CN102154338B

CN102154338B - 一种可提高转基因作物细菌抗性的基因GhMKK5及其应用

Info

Publication number: CN102154338B
Application number: CN2010105908433A
Authority: CN
Inventors: 郭兴启; 孟飞; 张良; 李玉真; 吴长艾
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2010-12-07
Filing date: 2010-12-07
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-12-07
Also published as: CN102154338A

Abstract

本发明涉及一种可提高转基因作物细菌抗性的基因GhMKK5及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明采用同源克隆和RACE技术获得一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMKK5，将该基因的cDNA序列置于CaMV 35S启动子下，构建植物表达载体，转化本生烟，使该基因在烟草中过量表达。实验证实，转基因烟草具有明显的抵抗细菌病害的能力。将该基因用于转化小麦、棉花等农作物，可提高增强其抗细菌能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。

Description

一种可提高转基因作物细菌抗性的基因GhMKK5及其应用

一、技术领域

本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶激酶基因GhMKK5的克隆、重组及在提高转基因烟草细菌抗性的应用，属于分子生物学和生物技术领域。

二、背景技术

细菌性病害是由细菌病菌侵染所导致的病害，防治难度比较大。我国主要的细菌性作物病害有60-70种，病害分布范围极广，能够侵染多种植株。感病植株往往发病部位广(根、茎、叶均可发病)、死亡率高、传播性强，造成农作物大量减产甚至绝产。因此，细菌性病害的防治工作已经成为一个世界性的难题并越来越受到人们的重视。早期细菌性病害的防治措施主要集中在施用化学农药、改善栽培管理技术及选育抗病品种等方面。然而，长期施用大量化学农药不但造成了严重的环境污染，而且影响了农作物的品质，危害了人体健康；改善的栽培管理技术受地域条件等因素的限制不能被广泛采用；传统的育种方式由于育种周期长、工作量大、成本高等弊端也越来越受到限制。近年来，分子生物学和基因工程技术的迅速发展为作物疾病的防治提供了新的思路。相对于传统的品种选育方法，转基因技术的应用具有快速、高效的优点，能够大大缩短品种选育的周期，克服杂交不亲和的障碍。但是，目前转基因技术仍然存在一定的弊端，尤其是抗病转基因植物的研究还不完善。植物自身存在许多抗病或与抗病相关的基因，这些基因是植物应对病原菌入侵的关键因子，然而将单一的抗病目的基因转入植物中往往不能达到理想的防治效果。梁元发等将抗菌肽基因(天蚕-Hyalophora cecropia Cecropin)转入马铃薯脱毒微型薯块中，结果发现转基因株系间抗性差异过大，某些株系仍然高度感病(梁元发等，2004)。因此，植物自身各方面防御性的提高才是增强植物抗病能力最根本的措施。而植物一般是通过某些基因的表达来激活信号通路或信号传导网络来提高植物的防御力。目前，有关信号通路相关的基因已成为植物转基因研究的热点。

促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应途径是真核生物中保守的信号传导模式，在胞内细胞信号的传导过程中发挥着重要的作用。它能够响应环境压力、机械损伤、植物激素、病原物侵染等多种刺激，促使植物产生相应的免疫性，增强植物自身的防御系统(Mizoguchi et al.，1998；Burnett et al.，2000；Ahlforset al.，2004；Asai et al.，2002)。MAPKK位于MAPK级联系统的中游，它接受MAPKKK的信号后再通过双磷酸化作用激活其特异的MAPK，从而调节特异基因的表达，使植物能够响应多种胁迫刺激。然而，目前国内外尚没有关于棉花MAPKK应用于改良作物农艺性状的报道。

棉花作为世界上最重要的经济作物之一，生产成本低，应用价值高，但是它的生长和产量严重受到病原物侵染的抑制。关于棉花功能基因，特别是抗性基因的研究不仅可以为植物基因工程提供优良的基因源，而且对于棉花遗传改良、提高其抗病性也具有重要的现实意义。

三、发明内容

本发明的目的旨在提供一种棉花抗细菌病害相关基因GhMKK5，同时提供该基因在抗细菌，尤其是青枯病害及细菌性斑点病害的转基因烟草中的应用，并应用于生产其它具有明显抵抗细菌病害能力的转基因植物。

本发明中提供的核苷酸序列来自棉花。

本发明利用同源克隆和RACE技术获得了棉花抗细菌病害相关基因GhMKK5，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。具体方法如下：

本发明从棉花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库(GenBank)中已发布的其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计简并引物，序列如下：

MP 1：AARGTNATHGGNAARGG

MP2：CCCAARCTCCAVATRTCNCT

其中，R＝A，G；H＝A，T，C；V＝G，A，C；N＝A，T，C，G

利用上述简并引物进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。将PCR产物与克隆载体(pMD18-T)连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后筛选重组子，进行序列分析。根据获得的序列设计引物，引物序列如下：

5P1：GACTTTGTAAACGGTGCCTCC

5P2：CAAGGCGTTGGAGTTGGAG

3P1：CTACGATGGTTACGCTGGGG

3P2：CCCTTTCGCAGTTGGTAGAC

通过3′和5′末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技术分别获得3′和5′端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3′和5′端序列设计特异引物，引物序列如下：

HP1：CATTCATTTCCTTTTAGCTTCCTC

HP2：CAGAAGATTTTTTCCCCTAATCC

以棉花幼叶的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列，将该cDNA命名为GhMKK5。

该基因的cDNA全长为1483bp，其中开放阅读框部分为1050bp。由此推得，该基因具有350个氨基酸。将其氨基酸序列在GenBank中检索，发现与已发表的LeMKK2(番茄，AAU04434)、NtMEK2(烟草，BAE97401)、AtMKK4(拟南芥，NP_175577)、AtMKK5(拟南芥，NP_188759)、PcMKK5(欧芹，AAS21305)、StMEK2(马铃薯，BAC81698)相比，氨基酸同源性分别为73.63％、73.46％、74.86％、75.21％、72.02％、72.99％。由此表明，经过上述克隆步骤得到了编码棉花促丝裂原活化蛋白激酶的基因GhMKK5。

该基因序列如下：

序列表

(1)SEQ.ID.NO.1的信息

(a)序列特征

长度：1483bp

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

(b)分析类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：棉花

(f)序列描述：SEQ.ID.NO.1

tttatttatt tatgtaatca ttaggagtga atgatcctcc tctcctcccg ctgctgcttc 60

atcatcttgt ccaggaactt gccttccttt ttcctttttc tgtgaagaat aaagggaaaa 120

cacacacaca cacacactct ctttctctct ctctctctct ctctctctct ctctctttca 180

tcattcattt ccttttagct tcctcaattt ttttacagct aagcc

ag acccaatcac 240

caaccaccac catctgctgg tggctcctcc tcctccaata agaaccgtcc acgtagacga 300

gctgacctta ccctacccct ccctcaacgt gacccttctc tcgccgtccc tcttcccctt 360

cctccctcct ccaactccgc cccgcccgcc tcctccaact ccaacgcctt gcctcagcaa 420

gtcaacttct ccgagctcga ccgcgtcaac cggataggga gcggtaccgg aggcaccgtt 480

tacaaagtcg tccaccgccc ttcctctcgc ccttatgccc tcaaggttat ctacgggaac 540

catgaagagt ctgtccgccg tcagatccgc agggagatcg agatcctccg tgacgtggac 600

caccccaacg tcgtaaaatg tcacgaaatg tacgatcaca acggagaaat ccaggttctt 660

ttggaattca tggatggcgg atctttggaa gggatcctca tatctcgcga agctaactta 720

tcagatctgg cccgtcaagt cctcagcggt ctaaactacc ttcaccgccg acacatcgtc 780

caccgcgaca taaaaccttc gaatctgcta accaattcca agaaggtggt gaagatagct 840

gattttgggg tgagccgaat cttggatcaa accatggacc cctgcaactc atctgttggg 900

accatagcat acatgagccc tgagaggatt aacaccgatt tgaaccacgg gctctacgat 960

ggttacgctg gggatatttg gagtttaggg gttagcatat tggaatttta tttagggagg 1020

ttccctttcg cagttggtag acaaggggat tgggccagtc tcatgtgcgc gatttgtatg 1080

tctcagccac cggaggcccc tcccactgct tctaatgaat ttaggcattt tatatcatgt 1140

tgtttgcaga gggatccagc caggaggtgg tcggcggctc agttgttgca gcatcctttt 1200

attctcagag gacaaccaca tcaggttgct cagaatcttc atcagttatt accacctcca 1260

cctcctcttt cttct

ct ttctatttct ttttatttgt tttgggatta ggggaaaaaa 1320

tcttctgtaa gttttgatat aatgagggtc tggggggagt tgggtgcaat gtctttcctt 1380

cttctttttt ttttttcctt tcatgttttt attaatcact cttgcttctg ataaaagata 1440

atctttacaa tattagaaaa aaaaaaactc tgttatgact ggc 1483

其中透明方框内的为起始密码子，灰色方框内的为终止密码子。

(3)SEQ.ID.NO.2的信息

(a)序列特征

长度：350个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(b)分析类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ.ID.NO.2

Met Arg Pro Asn His Gln Pro Pro Pro Ser Ala Gly Gly Ser Ser Ser

1 5 10 15

Ser Asn Lys Asn Arg Pro Arg Arg Arg Ala Asp Leu Thr Leu Pro Leu

20 25 30

Pro Gln Arg Asp Pro Ser Leu Ala Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser

35 40 45

Ser Asn Ser Ala Pro Pro Ala Ser Ser Asn Ser Asn Ala Leu Pro Gln

50 55 60

Gln Val Asn Phe Ser Glu Leu Asp Arg Val Asn Arg Ile Gly Ser Gly

65 70 75 80

Thr Gly Gly Thr Val Tyr Lys Val Val His Arg Pro Ser Ser Arg Pro

85 90 95

Tyr Ala Leu Lys Val Ile Tyr Gly Asn His Glu Glu Ser Val Arg Arg

100 105 110

Gln Ile Arg Arg Glu Ile Glu Ile Leu Arg Asp Val Asp His Pro Asn

115 120 125

Val Val Lys Cys His Glu MET Tyr Asp His Asn Gly Glu Ile Gln Val

130 135 140

Leu Leu Glu Phe MET Asp Gly Gly Ser Leu Glu Gly Ile Leu Ile Ser

145 150 155 160

Arg Glu Ala Asn Leu Ser Asp Leu Ala Arg Gln Val Leu Ser Gly Leu

165 170 175

Asn Tyr Leu His Arg Arg His Ile Val His Arg Asp Ile Lys Pro Ser

180 185 190

Asn Leu Leu Thr Asn Ser Lys Lys Val Val Lys Ile Ala Asp Phe Gly

195 200 205

Val Ser Arg Ile Leu Asp Gln Thr MET Asp Pro Cys Asn Ser Ser Val

210 215 220

Gly Thr Ile Ala Tyr MET Ser Pro Glu Arg Ile Asn Thr Asp Leu Asn

225 230 235 240

His Gly Leu Tyr Asp Gly Tyr Ala Gly Asp Ile Trp Ser Leu Gly Val

245 250 255

Ser Ile Leu Glu Phe Tyr Leu Gly Arg Phe Pro Phe Ala Val Gly Arg

260 265 270

Gln Gly Asp Trp Ala Ser Leu MET Cys Ala Ile Cys MET Ser Gln Pro

275 280 285

Pro Glu Ala Pro Pro Thr Ala Ser Asn Glu Phe Arg His Phe Ile Ser

290 295 300

Cys Cys Leu Gln Arg Asp Pro Ala Arg Arg Trp Ser Ala Ala Gln Leu

305 310 315 320

Leu Gln His Pro Phe Ile Leu Arg Gly Gln Pro His Gln Val Ala Gln

325 330 335

Asn Leu His Gln Leu Leu Pro Pro Pro Pro Pro Leu Ser Ser

340 345 350

本发明还提供了编码促丝裂原活化蛋白激酶激酶基因GhMKK5在农作物中应用的方法，可提高转基因细菌抗性能力。步骤为：

(a)利用棉花促丝裂原活化蛋白激酶激酶基因GhMKK5，将cDNA序列置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体。

(b)采用本领域熟知的方法，如农杆菌介导的方法将构建的表达载体导入植物细胞，得到转基因植株。

本发明从棉花中分离出一种编码促丝裂原活化蛋白激酶激酶的基因(GhMKK5)，将该cDNA序列构建在由组成型CaMV 35S强启动子控制的真核转化载体pBI121上，构建了GhMKK5的正义表达载体，采用农杆菌介导的方法转化本生烟。对获得的转基因烟草进行功能分析表明，转基因烟草中GhMKK5的过量表达能提高其细菌抗性。相对于非转基因烟草，转基因植株具有明显的抗菌能力。该基因可转化棉花、小麦、玉米等农作物，能提高其产量，具有重大的经济价值和社会价值。

本发明涉及一种植物表达载体，包含有如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列，用于提高植物抵抗细菌病菌的能力。

本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电击法、显微注射法、脂质体转化法、PEG介导的转化法、花粉管导入法等。

本发明所用选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。

本发明中GhMKK5基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它具有抵抗细菌病害能力的转基因植物，包括具有抗细菌病害能力植物的器官、组织、细胞及其种子和后代。

本发明采用离体叶片接种法对获得的T2代转基因烟草进行抗细菌病能力分析发现，转基因烟草中GhMKK5的过量表达能显著提高其抗青枯病害及细菌性斑点病害的能力。可将该基因转化小麦、棉花等农作物或其它植物，提高其抵抗细菌病害的能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。

四、附图说明

图1.PCR扩增GhMKK5片段。M：marker DL2000。

图2.棉花中GhMKK5氨基酸序列与几种其它植物的MAPK氨基酸序列的比较结果。其中相同的氨基酸残基用黑底表示。它们在GenBank中的注册号及其物种来源分别为：StMEK2(马铃薯，BAC81698)、AtMKK4(拟南芥，NP 175577)、AtMKK5(拟南芥，NP 188759)、LeMKK2(番茄，AAU04434)、NtMEK2(烟草，BAE97401)、PcMKK5(欧芹，AAS21305)。

图3.烟草正义表达载体的构建程序。

图4.部分转基因植株的PCR鉴定结果。CK-：非转基因对照；CK+：转空载体阳性对照；1-10：转基因烟草植株M：marker DL2000。

图5.过量表达GhMKK5的转基因烟草与非转基因烟草离体接种细菌。A：未接种细菌的非转基因烟草；B：未接种细菌的转基因烟草；C：接种青枯病菌的非转基因烟草；D：接种青枯病菌的转基因烟草；E：接种Pst DC3000的非转基因烟草；F：接种Pst DC3000的转基因烟草。

五、具体实施方式

基于本生烟草生长速度快、生活周期短、离体培养再生能力强、遗传转化效率高等优点，在下述实施例中以本生烟为例对本发明进行了详细的说明。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例(一)：一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMKK5的克隆方法

1.RNA的提取：利用TRIZOL试剂盒提取棉花总RNA

2.cDNA第一链的合成(采用Transgen公司cDNA第一链合成试剂盒法)

在0.25ml离心管中加入下列试剂：

mRNA 5μl

Oligo d(T) 1μl

Buffer 10μl

EasyS cript Reverse Transcriptase 1μl

RNAase free water 3μl

吸打混匀后42℃水浴30min，85℃水浴10min，冰上冷却5min，轻离心后，保存备用。

3.cDNA的5′加尾反应

(a)反应体系：

cDNA 20μl

5×TdT Buffer 10μl

0.1％BSA 5μl

100mM dCTP 1μl

TdT 1μl

ddH₂O Up to 50μl

(b)37℃保温30min。

(c)加100μl无水乙醇，-20℃沉淀30min。

(d)12,000rpm，室温离心5min。弃上清，干燥后加适量ddH₂O回溶。

4.cDNA全长序列的获得

4.1 用引物MP 1(AARGTNATHGGNAARGG)和MP2(CCCAARCTCCAVATRTCNCT)进行PCR反应获得GhMKK5中间片段体系如下：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1μl

MP1(10μM) 1μl

MP2(10μM) 1μl

cDNA 1μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 25μl

反应程序为：

94℃ 5min

72℃ 5min

反应完毕后，电泳检测结果并回收正确片段。将所得片段连入pMD18-T，取PCR产物4μl与pMD18-T载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD18-T Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至LB液体培养基中培养3h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。

4.2 5′RACE获得5′端序列

(a)用引物AAP(GGCCACGCGTCGACTAGTAC(G)₁₄)和5P1(GACTTTGTAAACGGTGCCTCC)进行PCR，体系如下：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1μl

AAP(10μM) 1μl

5P1(10μM) 1μl

cDNA 1μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 25μl

(b)反应程序为：

94℃ 5min

72℃ 5min

(c)同样的体系和反应程序以第一次PCR产物为模板做二次PCR，引物为AUAP(GGCCACGCGTCGACTAGTAC)和5P2(CAAGGCGTTGGAGTTGGAG)。

(d)将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。

4.3 3′RACE获得3′端序列

(a)用引物B26(GACTCTAGACGACATCGA(T)₁₈)和3P1(CTACGATGGTTACGCTGGGG)进行PCR，体系如下：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1μl

B26(10μM) 1μl

3P1(10μM) 1μl

cDNA 0.5μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 25μl

(b)反应程序为：

94℃ 5min

72℃ 5min

(c)以同样的体系和反应程序，用第一次PCR产物为模板做二次PCR，引物为B25(GACTCTAGACGACATCGA)和3P2(CCCTTTCGCAGTTGGTAGAC)。

4.4 cDNA全长序列的获得

根据已测定序列及其重叠区域，拼出目的基因的全长cDNA，设计引物HP1和引物HP2，PCR扩增全长序列作进一步的验证。

HP1：CATTCATTTCCTTTTAGCTTCCTC

HP2：CAGAAGATTTTTTCCCCTAATCC

(a)反应体系：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1μl

HP1(10μM) 1μl

HP2(10μM) 1μl

cDNA 0.5μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 50μl

(b)反应程序：

94℃ 5min

72℃ 5min

(c)将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。

5.同源检索：利用BLAST软件将分离出的全长cDNA序列与GenBank中的序列进行比较。

实施例(二)：棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMKK5的序列见SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2。

实施例(三)：表达载体的构建

(1)根据分离出的棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因的核苷酸序列，设计引物：

正向引物：5′-TCTAGACATTCATTTCCTTTTAGCTTCCTC-3′

划横线部分为Xba Ⅰ酶切位点

反向引物：5′-GTCGACCAGAAGATTTTTTCCCCTAATCC-3′

划横线部分为Sal Ⅰ酶切位点

以该基因全长测序质粒为模板，利用上述正向和反向引物进行PCR反应。

(2)取PCR产物4μl与pMD18-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD18-T Simple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落挑取白色菌落至LB液体培养基中培养3h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。

(3)将PCR扩增得到目的片段用Xba Ⅰ和Sal Ⅰ酶切，与用相同的限制性内切酶酶切的pBI121表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后在含卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定。

(4)将构建好的表达载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞，本发明采用的是冻融法转化农杆菌。

实施例(四)：转基因植物的获得

(1)本生烟草种子，播种于MS基本培养基中，至5-6片真叶期，备用。

(2)挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡那霉素的YEP培养基中，28℃，250rpm，振荡培养约48h，至对数生长后期；将菌液用MS培养液稀释10倍，待用。

(3)取烟草叶片，剪成小块(0.5×0.5cm)，将剪好的烟草叶片，置于MS预分化培养基中，28℃，光照时间16h/d，光照强度2,000Lux，预培养2d。

(4)将预培养后的烟草叶片浸入菌液5-10min，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入MS基本培养基；弱光下，28℃共培养2d。

(5)共培养后的外殖体先用含羧苄青霉素250mg/L的无菌水洗涤3次，再用含羧苄青霉素250mg/L的MS培养液洗1次，然后用灭菌滤纸吸干，转入含有卡那霉素100mg/L，羧苄青霉素250mg/L的MS选择培养基上，恒温培养(条件同预培养)；每15d更换一次培养基。

(6)待芽长至1cm左右时，切下，移入MS生根培养基(附加卡那霉素50mg/L，羧苄青霉素250mg/L)中，促其生根。

(7)根系发育好后(5-6片叶)，移入盛有无菌土的花盆中，温室常规管理。

实施例(五)：转基因烟草抗细菌病害能力分析

采用离体接种的方法使转基因烟草叶片分别感染青枯病菌及细菌性斑点病病原菌(Pst DC3000)，温室放置3天和5天后观察。

(1)将T2转基因株系种子种在无菌土中，待生长至8周后摘取不同株系平整健壮的，处于相同叶位的叶片。

(2)将青枯病菌接种至新鲜的液体培养基中，37℃摇菌至OD₆₀₀＝0.4-0.6。

(3)将20μl新鲜菌液接种于叶片表面，保湿温室光照培养3天后观察。

(4)用上述相同的方法接种Pst DC3000，保湿温室光照培养5天后观察。

通过转基因烟草离体接种细菌后发现，转基因植株相对于非转基因烟草具有明显的抗菌能力。该基因可转化小麦、棉花等农作物，提高其抗菌能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。

序列表

<110>山东农业大学

<120>一种可提高转基因作物细菌抗性的基因GhMKK5及其应用

<160>2

<210>1

<211>1483

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium hirsutum)

<220>

<221>CDS

<222>(226)...(1278)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)...(225)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(1279)...(1483)

<223>

<400>1

tttatttatt tatgtaatca ttaggagtga atgatcctcc tctcctcccg ctgctgcttc 60

atcatcttgt ccaggaactt gccttccttt ttcctttttc tgtgaagaat aaagggaaaa 120

cacacacaca cacacactct ctttctctct ctctctctct ctctctctct ctctctttca 180

tcattcattt ccttttagct tcctcaattt ttttacagct aagcc

aga ccc aat cac 240

Met Arg Pro Asn His

1 5

caa cca cca cca tct gct ggt ggc tcc tcc tcc tcc aat aag aac cgt cca 291

Gln Pro Pro Pro Ser Ala Gly Gly Ser Ser Ser Ser Asn Lys Asn Arg Pro

10 15 20

cgt aga cga gct gac ctt acc cta ccc ctc cct caa cgt gac cct tct ctc 342

Arg Arg Arg Ala Asp Leu Thr Leu Pro Leu Pro Gln Arg Asp Pro Ser Leu

25 30 35

gcc gtc cct ctt ccc ctt cct ccc tcc tcc aac tcc gcc ccg ccc gcc tcc 393

Ala Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Ser Asn Ser Ala Pro Pro Ala Ser

40 45 50 55

tcc aac tcc aac gcc ttg cct cag caa gtc aac ttc tcc gag ctc gac cgc 444

Ser Asn Ser Asn Ala Leu Pro Gln Gln Val Asn Phe Ser Glu Leu Asp Arg

60 65 70

gtc aac cgg ata ggg agc ggt acc gga ggc acc gtt tac aaa gtc gtc cac 495

Val Asn Arg Ile Gly Ser Gly Thr Gly Gly Thr Val Tyr Lys Val Val His

75 80 85 90

cgc cct tcc tct cgc cct tat gcc ctc aag gtt atc tac ggg aac cat gaa 546

Arg Pro Ser Ser Arg Pro Tyr Ala Leu Lys Val Ile Tyr Gly Asn His Glu

95 100 105

gag tct gtc cgc cgt cag atc cgc agg gag atc gag atc ctc cgt gac gtg 597

Glu Ser Val Arg Arg Gln Ile Arg Arg Glu Ile Glu Ile Leu Arg Asp Val

110 115 120

gac cac ccc aac gtc gta aaa tgt cac gaa atg tac gat cac aac gga gaa 648

Asp His Pro Asn Val Val Lys Cys His Glu Met Tyr Asp His Asn Gly Glu

125 130 135 140

atc cag gtt ctt ttg gaa ttc atg gat ggc gga tct ttg gaa ggg atc ctc 699

Ile Gln Val Leu Leu Glu Phe Met Asp Gly Gly Ser Leu Glu Gly Ile Leu

145 150 155

ata tct cgc gaa gct aac tta tca gat ctg gcc cgt caa gtc ctc agc ggt 750

Ile Ser Arg Glu Ala Asn Leu Ser Asp Leu Ala Arg Gln Val Leu Ser Gly

160 165 170 175

cta aac tac ctt cac cgc cga cac atc gtc cac cgc gac ata aaa cct tcg 801

Leu Asn Tyr Leu His Arg Arg His Ile Val His Arg Asp Ile Lys Pro Ser

180 185 190

aat ctg cta acc aat tcc aag aag gtg gtg aag ata gct gat ttt ggg gtg 852

Asn Leu Leu Thr Asn Ser Lys Lys Val Val Lys Ile Ala Asp Phe Gly Val

195 200 205

agc cga atc ttg gat caa acc atg gac ccc tgc aac tca tct gtt ggg acc 903

Ser Arg Ile Leu Asp Gln Thr Met Asp Pro Cys Asn Ser Ser Val Gly Thr

210 215 220 225

ata gca tac atg agc cct gag agg att aac acc gat ttg aac cac ggg ctc 954

Ile Ala Tyr Met Ser Pro Glu Arg Ile Asn Thr Asp Leu Asn His Gly Leu

230 235 240

tac gat ggt tac gct ggg gat att tgg agt tta ggg gtt agc ata ttg gaa 1005

Tyr Asp Gly Tyr Ala Gly Asp Ile Trp Ser Leu Gly Val Ser Ile Leu Glu

245 250 255 260

ttt tat tta ggg agg ttc cct ttc gca gtt ggt aga caa ggg gat tgg gcc 1056

Phe Tyr Leu Gly Arg Phe Pro Phe Ala Val Gly Arg Gln Gly Asp Trp Ala

265 270 275

agt ctc atg tgc gcg att tgt atg tct cag cca ccg gag gcc cct ccc act 1107

Ser Leu Met Cys Ala Ile Cys Met Ser Gln Pro Pro Glu Ala Pro Pro Thr

280 285 290

gct tct aat gaa ttt agg cat ttt ata tca tgt tgt ttg cag agg gat cca 1158

Ala Ser Asn Glu Phe Arg His Phe Ile Ser Cys Cys Leu Gln Arg Asp Pro

295 300 305 310

gcc agg agg tgg tcg gcg gct cag ttg ttg cag cat cct ttt att ctc aga 1209

Ala Arg Arg Trp Ser Ala Ala Gln Leu Leu Gln His Pro Phe Ile Leu Arg

315 320 325

gga caa cca cat cag gtt gct cag aat ctt cat cag tta tta cca cct cca 1260

Gly Gln Pro His Gln Val Ala Gln Asn Leu His Gln Leu Leu Pro Pro Pro

330 335 340 345

cct cct ctt tct tct

ctttctattt ctttttattt gttttgggat taggggaaaa 1318

Pro Pro Leu Ser Ser *

350

aatcttctgt aagttttgat ataatgaggg tctgggggga gttgggtgca atgtctttcc 1378

ttcttctttt ttttttttcc tttcatgttt ttattaatca ctcttgcttc tgataaaaga 1438

taatctttac aatattagaa aaaaaaaaac tctgttatga ctggc 1483

<210>2

<211>350

<212>PRT

<213>棉花(Gossypium hirsutum)

<400>2

Met Arg Pro Asn His Gln Pro Pro Pro Ser Ala Gly Gly Ser Ser Ser

1 5 10 15

Ser Asn Lys Asn Arg Pro Arg Arg Arg Ala Asp Leu Thr Leu Pro Leu

20 25 30

Pro Gln Arg Asp Pro Ser Leu Ala Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser

35 40 45

Ser Asn Ser Ala Pro Pro Ala Ser Ser Asn Ser Asn Ala Leu Pro Gln

50 55 60

Gln Val Asn Phe Ser Glu Leu Asp Arg Val Asn Arg Ile Gly Ser Gly

65 70 75 80

Thr Gly Gly Thr Val Tyr Lys Val Val His Arg Pro Ser Ser Arg Pro

85 90 95

Tyr Ala Leu Lys Val Ile Tyr Gly Asn His Glu Glu Ser Val Arg Arg

100 105 110

Gln Ile Arg Arg Glu Ile Glu Ile Leu Arg Asp Val Asp His Pro Asn

115 120 125

Val Val Lys Cys His Glu MET Tyr Asp His Asn Gly Glu Ile Gln Val

130 135 140

Leu Leu Glu Phe MET Asp Gly Gly Ser Leu Glu Gly Ile Leu Ile Ser

145 150 155 160

Arg Glu Ala Asn Leu Ser Asp Leu Ala Arg Gln Val Leu Ser Gly Leu

165 170 175

Asn Tyr Leu His Arg Arg His Ile Val His Arg Asp Ile Lys Pro Ser

180 185 190

Asn Leu Leu Thr Asn Ser Lys Lys Val Val Lys Ile Ala Asp Phe Gly

195 200 205

Val Ser Arg Ile Leu Asp Gln Thr MET Asp Pro Cys Asn Ser Ser Val

210 215 220

Gly Thr Ile Ala Tyr MET Ser Pro Glu Arg Ile Asn Thr Asp Leu Asn

225 230 235 240

His Gly Leu Tyr Asp Gly Tyr Ala Gly Asp Ile Trp Ser Leu Gly Val

245 250 255

Ser Ile Leu Glu Phe Tyr Leu Gly Arg Phe Pro Phe Ala Val Gly Arg

260 265 270

Gln Gly Asp Trp Ala Ser Leu MET Cys Ala Ile Cys MET Ser Gln Pro

275 280 285

Pro Glu Ala Pro Pro Thr Ala Ser Asn Glu Phe Arg His Phe Ile Ser

290 295 300

Cys Cys Leu Gln Arg Asp Pro Ala Arg Arg Trp Ser Ala Ala Gln Leu

305 310 315 320

Leu Gln His Pro Phe Ile Leu Arg Gly Gln Pro His Gln Val Ala Gln

325 330 335

Asn Leu His Gln Leu Leu Pro Pro Pro Pro Pro Leu Ser Ser

340 345 350

Claims

1.一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMKK5，其特征在于其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMKK5的应用，其特征在于该基因在本生烟草中过量表达，能够提高转基因烟草对细菌的抗性。