CN101781654A

CN101781654A - 棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7及其应用

Info

Publication number: CN101781654A
Application number: CN200910230309A
Authority: CN
Inventors: 郭兴启; 张良; 于菲菲; 石静
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2009-11-10
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2010-07-21
Anticipated expiration: 2029-11-10
Also published as: CN101781654B

Abstract

本发明涉及一种棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明采用同源克隆和RACE技术获得一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因。将该基因的cDNA序列置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体，转化本生烟，使该基因在烟草中过量表达。实验证实，转基因烟草具有明显的抵抗真菌病害，尤其是烟草炭疽和烟草赤星病菌的能力。如将该基因用于转化小麦、玉米、棉花等农作物，可提高其抗真菌能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。

Description

棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7及其应用

一、技术领域

本发明涉及一种棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7的克隆、重组及转基因烟草抗真菌病害能力的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

二、背景技术

真菌病害是限制农作物产量和品质的主要病害，世界各地每年均有不同程度的发生，常导致农作物品质下降，大量减产，甚至绝收，给农业生产带来了重大的经济损失。真菌病害一般具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多等特点，防治难度比较大。目前主要采取选育抗病品种和改善栽培管理技术为主的综合治理措施。选育的抗病品种往往因为病原菌的变异使其自身对各种化学药剂产生耐药性或抗药性，从而导致抗病品种抗性降低或丧失，而且化学药剂会引起环境污染。目前关于拮抗菌对农作物的生防作用已有一些研究，但由于高效生防菌株缺乏、生防菌定殖能力和抗药能力差、生防菌制剂存在安全性问题等原因，利用生防菌提高植物抗病性的应用有很大的局限性。防治病害最根本的手段应该是提高植物自身的抗病性。抗病基因工程方法和技术的应用，为提高植物自身的抗病性、培育抗病植物品种开辟了新的途径。Bt抗虫棉是我国首例转基因作物应用于生产的成功范例。植物自身存在大量的抗病或与抗病相关的基因，这些基因是植物应对病原菌入侵的关键因子。随着分子生物学研究的深入及生物技术的发展，越来越多的植物抗病相关基因得到克隆，其中不少基因已被用于植物转基因研究。抗真菌基因，如几丁质酶基因、葡聚糖酶基因、抗真菌蛋白基因等已经应用在植物抵抗真菌病害中。但研究发现，几丁质酶只对一部分真菌具有抑制作用，而对另一些真菌则无效。通过转几丁质酶基因提高植物抗真菌病害能力的效果还与几丁质酶类型和真菌病原菌特性有关，即几丁质酶抑菌作用具有选择性，但其选择机制目前还不是很清楚。植物抗病相关基因的克隆将有助于通过抗病基因工程的手段培育转基因抗病植株。抗病基因工程具有快速、高效等优点，一方面可以大大缩短选育新品种的周期，另一方面能使抗病基因在远缘异源植物中发挥其功能。这是常规育种方法难以办到的，同时也避免了因为病原菌和植物发生基因扩散而带来的生物安全问题。

植物自身通过复杂的级联反应来抵抗病原菌的入侵。不同病原菌的侵染方式和途径不同，侵染后的症状各异，但所引起的病原信号在植物体内的传递途径基本相同。不同植物中应对不同病害的抗病基因之间在结构和功能上存在一定的保守性，这说明植物应对不同病害过程中可能存在共同的信号传递机制(宋从凤，2001)。信号传导过程是一个复杂的网络系统，也是近年来抗病性研究的热点和难点之一。蛋白激酶是植物抗病信号转导途径的重要组分，而促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应处于信号转导途径的中心.位置。有研究表明，MAPK在提高植物抗病性方面有重要作用。

MAPK可以参与抗病反应和植物的先天性免疫反应(Zhang and Klessig，1998；Ren et al.，2002；Asai et al.，2002)。当植物受到真菌、细菌、病毒等病原物侵染后，被病原侵染的细胞产生化学信号并传递到其它组织或器官，使其对病原感染产生抗性，这种抗性称为系统获得性抗性(systemic acquiredresistance，SAR)(Durrant and Dong，2004)。这种抗性的产生包括一系列信号的传递、蛋白的激活及相关基因的表达，MAPK在此过程中起到非常重要的作用。SIPK(SA-induced protein kinase)能够被水杨酸(SA)迅速诱导，从而介导抗病反应。Yang等(2001)发现在烟草中SIPK和WIPK(wound-induced protein kinase)受NtMEK2(MAPK的上游激酶)的调节，它能够被多种病原物或病原激发子激活，控制着合成植物抗毒素和水杨酸的2个关键酶(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶和苯丙氨酸解氨酶)的基因表达。植物受到病原物侵染后会在短时间内产生大量活性氧，形成氧化胁迫，从而激活MAPK级联途径，引起植物的防御反应。目前关于MAPK参与植物抗病的研究主要集中在模式植物拟南芥和烟草上，不同植物中MAPK功能有很大差异，所以从其它植物中分离鉴定MAPK并分析其功能就显得很有必要。

棉花是世界性的经济作物和工业原料，具有重要的经济和社会效益。本发明中，我们用常规方法在棉花(Gossypium hirsutum L.)(鲁棉22)中克隆到一个MAPK基因，将其与CaMV 35S启动子相连，构建在植物表达载体上并导入本生烟(Nicotiana benthamiana)中，使该基因在本生烟中过量表达，发现转基因植株对烟草炭疽和烟草赤星两种真菌病害具有较高的抗性。这一策略的应用不仅能为植物抗病基因工程提供新的基因源，丰富植物抗病基因工程理论体系，而且对于培育其它抗真菌病害的种质材料也具有重要的现实意义。

经检索，国内外文献和专利中尚没有关于该棉花抗病相关基因GhMPK7的报道。

三、发明内容

本发明的目的旨在提供一种棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7，同时提供一种该基因在获得抗真菌，尤其是炭疽和赤星真菌病害的转基因烟草中的应用，并应用于生产其它具有明显抵抗真菌病害能力的转基因植物。

本发明中提供的核苷酸序列来自棉花。

本发明利用同源克隆和RACE技术获得了棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7，其基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。具体方法如下：

本发明从棉花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库中已发布的其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计简并引物，进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析。然后通过3′和5′末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNAends，RACE)技术分别获得3′和5′端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3′和5′端序列设计特异引物，以棉花幼叶的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列。

该基因的全长cDNA为1564bp，其中包括1104bp的开放阅读框(openreading frame，ORF)。由此推得，该基因编码368个氨基酸，预测分子量约为42.26kDa，等电点7.33。将其氨基酸序列在GenBank中检索，发现与已公布的PaMAPK(杏，AAD32204)、AtMPK7(拟南芥，NP 179409)、NtNTF3(烟草，CAA49592)、GhMAPK(棉花，ABA00652)相比，氨基酸同源性分别为88.59％、87.23％、83.60％、82.80％。由此表明，经过上述克隆步骤得到了编码一个棉花促丝裂原活化蛋白激酶的基因，根据植物MAPK命名法，将该基因命名为GhMPK7。

该基因序列如下：

序列表

(1)SEQ.ID.NO.1的信息

(a)序列特征

长度：1564bp

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

(b)分析类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：棉花

(f)序列描述：SEQ.ID.NO.1

ACTTTTATTT CTAGGGAACA CAAATGAAAG GAATTTTTTT CTTTTTTTCT TTTAGTGGTG 60

GAATGATCTC AAAGTTGTGA ATTTGAAGCT GGTTTAGAGG TTGAAGAAAA GGGTAAAAAA 120

AAAATGGGGT TCTTTTTTTT TTTTGGAAGA AATGAAGACC AAAGTTTGGA ATTTTACAGA 180

GGAATAATTT GAAAGTTTGG GTTTTTCAAA TCTACTTTCT AGGGGAAAGG AGAAAAAAAA 240

AGTGAAGAAG CTGATTTAGA AAAGATCAAA GCAAGAATTT CCCAAAA

GCGACGCTTG 300

TGGAGCCACC AAATGGAGTG AAGCCAAAAG GAAAGCATTA CTATTCAATG TGGCAAACCC 360

TTTTCGAGAT CGACACCAAA TATGTTCCAA TCAAGCCTAT AGGAAGAGGT GCATACGGCA 420

TAGTTTGCTC TGCAATCAAC AGGGAAACCA ACGAGAAAGT GGCTATAAAG AAGATCAACA 480

ACGTGTTCGA GAACCGTGTT GATGCTTTGA GAACTTTGAG GGAACTGAAA CTTCTCAGAC 540

ACATTCGACA CGAGAACGTG ATAGCTTTGA AAGATGTTAT GATGCCAATT CAGAGAATCG 600

GTTTTAAGGA TGTTTATTTG GTTTATGAGC TTATGGACAC CGATTTGCAT CAGATTATCA 660

AGTCTCCTCA GCCGCTTTCT AATGATCATT GCAAGTATTT TATTTTTCAG TTGCTACGAG 720

GGCTGAAGTA CCTCCACTCG GCAAACATCC TTCTCCGAGA TTTGAAGCCC GGGAACCTTC 780

TTGTCAATGC AAACTGTGAC CTGAAGATAT GTGATTTTGG GCTGGCTCGA ACCAGCAGAG 840

GCAACGAACA ATTCATGACA GAGTATGTTG TCACCCGCTG GTACCGTGCA CCTGAGCTCC 900

TACTCTGTTG TGATAATTAT GGGACCTCCA TTGATGTTTG GTCGGTAGGA TGCATCTTTG 960

CGGAGATTCT TGGTCGGAAA CCAATCTTTC CTGGAACGGA ATGCCTCAAC CAGCTTAAGC 1020

TGATTATCAA TGTTCTCGGA AGTCAACAAG AGGCCAACAT TCAGTTTATT GATAATCCCA 1080

AAGCTCGACG GTACATCAAG TCACTTCCGT ACTCTAGGGG CACCCACTTT TCCCTTTTAT 1140

ACCCACAAGC CGATCCATTA GCCATAGATT TGTTGCAAAG GATGCTTGTT TTCGACCCAT 1200

CAAAGAGAAT CACCGTCACA GAAGCACTCC TACATCCATA CCTGTTAGGG CTGTATGATC 1260

CAAGGTGCAA TCCACCTGCT CAAGTCCCAA TTGATCTTGA GATAGATGAG AACATGGGAG 1320

AATCGATGAT CAGGGAGATG ATGTGGAGTG AAATGCTTCA CTATCACCCA GAGGCTGTAT 1380

CTGCCAATGC T

GTAACA TTGTTTTCGC TGCTTTGTTG TAATGTATTT TCGGAACTGA 1440

TATTTATCGA TTGAACTCAA TGAACAATGT TGAGAATTCT GGTGGTACCC AGATTTTGTT 1500

TTACTTTTAA CATTCTTGTT TATTAGTTTA TGATTTGGTT GTAGCGAAAA AAAAAAAAAA 1560

AAAA

其中透明方框内的为起始密码子，灰色方框内的为终止密码子。

(3)SEQ.ID.NO.2的信息

(a)序列特征

长度：368个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(b)分析类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ.ID.NO.2

Met Ala Thr Leu Val Glu Pro Pro Asn Gly Val Lys Pro Lys Gly Lys

1 5 10 15

His Tyr Tyr Ser Met Trp Gln Thr Leu Phe Glu Ile Asp Thr Lys Tyr

20 25 30

Val Pro Ile Lys Pro Ile Gly Arg Gly Ala Tyr GlyIle Val Cys Ser

35 40 45

Ala Ile Asn Arg Glu Thr Asn Glu Lys Val Ala Ile Lys Lys Ile Asn

50 55 60

Asn Val Phe Glu Asn Arg Val Asp Ala Leu Arg Thr Leu Arg Glu Leu

65 70 75 80

Lys Leu Leu Arg His Ile Arg His Glu Asn Val Ile Ala Leu Lys Asp

85 90 95

Val Met Met Pro Ile Gln Arg Ile Gly Phe Lys Asp Val Tyr Leu Val

100 105 110

Tyr Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Lys Ser Pro Gln

115 120 125

Pro Leu Ser Asn Asp His Cys Lys Tyr Phe Ile Phe Gln Leu Leu Arg

130 135 140

Gly Leu Lys Tyr Leu His Ser Ala Asn Ile Leu Leu Arg Asp Leu Lys

145 150 155 160

Pro Gly Asn Leu Leu Val Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp

165 170 175

Phe Gly Leu Ala Arg Thr Ser Arg Gly Asn Glu Gln Phe Met Thr Glu

180 185 190

Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Cys Cys

195 200 205

Asp Asn Tyr Gly Thr Ser Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe

210 215 220

Ala Glu Ile Leu Gly Arg Lys ProIle Phe Pro Gly Thr Glu Cys Leu

225 230 235 240

Asn Gln Leu Lys Leu Ile Ile Asn Val Leu Gly Ser Gln Gln Glu Ala

245 250 255

Asn Ile Gln Phe Ile Asp Asn Pro Lys Ala Arg Arg Tyr Ile Lys Ser

260 265 270

Leu Pro Tyr Ser Arg Gly Thr His Phe Ser Leu Leu Tyr Pro Gln Ala

275 280 285

Asp Pro Leu Ala Ile Asp Leu Leu Gln Arg Met Leu Val Phe Asp Pro

290 295 300

Ser Lys Arg Ile Thr Val Thr Glu Ala Leu Leu His Pro Tyr Leu Leu

305 310 315 320

Gly Leu Tyr Asp Pro Arg Cys Asn Pro Pro Ala Gln Val Pro Ile Asp

325 330 335

Leu Glu Ile Asp Glu Asn Met Gly Glu Ser Met Ile Arg Glu Met Met

340 345 350

Trp Ser Glu Met Leu His Tyr His Pro Glu Ala Val Ser Ala Asn Ala

355 360 365

本发明提供了棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7在其它植物中应用的方法，可提高转基因植物抵抗炭疽和赤星等真菌病害的能力。步骤为：

(a)利用如上所述的GhMPK7基因，将cDNA序列置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体。

(b)采用本领域熟知的方法，如农杆菌介导的方法将构建的表达载体导入植物细胞，得到转基因植株。

本发明涉及一种植物表达载体，包含有权利要求1所述的核苷酸序列SEQ.ID.NO.1，用于提高植物抵抗真菌，尤其是炭疽和赤星真菌病害的能力。

本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电击法、显微注射法、脂质体转化法、PEG介导的转化法、花粉管导入法等，得到抗真菌病害能力的转基因植物。

本发明所用选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。

基于本生烟生长速度快、生活周期短、离体培养再生能力强、遗传转化效率高等优点，在下述实施例中以本生烟为例对本发明进行了详细的说明，但本发明中GhMPK7基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它具有抵抗真菌病害能力的转基因植物，包括具有抗真菌病害能力植物的器官、组织、细胞及其种子和后代。

本发明采用离体叶片接种法对获得的T2代转基因烟草进行抗真菌病能力分析发现，转基因烟草中GhMPK7的过量表达能显著提高其抗烟草炭疽和烟草赤星真菌病害的能力。可将该基因转化小麦、玉米、棉花等农作物或其它植物，提高其抵抗炭疽和赤星真菌病害的能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。

四、附图说明

图1.GhMPK7cDNA的PCR扩增电泳图。A：cDNA全长片段；B：MarkerDL2000。

图2.棉花中GhMPK7氨基酸序列与几种其它植物的MAPK氨基酸序列的比较结果。其中相同的氨基酸残基用黑底表示。它们在GenBank中的注册号及其物种来源分别为：PaMAPK(杏，AAD32204)、AtMPK7(拟南芥，NP 179409)、NtNTF3(烟草，CAA49592)、GhMAPK(棉花，ABA00652)。

图3.构建的植物表达载体示意图。

图4.部分转基因植株的PCR鉴定结果。CK-：非转基因对照；CK+：pBI121质粒作为阳性对照；1-9：转基因烟草各株系；M：Marker DL2000。

图5.过量表达GhMPK7的转基因烟草与非转基因烟草离体叶片在接种烟草炭疽和赤星真菌后发病状况比较。A、D：非转基因烟草；B、C：转基因本生烟株系7和9接种烟草炭疽病原真菌3天后的发病状况；E、F：转基因本生烟株系1和7接种烟草赤星病原真菌3天后的发病情况。

五、具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施方式(一)：棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7的克隆

1.RNA的提取：利用Trizol法提取棉花总RNA

2.cDNA第一链的合成

按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书进行。

在0.25ml离心管中加入下列试剂：

Total RNA 5.0μl

Oligo(dT)₁₈ 1.0μl

2×ES Reaction Mix 10.0μl

ES Reverse Transcriptase 1.0μl

RNase-free Water to 20.0μl

轻轻吸打混匀，稍离心后，42℃保温50min，70℃加热15min。然后-20℃保存备用。

3.cDNA的5′加尾反应

(a)反应体系：

cDNA 20.0μl

5×TdT Buffer 10.0μl

0.1％BSA 5.0μl

100mM dCTP 1.0μl

TdT 1.0μl

ddH₂O Up to 50.0μl

(b)37℃保温30min。

(c)加100μl无水乙醇，-20℃沉淀30min。

(d)12,000rpm，室温离心5min。弃上清，干燥后加适量ddH₂O回溶。

4.cDNA全长序列的获得

4.1用简并引物进行PCR反应获得GhMPK7中间片段体系如下：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1.0μl

P1(10μM) 1.0μl

P2(10μM) 1.0μl

cDNA 1.0μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 25.0μl

反应程序为：

94℃5min

72℃5min

反应完毕后，电泳检测结果并回收正确片段。取PCR产物4μl与克隆载体pMD18-T连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD18-T Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至LB液体培养基中培养3h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA，质粒PCR和酶切鉴定正确后进行序列测定。

4.25′RACE获得5′端序列

(a)用上述反转录产物进行PCR，体系如下：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1.0μl

AAP(10μM) 1.0μl

5P1(10μM) 1.0μl

cDNA 1.0μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 25.0μl

(b)反应程序为：

94℃5min

72℃5min

(c)同样的体系和反应程序以第一次PCR产物为模板做二次PCR，引物为AUAP和5P2。

(d)将所得片段回收后与克隆载体pMD18-T相连。取连接产物4μl转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。

4.33′RACE获得3′端序列

(a)用上述反转录产物进行PCR，体系如下：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1.0μl

B26(10μM) 1.0μl

3P1(10μM) 1.0μl

cDNA 0.5μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 25.0μl

(b)反应程序为：

94℃5min

72℃5min

(c)以同样的体系和反应程序，用第一次PCR产物为模板做二次PCR，引物为B25和3P2。

(d)将所得片段回收后与克隆载体pMD18-T相连。取连接产物4μl转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定后进行序列测定。

4.4cDNA全长序列的获得

根据已测定序列及其重叠区域，拼接出目的基因的全长cDNA，设计引物QP1和引物QP2，PCR扩增全长序列作进一步的验证。

(a)反应体系：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1.0μl

QP1(10μM) 1.0μl

QP2(10μM) 1.0μl

cDNA 0.5μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 50.0μl

(b)反应程序：

94C5min

72℃5min

(c)将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。

5.同源检索：利用BLAST软件将分离出的全长cDNA序列与GenBank中的序列进行比较。

实施方式(二)：棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7的序列见SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2。

实施方式(三)：表达载体的构建

(1)根据分离出的GhMPK7基因的核苷酸序列，设计引物：

正向引物：5′TCTAGAATGGCGACGCTTGTGGAGC-3′

划横线部分为Xba I酶切位点

反向引物：5′GTCGACCCTAAGCATTGGCAGATACAGCC-3′

划横线部分为Sal I酶切位点

以棉花幼叶的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应。

(2)取PCR产物4μl与pMD18-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD18-T Simple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至LB液体培养基中培养3h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。

(3)以步骤(2)所得质粒为模板，进行质粒PCR。所得PCR产物带有Xba I和Sal I酶切位点。将PCR扩增得到目的片段用限制性内切酶Xba I和Sal I酶切并回收，与用相同的限制性内切酶酶切并回收的pBI121表达载体连接。连接体系如下：

目的片段DNA 3.0μl

载体DNA 5.0μl

10×T4连接酶缓冲液 1.0μl

T4连接酶 1.0μl

混匀后16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后在含卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定。

(4)将构建好的表达载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞，本发明采用的是冻融法转化农杆菌。

实施方式(四)：转基因植物的获得

(1)野生型本生烟种子播种于MS基本培养基中，至5-6片真叶期，备用。

(2)挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡那霉素的YEP培养基中，28℃，250rpm，振荡培养约48h，至对数生长后期；将菌液用MS培养液稀释10倍，待用。

(3)取烟草叶片，剪成小块(0.5×0.5cm)，将剪好的烟草叶片置于MS预分化培养基中，28℃，光照时间16h/d，光照强度2,000Lux，预培养2d。

(4)将预培养后的烟草叶片浸入菌液5-10min，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入MS基本培养基；弱光下，28℃共培养2d。

(5)共培养后的外殖体先用含羧苄青霉素250mg/L的无菌水洗涤3次，再用含羧苄青霉素250mg/L的MS培养液洗1次，然后用灭菌滤纸吸干，转入含有卡那霉素100mg/L，羧苄青霉素250mg/L的MS选择培养基上，恒温培养(条件同预培养)；每15d更换一次培养基。

(6)待芽长至1cm左右时，切下，移入MS生根培养基(附加卡那霉素50mg/L，羧苄青霉素250mg/L)中，促其生根。

(7)根系发育好后(5-6片叶)，移入盛有无菌土的花盆中，温室常规管理。

实施方式(五)：转基因烟草的分子鉴定

由于本发明所用的植物表达载体使用CaMV 35S启动子驱动目的基因的表达，所以根据CaMV 35S启动子序列和GhMPK7的cDNA序列设计引物，用CTAB法提取的再生苗基因组DNA为模板，进行PCR鉴定。

实施方式(六)：转基因烟草抗真菌病害能力分析

为了确定转基因植株的功能，我们对T2代转基因植株进行抵抗真菌病害能力分析。

(1)将T2代转基因烟草种子种在装有无菌土的花盆中，待长至5片真叶期时，经PCR鉴定后备用。

(2)烟草炭疽和赤星病菌的培养：将烟草炭疽和赤星病菌分别接种于新的马铃薯固体培养基上，28℃暗培养。待培养两周后用一定量灭菌的蒸馏水收集孢子。孢子浓度均为1×10⁶/mL。

(3)取不同株系生长状态良好且均一的转基因烟草和非转基因烟草叶片进行离体叶片接种烟草炭疽和赤星病菌。分别吸取20μl烟草炭疽和赤星菌液接种到离体叶片上，保持相对湿度80％，28℃暗培养3天。

(4)观察离体叶片接种病菌一周过程中的发病状况。

实验证实，接种烟草炭疽病菌2天后，非转基因烟草接种部位开始坏死，为暗绿色水渍状小斑。接种3天后，接种部位形成5mm左右的黑色圆斑，病斑中央稍凹陷，并有小黑点。而转基因烟草接种病菌2天后接种部位无明显变化，接种3天后接种部位形成极小的灰白色凹斑或无明显症状。接种烟草赤星病菌2天后，非转基因烟草接种部位出现黄褐色、圆形、直径1cm左右的斑点。接种3天后病斑的大小逐渐扩大，并逐渐变成褐色，病斑呈圆形或不规则圆形，直径可达2-3cm，病斑边缘明显，外围有淡黄色晕圈。病斑中心有深褐色或黑色霉状物，为病菌分生孢子和分生孢子梗。转基因烟草接种病菌2天后接种部位无明显变化。接种3天后接种部位只出现微小的黄褐色枯斑或无明显症状。

通过转基因烟草抗真菌病害能力分析看出，转基因植株相对于非转基因植株对烟草炭疽和烟草赤星病原菌具有明显的抗性。可将该基因转化小麦、玉米、棉花等农作物或植物，提高其抗真菌病害，尤其是炭疽和赤星病菌的能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。

序列表

<110>山东农业大学

<120>棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7及其应用

<160>2

<210>1

<211>1564

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium hirsutum)

<220>

<221>CDS

<222>(288)...(1391)

<223>

<220>

<221>5′UTR

<222>(1)...(287)

<223>

<220>

<221>3′UTR

<222>(1392)...(1564)

<223>

<400>1

acttttattt ctagggaaca caaatgaaag gaattttttt ctttttttct tttagtggtg 60

gaatgatctc aaagttgtga atttgaagct ggtttagagg ttgaagaaaa gggtaaaaaa 120

aaaatggggt tctttttttt ttttggaaga aatgaagacc aaagtttgga attttacaga 180

ggaataattt gaaagtttgg gtttttcaaa tctactttct aggggaaagg agaaaaaaaa 240

agtgaagaag ctgatttaga aaagatcaaa gcaagaattt cccaaaaatg gcg acg ctt 299

Met Ala Thr Leu

1

gtg gag cca cca aat gga gtg aag cca aaa gga aag cat tac tat tca 347

Val Glu Pro Pro Asn Gly Val Lys Pro Lys Gly Lys His Tyr Tyr Ser

5 10 15 20

atg tgg caa acc ctt ttc gag atc gac acc aaa tat gtt cca atc aag 395

Met Trp Gln Thr Leu Phe Glu Ile Asp Thr Lys Tyr Val Pro Ile Lys

25 30 35

cct ata gga aga ggt gca tac ggc ata gtt tgc tct gca atc aac agg 443

Pro Ile Gly Arg Gly Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ser Ala Ile Asn Arg

40 45 50

gaa acc aac gag aaa gtg gct ata aag aag atc aac aac gtg ttc gag 491

Glu Thr Asn Glu Lys Val Ala Ile Lys Lys Ile Asn Asn Val Phe Glu

55 60 65

aac cgt gtt gat gct ttg aga act ttg agg gaa ctg aaa ctt ctc aga 539

Asn Arg Val Asp Ala Leu Arg Thr Leu Arg Glu Leu Lys Leu Leu Arg

70 75 80

cac att cga cac gag aac gtg ata gct ttg aaa gat gtt atg atg cca 587

His Ile Arg His Glu Asn Val Ile Ala Leu Lys Asp Val Met Met Pro

85 90 95 100

att cag aga atc ggt ttt aag gat gtt tat ttg gtt tat gag ctt atg 635

Ile Gln Arg Ile Gly Phe Lys Asp Val Tyr Leu Val Tyr Glu Leu Met

105 110 115

gac acc gat ttg cat cag att atc aag tct cct cag ccg ctt tct aat 683

Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Lys Ser Pro Gln Pro Leu Ser Asn

120 125 130

gat cat tgc aag tat ttt att ttt cag ttg cta cga ggg ctg aag tac 731

Asp His Cys Lys Tyr Phe Ile Phe Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr

135 140 145

ctc cac tcg gca aac atc ctt ctc cga gat ttg aag ccc ggg aac ctt 779

Leu His Ser Ala Asn Ile Leu Leu Arg Asp Leu Lys Pro Gly Asn Leu

150 155 160

ctt gtc aat gca aac tgt gac ctg aag ata tgt gat ttt ggg ctg gct 827

Leu Val Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala

165 170 175 180

cga acc agc aga ggc aac gaa caa ttc atg aca gag tat gtt gtc acc 875

Arg Thr Ser Arg Gly Asn Glu Gln Phe Met Thr Glu Tyr Val Val Thr

185 190 195

cgc tgg tac cgt gca cct gag ctc cta ctc tgt tgt gat aat tat ggg 923

Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Cys Cys Asp Asn Tyr Gly

200 205 210

acc tcc att gat gtt tgg tcg gta gga tgc atc ttt gcg gag att ctt 971

Thr Ser Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Ala Glu Ile Leu

215 220 225

ggt cgg aaa cca atc ttt cct gga acg gaa tgc ctc aac cag ctt aag 1019

Gly Arg Lys Pro Ile Phe Pro Gly Thr Glu Cys Leu Asn Gln Leu Lys

230 235 240

ctg att atc aat gtt ctc gga agt caa caa gag gcc sac att cag ttt 1067

Leu Ile Ile Asn Val Leu Gly Ser Gln Gln Glu Ala Asn Ile Gln Phe

245 250 255 260

att gat aat ccc aaa gct cga cgg tac atc aag tca ctt ccg tac tct 1115

Ile Asp Asn Pro Lys Ala Arg Arg TyrIle Lys Ser Leu Pro Tyr Ser

265 270 275

agg ggc acc cac ttt tcc ctt tta tac cca caa gcc gat cca tta gcc 1163

Arg Gly Thr His Phe Ser Leu Leu Tyr Pro Gln Ala Asp Pro Leu Ala

280 285 290

ata gat ttg ttg caa agg atg ctt gtt ttc gac cca tca aag aga atc 1211

Ile Asp Leu Leu Gln Arg Met Leu Val Phe Asp Pro Ser Lys ArgIle

295 300 305

acc gtc aca gaa gca ctc cta cat cca tac ctg tta ggg ctg tat gat 1259

Thr Val Thr Glu Ala Leu Leu His Pro Tyr Leu Leu Gly Leu Tyr Asp

310 315 320

cca agg tgc aat cca cct gct caa gtc cca att gat ctt gag ata gat 1307

Pro Arg Cys Asn Pro Pro Ala Gln Val Pro Ile Asp Leu Glu Ile Asp

325 330 335 340

gag aac atg gga gaa tcg atg atc agg gag atg atg tgg agt gaa atg 1355

Glu Asn Met Gly Glu Ser Met Ile Arg Glu Met Met Trp Ser Glu Met

345 350 355

ctt cac tat cac cca gag gct gta tct gcc aat gct tag gtaacattgt 1404

Leu His Tyr His Pro Glu Ala Val Ser Ala Asn Ala ＊

360 365

tttcgctgct ttgttgtaat gtattttcgg aactgatatt tatcgattga actcaatgaa 1464

caatgttgag aattctggtg gtacccagat tttgttttac ttttaacatt cttgtttatt 1524

agtttatgat ttggttgtag cgaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1564

<210>2

<211>368

<212>PRT

<213>棉花(Gossypium hirsutum)

<400>2

Met Ala Thr Leu Val Glu Pro Pro Asn Gly Val Lys Pro Lys Gly Lys

1 5 10 15

His Tyr Tyr Ser Met Trp Gln Thr Leu Phe Glu Ile Asp Thr Lys Tyr

20 25 30

Val Pro Ile Lys Pro Ile Gly Arg Gly Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ser

35 40 45

Ala Ile Asn Arg Glu Thr Asn Glu Lys Val Ala Ile Lys Lys Ile Asn

50 55 60

Asn Val Phe Glu Asn Arg Val Asp Ala Leu Arg Thr Leu Arg Glu Leu

65 70 75 80

Lys Leu Leu Arg His Ile Arg His Glu Asn Val Ile Ala Leu Lys Asp

85 90 95

Val Met Met Pro Ile Gln Arg Ile Gly Phe Lys Asp Val Tyr Leu Val

100 105 110

Tyr Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Lys Ser Pro Gln

115 120 125

Pro Leu Ser Asn Asp His Cys Lys Tyr Phe Ile Phe Gln Leu Leu Arg

130 135 140

Gly Leu Lys Tyr Leu His Ser Ala Asn Ile Leu Leu Arg Asp Leu Lys

145 150 155 160

Pro Gly Asn Leu Leu Val Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp

165 170 175

Phe Gly Leu Ala Arg Thr Ser Arg Gly Asn Glu Gln Phe Met Thr Glu

180 185 190

Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Cys Cys

195 200 205

Asp Asn Tyr Gly Thr Ser Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe

210 215 220

Ala Glu Ile Leu Gly Arg Lys Pro Ile Phe Pro Gly Thr Glu Cys Leu

225 230 235 240

Asn Gln Leu Lys Leu Ile Ile Asn Val Leu Gly Ser Gln Gln Glu Ala

245 250 255

Asn Ile Gln Phe Ile Asp Asn Pro Lys Ala Arg Arg Tyr Ile Lys Ser

260 265 270

Leu Pro Tyr Ser Arg Gly Thr His Phe Ser Leu Leu Tyr Pro Gln Ala

275 280 285

Asp Pro Leu Ala Ile Asp Leu Leu Gln Arg Met Leu Val Phe Asp pro

290 295 300

Ser Lys Arg Ile Thr Val Thr Glu Ala Leu Leu His Pro Tyr Leu Leu

305 310 315 320

Gly Leu Tyr Asp Pro Arg Cys Asn Pro Pro Ala Gln Val Pro Ile Asp

325 330 335

Leu Glu Ile Asp Glu Asn Met Gly Glu Ser Met Ile Arg Glu Met Met

340 345 350

Trp Ser Glu Met Leu His Tyr His Pro Glu Ala Val Ser Ala Asn Ala

355 360 365

Claims

1.一种棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7，其特征在于它具有核苷酸序列SEQ.ID.NO.1；具有氨基酸序列SEQ.ID.NO.2。

2.根据权利要求1所示的核苷酸序列，其特征在于该基因选自棉花。

3.根据权利要求1所述的一种棉花新型抗真菌病害相关基因GhMPK7的应用，其特征在于该基因在本生烟中过量表达，能提高转基因烟草抗真菌病害，尤其是烟草炭疽和烟草赤星病菌的能力，该基因可应用在其它农作物或植物中以提高其抵抗真菌病害的能力。

4.一种植物表达载体，包含有权利要求1所述的核苷酸序列SEQ.ID.NO.1。