGs对植物细胞壁的伤害，同时通过PGs和PGIPs的相互作用促进寡聚半乳糖醛酸苷的形成，激发一系列的防御反应，从而提高植物对病原菌的抗性，在植物防卫反应中扮演着重要角色。截止2015年，在NCBI数据库已经公布了170多个PGIP基因的全长或部分序列，前人研究表明超表达自身或外源PGIP基因，可提高植物对病原物的抗性，并且在番茄、马铃薯、水稻、小麦、拟南芥、葡萄、苹果、油菜、菜心、烟草、豌豆以及苹果等植物中都有报导，而沉默PGIP基因则增加植物对病原菌的敏感性。因此，该基因在植物抗病相关遗传改良中有十分重要的作用。

剑麻是我国热区特有的经济作物之一，剑麻不仅是主要的热带纤维原料，剑麻茎心是酿造龙舌兰酒的主要原料，剑麻麻渣含有较高皂素，可用来制药，剑麻也是一种重要的生物质能源，并且近年来，剑麻作为景天庚代谢的模式植物，有非常重要的理论和经济价值。斑马纹病是剑麻的主要病害之一，由于斑马纹病的发生导致剑麻产业严重受损，尽管生产上形成了一套预防斑马纹病的防治方面，但目前关于斑马纹病的致病机理和抗病机制仍不清楚，而且生产上短期内也没有抗斑马纹病的新品种可替代。因此，通过基因工程手段对现有品种遗传改良成了首选方法之一。本实验室前期工作中，对不同发病时期的斑马纹病易感和高抗品种进行转录组测序和表达谱分析，发现PGIP基因受烟草疫霉诱导表达显著上调，且在抗/感品种间表达差异显著，暗示PGIP在剑麻抗斑马纹病中发挥重要作用，因此克隆剑麻PGIP基因并在剑麻和烟草中瞬时表达，既为利用基因工程技术开展剑麻及其它作物抗病相关遗传改良提供基因资源，又为剑麻遗传改良提供了理论和现实依据。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供2个剑麻PGIP基因及其序列，并同时提供2个剑麻PGIP基因特异性扩增引物，荧光定量PCR引物和内参基因GAPDH的特异性引物，建立基于SYBR Green荧光染料技术的qRT-PCR方法，构建瞬时表达载体，一方面为利用基因工程技术开展剑麻及其它作物抗病相关遗传改良提供基因资源，另一方面为剑麻烟草疫霉侵染、低温胁迫、盐胁迫、伤处理、水杨酸和茉莉酸甲酯等逆境条件下基因表达分析提供稳定可靠的内参基因和技术方法。

为实现上述目的，本方法采用的技术方案是：

剑麻PGIP基因及其应用，包括如下内容：

1. 植物材料：用于伤处理和烟草疫霉接种（烟草疫霉胁迫和瞬时表达）的为2年生的H.11648盆栽苗，用于低温、盐（NaCl）胁迫、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理的为8-10cm的H.11648组培苗。用于瞬时表达的烟草为2-3月生的本氏烟实生苗。

2. 处理条件：低温处理温度为4℃，盐胁迫的NaCl浓度为200mM，水杨酸(SA)的处理浓度为10mM，茉莉酸甲酯(MeJA)的处理浓度为1mM。烟草疫霉接种后的取样时间分别0h，24h, 36h, 48h和72h；低温，伤，盐、SA和MeJA处理后的取样时间分别为0h, 3h, 6h, 12h和24h。

3.基因种类：所述AhPGIP1基因序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。AhPGIP2基因序列为SEQ ID No.3；氨基酸序列为SEQ ID No.4。AhPGIP1基因特异性PCR扩增引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。AhPGIP2基因特异性PCR扩增引物为SEQ ID No.7和SEQID No.8；AhPGIP1基因荧光定量PCR扩增引物为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。AhPGIP2基因荧光定量PCR扩增引物为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。AhPGIP1带酶切位点的扩增引物为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14。AhPGIP2带酶切位点的扩增引物为SEQ ID No.15和SEQ IDNo.16。内参基因GAPDH荧光定量PCR引物为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了2个剑麻PGIP基因及其序列，PGIP特异性扩增引物序列和定量PCR引物序列，内参基因GAPDH引物序列。烟草和剑麻分别瞬时表达AhPGIP1和AhPGIP2基因均可提高烟草和剑麻对烟草疫霉的抗性。因此该基因可以作为抗病相关候选基因，用于作物抗病相关遗传改良。

附图说明

图1瞬时表达PEGAD载体图谱；

图2 剑麻PGIP基因在烟草疫霉侵染、盐胁迫、低温、伤、SA和MeJA处理后不同时间的基因表达情况分析图；

图3 烟草瞬时表达AhPGIP1和AhPGIP2后接种烟草疫霉48h后的发病情况；

图4 剑麻瞬时表达AhPGIP1和AhPGIP2后接种烟草疫霉48h后的发病情况。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。未加特殊说明，所有试剂盒操作均按试剂盒说明书进行，所有的试剂均为生物试剂。实验材料和研究方法前后一致。

实施例1

本发明所提供的2个剑麻PGIP基因，均从剑麻H.11648中得到，其中AhPGIP1基因核酸序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。AhPGIP2基因核酸序列为SEQ ID No.3，氨基酸序列为SEQ ID No.4。AhPGIP1基因特异性PCR扩增引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。AhPGIP2基因特异性PCR扩增引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8。AhPGIP1基因荧光定量PCR扩增引物为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；AhPGIP2基因荧光定量PCR扩增引物为SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12；AhPGIP1带酶切位点的扩增引物为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14。AhPGIP2带酶切位点的扩增引物为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。内参基因GAPDH荧光定量PCR引物为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18。

1．材料处理

烟草疫霉侵染：取保存于本实验室的烟草疫霉接种于马铃薯培养基（PDA）上，28℃培养1周后，接种H.11648叶片，用灭菌的大头针将叶片正面刺伤，取直径为5mm的菌饼，将菌饼的菌丝生长面贴在伤口的位置，用无菌湿棉花保湿，然后用保鲜膜包裹叶片，置于25-30℃条件下培养，并分别在接种前（0h）、接种24h、36h、48h和72h取叶片，液氮速冻后保存于-80℃备用。用于瞬时表达的H.11648在接种烟草疫霉48h后测量病斑大小，并拍照保存。

盐胁迫（NaCl）处理：取8-10cm的剑麻组培苗，用移液枪在培养基中加入1mLNaCl溶液，盖上盖子，静置放于桌面上。每瓶苗当做一个处理，每个处理重复三次。分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取组培苗叶片，液氮速冻后-80℃保存备用。

伤处理：取2年生的剑麻盆栽苗，选取健康的叶片擦净消毒后，用消毒的大头针将叶片表面划伤但不能穿破背面。每株当做一个处理，每个处理重复三次。分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取伤处理叶片，液氮速冻后-80℃保存备用。

低温处理：取8-10cm的剑麻组培苗，连瓶和培养基一起放于4℃冰箱中。每瓶苗当做一个处理，每个处理重复三次。分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取组培苗叶片，液氮速冻后-80℃保存备用。

SA处理：取8-10cm的剑麻组培苗，用移液枪在培养基中加入1mLSA溶液，盖上盖子，静置放于桌面上。每瓶苗当做一个处理，每个处理重复三次。分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取组培苗叶片，液氮速冻后-80℃保存备用。

MeJA处理: 取8-10cm的剑麻组培苗，用移液枪在培养基中加入1mLMeJA溶液，盖上盖子，静置放于桌面上。每瓶苗当做一个处理，每个处理重复三次。分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取组培苗叶片，液氮速冻后-80℃保存备用。

2．剑麻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因（PGIP）的克隆

上述AhPGIP1和AhPGIP2基因克隆包括如下步骤：

（1）RNA提取和cDNA合成

采用华越洋生物有限公司的超快型植物RNA提取试剂盒提取总RNA，具体操作按说明书进行。取2 μL 总RNA在含有Goldenview的1.5 %琼脂糖凝胶中电泳10分钟，并拍照保存。其余的RNA -80℃保存备用。取4μL 总RNA用酶联免疫分析仪对RNA质量和浓度进行检测。琼脂糖凝胶电泳带型整齐，无扩散，且酶联免疫分析仪检测后OD260/230大于2.0、OD260/280大于1.8的RNA样品将用于cDNA第一链的合成。

（2）克隆AhPGIP1和AhPGIP2基因

具体步骤如下：

①取0.5μg总RNA合成第一链cDNA。cDNA第一链的合成采用北京全式金生物技术有限公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒进行。使用前除酶以外的试剂均置于4℃冰箱中解冻。具体操作按说明书进行。合成的cDNA按1:5比例稀释后-20℃保存备用。

②根据转录组测序获得的核酸序列，采用引物设计软件Primer Premier3.0设计剑麻PGIP基因特异性PCR扩增引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。20µLPCR反应体系中各组份的浓度及使用量：2×NOVA Taq-Plus PCR Forest Mix(江苏愚公生命科技有限公司):10µL；引物(10μmol/L) F:0.2 µL，R:0.2µL；cDNA: 2µL；灭菌ddH2O :7.6µL。

③PCR扩增程序：先95℃(5min), 然后进入35个循环（95℃（30s）,58℃（1min）, 72℃（30s）），最后72℃（10min），扩增产物4℃保存备用。

AhPGIP1正向引物：5’- ATGGAGAGAATGACTCCCCCAGT-3’ （SEQ ID No.5），AhPGIP1反向引物：5’- TGGAAGATCGAGGAACACAGACCG-3’（SEQ ID No.6）；AhPGIP2正向引物：5’-ATGTTCACTCTCCTCTGTTTTC-3’ （SEQ ID No.7），

AhPGIP2反向引物：5’- TCAAACCGATCGGCCGTAATCCT-3’（SEQ ID No.8）。

④取2µL PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，Goldview染色后用凝胶成像系统拍照保存。剩余18μL采用宝生物公司的凝胶回收试剂盒回收，取2 μL回收产物16℃与pMD19-T载体连接2~4 h，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用蓝白斑筛选阳性转化子，经PCR检测后送华大基因测序，测序结果经NCBI进行比对分析后确定PGIP基因全长序列。

⑤运用ExPASy软件对AhPGIP1蛋白氨基酸序列进行分析，该蛋白的理论分子量约为36.7kD，等电点为8.65；对AhPGIP2蛋白氨基酸序列进行分析，该蛋白的理论分子量约为35.8kD，等电点为8.98。AhPGIP1核酸和氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；AhPGIP2核酸和氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

3．剑麻PGIP基因表达分析

（1）RNA提取和cDNA合成

分别取烟草疫霉接种、盐胁迫处理、低温处理、伤处理、SA处理和MeJA处理不同时间的剑麻叶片1g，用于提取总RNA。总RAN提取、RNA质量检测和第一链cDNA合成方法均同剑麻PGIP基因克隆。

（2）剑麻PGIP基因不同逆境胁迫下基因表达分析

采用荧光定量RT-PCR的方法，以剑麻GAPDH基因为内参基因，分析剑麻PGIP基因在烟草疫霉侵染、盐胁迫处理、低温处理、伤处理、SA处理和MeJA处理不同时间基因诱导表达情况，荧光定量RT-PCR引物序列为SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12。

荧光定量PCR扩增采用北京全式金生物技术有限公司的TransStart® Top GreenqPCR SuperMix试剂盒，具体操作按说明书进行，定量PCR仪为Light Cycler 480IISystem。所有操作均在冰上进行。

荧光定量PCR扩增反应体系中各组份的浓度及使用量：2×TransStart® TopGreen qPCR SuperMix：10µL; cDNA: 2µL; 引物(10μmol/L) F:0.4 µL，R:0.4µL；灭菌ddH2O :7.2µL。

荧光定量PCR扩增程序：先预变性95℃(1min), 然后进入45个循环（95℃（10s）,62℃（30s）, 72℃（30s））。每个样品设置三次重复，反应结束后进行溶解曲线分析。荧光定量PCR扩增后，仪器会自动得出各样品Ct值，然后参照Livak, K.J. 和Schmittgen 等的2^–ΔΔCT方法计算基因在不同胁迫处理后不同时间的相对表达量。分析结果显示AhPGIP1基因受烟草疫霉诱导表达上调，接种48h表达量最高、受盐（NaCl）胁迫诱导表达上调，NaCl处理3h后表达量最高、SA和MeJA处理后诱导表达上调，且处理3h后表达量最高，伤处理后诱导表达上调且处理12h后表达量最高，低温处理后AhPGIP1表达量不变。AhPGIP2受烟草疫霉诱导表达上调且接种36h后表达量最高，受低温和盐诱导表达上调，且处理3h和24h表达量均比其它时间点的高，伤和MeJA处理后仅在12h诱导表达上调，SA处理后诱导表达上调且处理3h后表达量最高（图1）。

4. 剑麻PGIP功能分析

（1）表达载体构建

根据植物表达载体PEGAD和目的基因AhPGIP1和AhPGIP2的序列特征，分别在AhPGIP1和 AhPGIP2两端添加EcoRI和BamHI酶切位点，并设计带酶切位点的引物（SEQ ID NO.13-SEQID NO.16），通过PCR扩增目的基因AhPGIP1和AhPGIP2并测序验证，然后通过定向酶切和与载体PEGAD连接，并采用液氮速冻法转化农杆菌EHA105，构建含有目的基因AhPGIP1和AhPGIP2的植物表达载体。表达载体图谱见附图2。同时将含有目的基因的EHA105菌株接到含有利福平（50mg/L）和卡那霉素（100mg/L）的LB固体培养基上培养。

（2）AhPGIP1和AhPGIP2基因在烟草和剑麻中的瞬时表达

挑取EHA105单菌落，将其转接到含有卡那霉素（100mg/L）的LB液体培养基中培养过夜，待菌液OD₆₀₀在0.6-1.0之间时，室温5000rpm离心10min，收集菌体，用MMA（10mM 乙磺酸，pH5.6；10mM 氯化镁, 200μM乙酰丁香酮）溶液重悬菌体,调整OD₆₀₀为0.8，室温静置2-3h后注射剑麻和烟草叶片。将重悬液装入1mL注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草和剑麻叶片内，同时将MMA注射到烟草和剑麻叶片当作对照，注射后剑麻和烟草叶片会出现湿润现象。

（3）瞬时表达后的烟草和剑麻对烟草疫霉的抗性检测

注射48h后，分别对剑麻和烟草叶片接种烟草疫霉，其中剑麻采用叶面针刺法活体接种法，烟草叶片采用离体接种法，直接接种烟草疫霉，接种48h后观察病斑扩展情况，并测量病斑大小，并测量病斑大小，同时烟草叶片用台盼蓝染色过夜，无菌水冲洗后用无水乙醇煮沸脱色30min，最后拍照并测量病斑大小，发现瞬时表达AhPGIP1和AhPGIP2的剑麻和烟草叶片病斑明显比非对照植株小（图3-4）。以上结果表明瞬时表达AhPGIP1和AhPGIP2可提高剑麻和烟草对烟草疫霉的抗性。因此AhPGIP1和AhPGIP2可以作为抗病相关候选基因用于剑麻和其它植物抗病相关遗传改良。

序列表

<110> 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所

<120> 剑麻PGIP基因及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1008

<212> DNA

<213> 剑麻(Agave hybrid No.11648)

<400> 1

atggagagaa tgactccccc agtccttact gtcaccggcc tgatcttctt tctgctcttc 60

tgctgctcct cagcttgtca tgttcacgac aggagagccc ttctcgcctt caataacacc 120

ctcgcacctg gctctttccc cagctcatgg acgaccgagg ccgactgctg cttctggcag 180

ttcgtccgct gcagcaaacg caacggccgc gtccgggtcg tcagcttcta caagagcaac 240

aacgtcagcg gaaccatccc gccatccgtc ggcgacctcc ctttcctcga gatcctcacc 300

ttctcgcgcc tcccaaacct ggtgggcccc atccctcccc agatctccaa cctcaagacc 360

ctgcagtaca tcaacatcga ccagactgga gtctctggct ccatccctcc ctccctctcc 420

aagctgactc agctccgagt gctgagtctc accaacaacc acctcaccgg accaatccct 480

gcgtccctcg gcgaccttac ccatctcttt cacatctacc tctatggcaa caagctcaca 540

gggaccatcc ccggcactct cttctccaaa tattccttta ccttcaccaa tctcaacctc 600

ctcctaaacg acaacatgct gacaggggcc attcccccgg cgttcgacaa ggtgaagttc 660

ctgatcatcg acttttccaa caacagtctc aacggcgatt tcgcccgggt tctgttcggc 720

aagtcgaaga ccgtgataca gataagtttg gccaacaatc agatgtcctt caatctgtcg 780

acggtggagt accctgcgaa tctagagtct ctggacatca gccacaataa gatttatggc 840

agcatatcgg atcagatcac aactctgact ggtcttggtt tgttggatgt gagctacaac 900

gagctgtgcg gcaagatccc gagcgggggc aacttcagag agttcggtgc tgagaccttt 960

caacacaaca agtgcctttg tgggacgcca ttacccccgt gcaagtga 1008

<210> 2

<211> 335

<212> PRT

<213> 剑麻(Agave hybrid No.11648)

<400> 2

Met Glu Arg Met Thr Pro Pro Val Leu Thr Val Thr Gly Leu Ile Phe

1 5 10 15

Phe Leu Leu Phe Cys Cys Ser Ser Ala Cys His Val His Asp Arg Arg

20 25 30

Ala Leu Leu Ala Phe Asn Asn Thr Leu Ala Pro Gly Ser Phe Pro Ser

35 40 45

Ser Trp Thr Thr Glu Ala Asp Cys Cys Phe Trp Gln Phe Val Arg Cys

50 55 60

Ser Lys Arg Asn Gly Arg Val Arg Val Val Ser Phe Tyr Lys Ser Asn

65 70 75 80

Asn Val Ser Gly Thr Ile Pro Pro Ser Val Gly Asp Leu Pro Phe Leu

85 90 95

Glu Ile Leu Thr Phe Ser Arg Leu Pro Asn Leu Val Gly Pro Ile Pro

100 105 110

Pro Gln Ile Ser Asn Leu Lys Thr Leu Gln Tyr Ile Asn Ile Asp Gln

115 120 125

Thr Gly Val Ser Gly Ser Ile Pro Pro Ser Leu Ser Lys Leu Thr Gln

130 135 140

Leu Arg Val Leu Ser Leu Thr Asn Asn His Leu Thr Gly Pro Ile Pro

145 150 155 160

Ala Ser Leu Gly Asp Leu Thr His Leu Phe His Ile Tyr Leu Tyr Gly

165 170 175

Asn Lys Leu Thr Gly Thr Ile Pro Gly Thr Leu Phe Ser Lys Tyr Ser

180 185 190

Phe Thr Phe Thr Asn Leu Asn Leu Leu Leu Asn Asp Asn Met Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Ile Pro Pro Ala Phe Asp Lys Val Lys Phe Leu Ile Ile Asp

210 215 220

Phe Ser Asn Asn Ser Leu Asn Gly Asp Phe Ala Arg Val Leu Phe Gly

225 230 235 240

Lys Ser Lys Thr Val Ile Gln Ile Ser Leu Ala Asn Asn Gln Met Ser

245 250 255

Phe Asn Leu Ser Thr Val Glu Tyr Pro Ala Asn Leu Glu Ser Leu Asp

260 265 270

Ile Ser His Asn Lys Ile Tyr Gly Ser Ile Ser Asp Gln Ile Thr Thr

275 280 285

Leu Thr Gly Leu Gly Leu Leu Asp Val Ser Tyr Asn Glu Leu Cys Gly

290 295 300

Lys Ile Pro Ser Gly Gly Asn Phe Arg Glu Phe Gly Ala Glu Thr Phe

305 310 315 320

Gln His Asn Lys Cys Leu Cys Gly Thr Pro Leu Pro Pro Cys Lys

325 330 335

<210> 3

<211> 981

<212> DNA

<213> 剑麻(Agave hybrid No.11648)

<400> 3

atgttcactc tcctctgttt tctcttgttt cttctttctt catcagaatt gttccaacgt 60

ctagccttgg cctcctccaa tgagttcaag tattgctcca agcaacaagc agcagcgctt 120

ctcaatctaa ggcaatccct cggcaatcct ccctctttga gctcgtggaa tccatccgcc 180

gactgctgct cgtggccggg cgtccgctgc gactacaatc gccgcaccgt caccgagctc 240

tcactcgact ccgacgccaa cctcatcggc aaaatcccac cgtccatcgc caaactcaca 300

aacctcacct ctctccgcat tttcgccaat ccccagctct caggcaccat accaaaatcc 360

ttatgcaggc taacaaaact ggtcgtgctc gatctctccg ctaacaatct caccggtcca 420

atcccgggct gcttcggcac aaagctatct cgcatcgatt tgagccggaa ccggctctca 480

ggactgattc cggccaattt catgcgtgga gtaaaactta gtacttctct ttcctcttcc 540

cccaattggc tcctcctgaa tcaaaaccag ctcgctggcc cgatccctcg atctctcggg 600

gacgttccgc tcaacaaaat caacctctcg cagaatcggc tcgccggaga cgcctcgttc 660

ctgttcggcg aggagaagag ttatctggaa gtgttagatc tgtctggaaa tgagttggaa 720

tttgatgtga gcaacgtgaa ggtcccatgg aggctgcggg tgctcgactt gagccgtaac 780

aagatacatg ggagcatttc agagcaagtg tcaaggcttg tgctgttgat gtctttcaat 840

gtcagctaca ataatttgtg tggattgata accgccgtgg gatttatgag caagttcgat 900

gagtcttcgt ttgagcataa caagtgttta tgtggaggac cgccgcggcc gtgctccgag 960

gattacggcc gatcggtttg a 981

<210> 4

<211> 326

<212> PRT

<213> 剑麻(Agave hybrid No.11648)

<400> 4

Met Phe Thr Leu Leu Cys Phe Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ser Ser Glu

1 5 10 15

Leu Phe Gln Arg Leu Ala Leu Ala Ser Ser Asn Glu Phe Lys Tyr Cys

20 25 30

Ser Lys Gln Gln Ala Ala Ala Leu Leu Asn Leu Arg Gln Ser Leu Gly

35 40 45

Asn Pro Pro Ser Leu Ser Ser Trp Asn Pro Ser Ala Asp Cys Cys Ser

50 55 60

Trp Pro Gly Val Arg Cys Asp Tyr Asn Arg Arg Thr Val Thr Glu Leu

65 70 75 80

Ser Leu Asp Ser Asp Ala Asn Leu Ile Gly Lys Ile Pro Pro Ser Ile

85 90 95

Ala Lys Leu Thr Asn Leu Thr Ser Leu Arg Ile Phe Ala Asn Pro Gln

100 105 110

Leu Ser Gly Thr Ile Pro Lys Ser Leu Cys Arg Leu Thr Lys Leu Val

115 120 125

Val Leu Asp Leu Ser Ala Asn Asn Leu Thr Gly Pro Ile Pro Gly Cys

130 135 140

Phe Gly Thr Lys Leu Ser Arg Ile Asp Leu Ser Arg Asn Arg Leu Ser

145 150 155 160

Gly Leu Ile Pro Ala Asn Phe Met Arg Gly Val Lys Leu Ser Thr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Ser Pro Asn Trp Leu Leu Leu Asn Gln Asn Gln Leu Ala

180 185 190

Gly Pro Ile Pro Arg Ser Leu Gly Asp Val Pro Leu Asn Lys Ile Asn

195 200 205

Leu Ser Gln Asn Arg Leu Ala Gly Asp Ala Ser Phe Leu Phe Gly Glu

210 215 220

Glu Lys Ser Tyr Leu Glu Val Leu Asp Leu Ser Gly Asn Glu Leu Glu

225 230 235 240

Phe Asp Val Ser Asn Val Lys Val Pro Trp Arg Leu Arg Val Leu Asp

245 250 255

Leu Ser Arg Asn Lys Ile His Gly Ser Ile Ser Glu Gln Val Ser Arg

260 265 270

Leu Val Leu Leu Met Ser Phe Asn Val Ser Tyr Asn Asn Leu Cys Gly

275 280 285

Leu Ile Thr Ala Val Gly Phe Met Ser Lys Phe Asp Glu Ser Ser Phe

290 295 300

Glu His Asn Lys Cys Leu Cys Gly Gly Pro Pro Arg Pro Cys Ser Glu

305 310 315 320

Asp Tyr Gly Arg Ser Val

325

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggagagaa tgactccccc agt 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggaagatcg aggaacacag accg 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgttcactc tcctctgttt tc 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcaaaccgat cggccgtaat cct 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tctctggaca tcagccacaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtctcagca ccgaactctc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtcaaggctt gtgctgttga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcggtcctcc acataaacac 20

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acagaattca tggagagaat gactccccca 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtggatccc ttgcacggcg gcaatggcgt 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acagaattca tgttcactct cctctgtttt 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgtggatcca accgatcggc cgtaatcctc 30

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gacaccggta gactccacaa 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aagacccttc tctttggcga 20

Claims

1.一种剑麻PGIP基因及其应用，其特征在于：提供2个剑麻PGIP基因及其序列，并同时提供2个剑麻PGIP基因特异性扩增引物，荧光定量PCR引物和内参基因GAPDH的特异性引物，建立基于SYBR Green荧光染料技术的qRT-PCR方法，构建瞬时表达载体；PGIP特异性扩增引物序列和定量PCR引物序列，内参基因GAPDH引物序列；烟草和剑麻分别瞬时表达AhPGIP1和AhPGIP2基因。

2.根据权利要求1所述的一种剑麻PGIP基因及其应用，其特征在于：其植物材料：用于伤处理和烟草疫霉接种（烟草疫霉胁迫和瞬时表达）的为2年生的H.11648盆栽苗，用于低温、盐（NaCl）胁迫、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理的为8-10cm的H.11648组培苗；用于瞬时表达的烟草为2-3月生的本氏烟实生苗。

3.根据权利要求1所述的一种剑麻PGIP基因及其应用，其特征在于：其处理条件：低温处理温度为4℃，盐胁迫的NaCl浓度为200mM，水杨酸(SA)的处理浓度为10mM，茉莉酸甲酯(MeJA)的处理浓度为1mM；烟草疫霉接种后的取样时间分别0h，24h, 36h, 48h和72h；低温，伤，盐、SA和MeJA处理后的取样时间分别为0h, 3h, 6h, 12h和24h。

4.根据权利要求1所述的一种剑麻PGIP基因及其应用，

所述AhPGIP1基因序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2；

所述AhPGIP2基因序列为SEQ ID No.3，氨基酸序列为SEQ ID No.4；

所述AhPGIP1基因特异性PCR扩增引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；

所述AhPGIP2基因特异性PCR扩增引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；

所述AhPGIP1基因荧光定量PCR扩增引物为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；

所述AhPGIP2基因荧光定量PCR扩增引物为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12；

所述AhPGIP1带酶切位点的扩增引物为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14；

所述AhPGIP2带酶切位点的扩增引物为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；

所述内参基因GAPDH荧光定量PCR引物为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18。

5.根据权利要求1所述的一种剑麻PGIP基因及其应用，其特征在于：包括以下步骤：

（1）材料处理

烟草疫霉侵染：取保存于本实验室的烟草疫霉接种于马铃薯培养基（PDA）上，28℃培养1周后，接种H.11648叶片，用灭菌的大头针将叶片正面刺伤，取直径为5mm的菌饼，将菌饼的菌丝生长面贴在伤口的位置，用无菌湿棉花保湿，然后用保鲜膜包裹叶片，置于25-30℃条件下培养，并分别在接种前（0h）、接种24h、36h、48h和72h取叶片，液氮速冻后保存于-80℃备用；用于瞬时表达的H.11648在接种烟草疫霉48h后测量病斑大小，并拍照保存；

盐胁迫（NaCl）处理：取8-10cm的剑麻组培苗，用移液枪在培养基中加入1mLNaCl溶液，盖上盖子，静置放于桌面上；每瓶苗当做一个处理，每个处理重复三次；分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取组培苗叶片，液氮速冻后-80℃保存备用；

伤处理：取2年生的剑麻盆栽苗，选取健康的叶片擦净消毒后，用消毒的大头针将叶片表面划伤但不能穿破背面；每株当做一个处理，每个处理重复三次；分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取伤处理叶片，液氮速冻后-80℃保存备用；

低温处理：取8-10cm的剑麻组培苗，连瓶和培养基一起放于4℃冰箱中；每瓶苗当做一个处理，每个处理重复三次；分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取组培苗叶片，液氮速冻后-80℃保存备用；

SA处理：取8-10cm的剑麻组培苗，用移液枪在培养基中加入1mLSA溶液，盖上盖子，静置放于桌面上；每瓶苗当做一个处理，每个处理重复三次；分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取组培苗叶片，液氮速冻后-80℃保存备用；

MeJA处理: 取8-10cm的剑麻组培苗，用移液枪在培养基中加入1mLMeJA溶液，盖上盖子，静置放于桌面上；每瓶苗当做一个处理，每个处理重复三次；分别在处理前（0h）、处理3h、6h、12h和24h取组培苗叶片，液氮速冻后-80℃保存备用；

（2）剑麻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因（PGIP）的克隆

上述AhPGIP1和AhPGIP2基因克隆包括如下步骤：

①RNA提取和cDNA合成

采用华越洋生物有限公司的超快型植物RNA提取试剂盒提取总RNA，具体操作按说明书进行；取2 μL 总RNA在含有Goldenview的1.5 %琼脂糖凝胶中电泳10分钟，并拍照保存；其余的RNA -80℃保存备用；取4μL 总RNA用酶联免疫分析仪对RNA质量和浓度进行检测；琼脂糖凝胶电泳带型整齐，无扩散，且酶联免疫分析仪检测后OD260/230大于2.0、OD260/280大于1.8的RNA样品将用于cDNA第一链的合成；

②克隆AhPGIP1和AhPGIP2基因

具体步骤如下：

取0.5μg总RNA合成第一链cDNA；cDNA第一链的合成采用北京全式金生物技术有限公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒进行；使用前除酶以外的试剂均置于4℃冰箱中解冻；具体操作按说明书进行；合成的cDNA按1:5比例稀释后-20℃保存备用；

根据转录组测序获得的核酸序列，采用引物设计软件Primer Premier3.0设计剑麻PGIP基因特异性PCR扩增引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成；20µLPCR反应体系中各组份的浓度及使用量：2×NOVA Taq-Plus PCR Forest Mix(江苏愚公生命科技有限公司):10µL；引物(10μmol/L) F:0.2 µL，R:0.2µL；cDNA: 2µL；灭菌ddH2O :7.6µL；

PCR扩增程序：先95℃(5min), 然后进入35个循环（95℃（30s）,58℃（1min）, 72℃（30s）），最后72℃（10min），扩增产物4℃保存备用；

AhPGIP1正向引物：5’- ATGGAGAGAATGACTCCCCCAGT-3’ （SEQ ID No.5），AhPGIP1反向引物：5’- TGGAAGATCGAGGAACACAGACCG-3’（SEQ ID No.6）；

AhPGIP2正向引物：5’- ATGTTCACTCTCCTCTGTTTTC-3’ （SEQ ID No.7），

AhPGIP2反向引物：5’- TCAAACCGATCGGCCGTAATCCT-3’（SEQ ID No.8）；

取2µL PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，Goldview染色后用凝胶成像系统拍照保存；剩余18μL采用宝生物公司的凝胶回收试剂盒回收，取2 μL回收产物16℃与pMD19-T载体连接2~4 h，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用蓝白斑筛选阳性转化子，经PCR检测后送华大基因测序，测序结果经NCBI进行比对分析后确定PGIP基因全长序列；

运用ExPASy软件对AhPGIP1蛋白氨基酸序列进行分析，该蛋白的理论分子量约为36.7kD，等电点为8.65；对AhPGIP2蛋白氨基酸序列进行分析，该蛋白的理论分子量约为35.8kD，等电点为8.98；AhPGIP1核酸和氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；AhPGIP2核酸和氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

（3）剑麻PGIP基因表达分析

①RNA提取和cDNA合成

分别取烟草疫霉接种、盐胁迫处理、低温处理、伤处理、SA处理和MeJA处理不同时间的剑麻叶片1g，用于提取总RNA；总RAN提取、RNA质量检测和第一链cDNA合成方法均同剑麻PGIP基因克隆；

②剑麻PGIP基因不同逆境胁迫下基因表达分析

采用荧光定量RT-PCR的方法，以剑麻GAPDH基因为内参基因，分析剑麻PGIP基因在烟草疫霉侵染、盐胁迫处理、低温处理、伤处理、SA处理和MeJA处理不同时间基因诱导表达情况，荧光定量RT-PCR引物序列为SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12；

荧光定量PCR扩增采用北京全式金生物技术有限公司的TransStart® Top GreenqPCR SuperMix试剂盒，具体操作按说明书进行，定量PCR仪为Light Cycler 480IISystem；所有操作均在冰上进行；

荧光定量PCR扩增反应体系中各组份的浓度及使用量：2×TransStart® Top GreenqPCR SuperMix：10µL; cDNA: 2µL; 引物(10μmol/L) F:0.4 µL，R:0.4µL；灭菌ddH2O :7.2µL；

荧光定量PCR扩增程序：先预变性95℃(1min), 然后进入45个循环（95℃（10s）,62℃（30s）, 72℃（30s））；每个样品设置三次重复，反应结束后进行溶解曲线分析；荧光定量PCR扩增后，仪器会自动得出各样品Ct值，然后参照Livak, K.J. 和Schmittgen 等的2^–ΔΔCT方法计算基因在不同胁迫处理后不同时间的相对表达量；分析结果显示AhPGIP1基因受烟草疫霉诱导表达上调，接种48h表达量最高、受盐（NaCl）胁迫诱导表达上调，NaCl处理3h后表达量最高、SA和MeJA处理后诱导表达上调，且处理3h后表达量最高，伤处理后诱导表达上调且处理12h后表达量最高，低温处理后AhPGIP1表达量不变；AhPGIP2受烟草疫霉诱导表达上调且接种36h后表达量最高，受低温和盐诱导表达上调，且处理3h和24h表达量均比其它时间点的高，伤和MeJA处理后仅在12h诱导表达上调，SA处理后诱导表达上调且处理3h后表达量最高（图1）；

（4）剑麻PGIP功能分析

①表达载体构建：

根据植物表达载体PEGAD和目的基因AhPGIP1和AhPGIP2的序列特征，分别在AhPGIP1和 AhPGIP2两端添加EcoRI和BamHI酶切位点，并设计带酶切位点的引物（SEQ ID NO.13-SEQID NO.16），通过PCR扩增目的基因AhPGIP1和AhPGIP2并测序验证，然后通过定向酶切和与载体PEGAD连接，并采用液氮速冻法转化农杆菌EHA105，构建含有目的基因AhPGIP1和AhPGIP2的植物表达载体；表达载体图谱见附图2；同时将含有目的基因的EHA105菌株接到含有利福平（50mg/L）和卡那霉素（100mg/L）的LB固体培养基上培养；

②AhPGIP1和AhPGIP2基因在烟草和剑麻中的瞬时表达：

挑取EHA105单菌落，将其转接到含有卡那霉素（100mg/L）的LB液体培养基中培养过夜，待菌液OD₆₀₀在0.6-1.0之间时，室温5000rpm离心10min，收集菌体，用MMA（10mM 乙磺酸，pH5.6；10mM 氯化镁, 200μM乙酰丁香酮）溶液重悬菌体,调整OD₆₀₀为0.8，室温静置2-3h后注射剑麻和烟草叶片；将重悬液装入1mL注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草和剑麻叶片内，同时将MMA注射到烟草和剑麻叶片当作对照，注射后剑麻和烟草叶片会出现湿润现象；

③瞬时表达后的烟草和剑麻对烟草疫霉的抗性检测

注射48h后，分别对剑麻和烟草叶片接种烟草疫霉，其中剑麻采用叶面针刺法活体接种法，烟草叶片采用离体接种法，直接接种烟草疫霉，接种48h后观察病斑扩展情况，并测量病斑大小，同时烟草叶片用台盼蓝染色过夜，无菌水冲洗后用无水乙醇煮沸脱色30min，最后拍照并测量病斑大小，发现瞬时表达AhPGIP1和AhPGIP2的剑麻和烟草叶片病斑明显比对照植株小（图3-4）；以上结果表明瞬时表达AhPGIP1和AhPGIP2可提高剑麻和烟草对烟草疫霉的抗性；因此AhPGIP1和AhPGIP2可以作为抗病相关候选基因用于剑麻和其它植物抗病相关遗传改良。