CN102046796B - 用于植物害虫控制的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及控制线虫侵扰。本发明公开了为了达到线虫侵扰减少通过给植物细胞提供重组DNA分子用于控制线虫侵扰的方法和组合物。本发明也涉及产生表达用于保护植物免遭线虫侵扰的重组DNA分子的转基因植物的方法。

Description

用于植物害虫控制的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2008年2月10日提交的美国临时申请61/027,473的优先权，该临时申请的全部公开内容通过参考引入本文。

计算机可读形式序列表的参考引入

序列表是本申请公开内容的一部分，包括96KB的计算机可读形式的文件，文件名为“MNDI005WOsequence”，其中包含通过EFS-Web提交的本发明的核苷酸序列。序列表的主题全部通过参考并入本文。

发明背景

1.技术领域

本发明涉及用于植物中害虫或病原体控制的方法和组合物。更具体地，公开了包含重组DNA的转基因植物细胞、植物和种子，以及制备和使用这些与害虫抗性有关的植物细胞、植物和种子的方法。

2.相关技术说明

植物和动物是许多线虫害虫的感染目标。因此，希望有保护植物免遭线虫感染的改良方法，因为这样的方法将提高食品生产的产量和稳定性。

存在大量的植物寄生线虫种，包括各种胞囊线虫(例如异皮线虫属(Heterodera)的种)、根结线虫(例如根结线虫属(Meloidogyne)的种)、根腐线虫(例如短体线虫属(Pratylenchus)的种)、剑线虫(例如剑线虫属(Xiphinema)的种)以及茎和鳞茎线虫(例如茎线虫属(Ditylenchus)的种)等。垫刃线虫(垫刃目(Tylenchida)的成员)，包括异皮科(Heteroderidae)、根结科(Meloidogynidae)和短体科(Pratylenchidae)，是最大的和在经济上最重要的植物寄生线虫类别。其它重要的植物寄生线虫包括矛线目(Dorylaimid)线虫(例如剑线虫属(Xiphinema)的种)等。线虫种通过一系列的生命周期阶段和蜕皮生长。一般而言，有5个阶段和4次蜕皮：卵阶段；J1(即，第一幼虫阶段)；M1(即，第一蜕皮)；J2(第二幼虫阶段；有时从卵孵化)；M2；J3；M3；J4；M4；A(成年)。幼年(“J”)阶段有时也被称为幼虫(“L”)阶段。基因表达可能对于一个或多个生命周期阶段是特异性的。线虫已经进化成为非常成功的植物和动物的寄生虫，并且导致农业和家畜的显著的经济损失，以及人类的发病率和死亡率。植物的线虫寄生虫可以寄居于植物的所有部分，包括根、开放的花蕾、叶和茎。植物寄生虫根据食性被大体分类为迁移外寄生物(migratory ectoparasites)、迁移内寄生物(migratoryendoparasites)和栖息内寄生物(sedentary endoparasites)。栖息内寄生物，包括根结线虫(根结线虫属(Meloidogyne)的种，RKN)、胞囊线虫(球胞囊线虫属(Globodera)和异皮线虫属(Heterodera)的种)和肾形线虫属(Rotylenchulus)的种)，诱导取食部位，并且在根内建立长期感染，这对作物通常具有非常大的损伤。线虫感染是农业上重要的许多作物耕种中的一个重要问题。例如，大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines，SCN)被认为引起大豆产量损失，据估计北美每年损失超过10亿美元。这种损伤是胞囊线虫引起的大豆植物矮缩的结果。矮缩植物具有较小的根系，在其叶中显示矿物质缺乏的症状，并且容易枯萎。据估计寄生线虫在全世界每年导致园艺和农业损失超过780亿美元，基于估计的全部主要作物的平均12％的年损失。

控制植物病害的传统方法是采用化学处理和构建抗性作物与其野生型亲属之间的种间杂种作为抗性种质的来源。化学线虫控制剂在消灭线虫侵扰方面无效。由于缺乏选择性，化学线虫控制剂也对非目标动物群发挥作用，通常在应用线虫控制剂后的一段时间里有效地使田地贫瘠化。已知杀线虫剂如涕灭威及其环境分解产物对哺乳动物有很高的毒性。因此，政府对这些化学品的使用进行限制。最广泛使用的杀线虫剂，甲基溴，按计划将很快退出使用，目前，还没有有前途的候选物来代替这种处理。

利用植物生物技术的方法已经提供了有效的控制昆虫侵扰的手段，例如，通过昆虫控制剂的植物表达。据报道生物技术相关的线虫控制剂通常是植物表达的核苷酸，当被线虫摄入时对目标线虫选择性地具有毒性。但是，几乎没有利用生物技术方法有效控制线虫感染的例子。

发明内容

一方面，本发明提供作为植物线虫控制剂有效的试剂。在一个实施方案中，有效的化合物是以前不知其对植物寄生线虫有毒的甲基酮类(methylketones)。另外，本发明人发展了在线虫感染的植物根部表达甲基酮类如2-十一烷酮、2-十三烷酮和2-十五烷酮以降低或抑制线虫生长、发育或线虫感染引起的植物病害的组合物和方法。在具体的实施方案中，该方法包括产生含有一个或多个转基因的转基因植物，所述转基因允许在对线虫感染敏感的植物组织中产生2-十一烷酮、2-十三烷酮和/或2-十五烷酮。

另一方面，本发明提供构建和使用包含甲基酮合酶编码区的转基因表达盒以及在植物细胞中，特别是在植物的根细胞中表达该合酶的方法。本发明提供包含转基因的转基因植物，其中转基因植物的根产生甲基酮。在特定实施方案中，甲基酮合酶转基因还包含序列区，该序列区包含与甲基酮合酶编码区可操作连接的异源质体转运肽分子。“异源”是指给定序列相对于任何其它参考序列不在其天然环境中。因此，当两个序列可以从同一物种中分离时，一个序列相对于第二个可操作连接的序列可能是异源的，将不是它们的天然方向。因此，与给定甲基酮合酶编码区可操作连接的异源转运肽不是在自然界中通常以与甲基酮合酶编码区可操作连接的未修饰状态发现的转运肽。

在本发明的另一方面，提供了包含SEQ ID NO：1或2的修饰的DNA编码序列，其编码SEQ ID NO：3的甲基酮合酶；提供了编码SEQ ID NO：5的甲基酮合酶的SEQ ID NO：4；并且提供了编码SEQID NO：7的甲基酮合酶的SEQ ID NO：6。在某些实施方案中，编码具有甲基酮合酶活性的多肽的DNA编码序列与所述SEQ ID NO中的任一个或多个具有至少大约80％、85％、90％、95％、98％或99％的百分序列同一性。

在本发明的再另一方面，提供了一种异源融合蛋白，该异源融合蛋白包含质体转运肽分子(如SEQ ID NO：9或11)和具有甲基酮合酶活性的甲基酮合酶分子(如SEQ ID NO：13、15、17、19、21、23、25或27)或甲基酮合酶分子变体(如SEQ ID NO：29、31、33、35、37或39)，或与所述SEQ ID NO中的任一个或多个具有至少大约80％、85％、90％、95％、98％或99％的百分序列同一性的甲基酮合酶分子。

在本发明的再另一方面，提供了包含异源酰基载体蛋白编码区的转基因表达盒，该酰基载体蛋白编码区编码酰基载体蛋白(如SEQ IDNO：41、43、45、47、49、51、53、55或57)，在植物组织中与包含甲基酮合酶编码区的转基因一起表达。

在本发明的再另一方面，提供了包含与甲基酮合酶编码区可操作连接的异源质体转运肽分子的转基因种子。该转基因种子还可以包含转基因表达盒，该转基因表达盒包含异源酰基载体蛋白编码区。

本发明的其它方面特别涉及转基因植物细胞，包含多种植物细胞、核和细胞器的转基因植物，和来自这些植物的后代转基因种子、胚、胚珠和转基因花粉。植物细胞及其部分选自用异源甲基酮合酶编码区转化的转基因植物细胞群体，并且还可包含异源酰基载体蛋白编码区，与不含异源编码区的细胞相比，是通过从包含异源编码区的任何群体中选择转基因植物细胞。

本发明也提供了生产非天然转基因种子的方法，该转基因种子可以用来生产具有害虫抗性的转基因植物作物，该害虫抗性是由于异源甲基酮合酶编码区的表达，在某些实施方案中，是由于异源酰基载体蛋白编码区在构成转基因植物的植物细胞的核或细胞器或细胞质中的共表达。本发明的各个方面特别可用于具有线虫抗性活性的转基因植物，包括但不限于：谷类，包括玉米、小麦、大麦、黑麦和水稻；蔬菜；番茄；马铃薯；苜蓿；豆类，包括菜豆、大豆、豌豆和紫花苜蓿；甘蔗；甜菜；烟草；棉花；油菜籽(油菜(canola))；向日葵；红花；和高粱。

本发明提供在其基因组内包含异源甲基酮合酶编码区并且还可包含异源酰基载体蛋白编码区的转基因大豆植物，其中所述植物对线虫感染具有抗性，或者显示减轻的由线虫感染引起的病害症状。

本发明进一步提供提高线虫耐受作物的产量的方法。该方法包括在线虫的存在下培育包含异源甲基酮合酶编码区的作物，该作物还可包含异源酰基载体蛋白编码区。

本发明的另一方面提供一种生产杂种种子的方法，包括从线虫耐受植物获得杂种种子，该植物也具有稳定整合的编码甲基酮合酶的异源核苷酸序列，并且还可整合有编码酰基载体蛋白的异源核苷酸序列。该方法进一步包括从由杂种种子长成的植物产生作物，其中由所述杂种种子产生的植物的一部分对于异源甲基酮合酶编码序列和(如果存在的话)异源酰基载体蛋白编码序列而言是纯合的，由所述杂种种子产生的植物的一部分对于异源甲基酮合酶编码序列和(如果存在的话)异源酰基载体蛋白编码序列而言是半合子，由所述杂种产生的植物的一部分没有异源甲基酮合酶编码序列或异源酰基载体蛋白编码序列；选择纯合的和半合子的植物；从选择的植物收集种子，并种植所述种子，以产生进一步的后代植物；从这些后代植物开始重复选择和收集步骤至少一次，以产生近交系；并且使该近交系与第二株系杂交，以产生杂种种子。本发明的植物选自但不限于玉米、大豆、棉花、油菜(芸苔)、小麦、向日葵、高粱、苜蓿、大麦、粟、水稻、烟草、番茄、马铃薯、水果和蔬菜作物、草皮草、甘蔗、甜菜和红花。

在本发明的另一方面，涉及对农业上重要的寄居于土壤的昆虫的控制，所述昆虫包括但不限于玉米根虫属(Diabrotica)、非耳象属(Diaprepes)、桔根象属(Pachnaeus)、短喙象属(Asynonychus)、厉眼蕈蚊属(Lycoriella)、蕈蚊属(Sciara)、Stenophlus和迟眼蕈蚊属(Bradysia)等。也涉及更广泛的杀螨、杀虫和驱虫性质。

发明详述

本发明涉及用于植物的害虫控制，特别是线虫控制的方法和组合物。一方面，本发明涉及控制、预防或处理转基因植物中的线虫感染。在一个实施方案中，该方法包括产生含有重组构建体的转基因植物，和表达这种构建体以使植物具有线虫抗性。重组构建体可包含编码一种或多种蛋白质的核苷酸序列，其中该序列与在植物细胞中具有功能性的异源启动子可操作地连接，以及用该重组构建体转化的细胞。包含(意思是包括但不限于)重组构建体的细胞可以是原核或真核细胞。特别是，它们可以是植物细胞。也涉及来源于这些转化的植物细胞的植物和种子。在一个实施方案中，本发明的转基因植物或其部分产生一种或多种脂肪酸化合物，其中至少一种是2-十三烷酮。2-十三烷酮是野生多毛番茄(Lycopersicon hirsutum)(Solanumhabrochaites)中产生的主要的甲基酮(占总挥发物含量的76％)(相比21％的2-十一烷酮和3％的2-十五烷酮；Fridman等人，Plant Cell17：1252-67，2005)。高等植物通过涉及酰基载体蛋白辅助因子(ACP)和脂肪酸合酶(FAS)酶复合物的代谢途径合成脂肪酸。FAS复合物由大约8个单独的酶组成，这些酶催化30个或更多的反应步骤，它们在植物中全都位于质体中。

本发明提供异源分子，该异源分子被导至植物的质体中，以由FAS复合物产生甲基酮，特别是2-十三烷酮，包括但不限于编码具有甲基酮合酶活性的多肽如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7的核苷酸，或GenBank登录号AY701574中给出的氨基酸序列。在某些实施方案中，具有甲基酮合酶活性的多肽(例如，允许产生甲基酮类，如2-十一烷酮、2-十三烷酮和2-十五烷酮)可与以下所示的任一种或多种氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：39。编码的多肽的功能也可以通过测定编码它的转基因的存在在减少线虫感染、生长、繁殖或症状方面的效能来确定。例如，在类似条件下，在包含编码甲基酮合酶活性的异源核苷酸构建体的转基因植物中，相对于对照植物，例如不包含该异源分子的其它等基因植物，虫瘿、胞囊或蠕虫数目减少20％或更多、25％或更多、50％或更多、80％或更多或95％或更多，表明存在功能性分子。

在某些实施方案中，被引导至植物质体中以产生甲基酮的本发明提供的异源分子在核苷酸水平上与如下所示的一种或多种序列可具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38；或SEQ ID NOs：58-61中的任一个。因此，在具体实施方案中，异源分子可包含编码异源叶绿体转运肽的序列，例如，但不限于，如SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11所示。

同样，在某些实施方案中，本发明的核苷酸还可包含编码如SEQID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55或SEQ IDNO：57中的任一个所示的酰基载体蛋白(例如ACP 1)的序列，或者可以包含编码与这些序列中任一个具有至少大约85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的酰基载体蛋白的序列。

本发明的另一方面提供生产和使用一种或多种甲基酮类如2-十三烷酮来控制线虫侵扰的方法。因此，提供了例如在植物细胞中产生甲基酮的方法。甲基酮然后可以在种植作物之前、期间或之后施加到土壤中，以控制或减少在土壤中生长的作物的线虫侵扰或症状。

除非另外指出，术语将根据相关领域普通技术人员的常规用法来理解。分子生物学常用术语的定义也可以在以下文献中找到：Rieger等人，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，5th edition，Springer-Verlag：New York，1991；and Lewin，Genes V，OxfordUniversity Press：New York，1994。DNA碱基的命名如United StatesCode of Federal Regulations，第1部分，1.822节的标题37所示。

本文使用的“转基因植物”是其中植物的一个或多个或全部细胞包含转基因的任何植物。转基因可以整合到核基因组或细胞器基因组内，或者可以是染色体外复制的DNA。术语“转基因”是指相对于它所引入的转基因微生物、植物、动物或细胞部分或完全为异源的、外源的核酸。构成植物的各种细胞和组织类型的细胞包括但不限于种子、根、叶、芽、花、花粉和胚珠。

“重组DNA”是具有通过内源和/或外源分子在转录单元中的组合、通过诱变、限制酶等的操作，或者仅仅通过插入多拷贝的天然转录单元而引入的遗传工程修饰的多核苷酸。重组DNA可包含从不同来源获得的DNA区段，或从相同来源获得的DNA区段，但是该DNA区段经过操作连接在自然中不以连接形式存在的DNA区段。分离的重组多核苷酸例如可以作为纯化的分子存在，或者整合到基因组内，如植物细胞或细胞器基因组或微生物质粒或基因组内。多核苷酸包含引起RNA在植物细胞中转录的连接的调节分子。

本文使用的“百分同一性”是指两个最佳比对的DNA或蛋白质区段在组分(例如核苷酸序列或氨基酸序列)的整个比对窗口上保持不变的程度。测试序列与参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对的区段的序列共有的相同组分数除以比对窗口上参考区段中序列组分的总数，该窗口是完整测试序列或完整参考序列中较小的那一个。“百分同一性”(“％同一性”)是同一性分数乘以100。

“表达”的意思是DNA转录产生RNA。得到的RNA可以是但不限于编码蛋白质的mRNA、反义RNA或用于RNAi技术的双链RNA。表达也可以指RNA的翻译，即，由mRNA产生编码的蛋白质。

本文使用的“启动子”是指用于初始化转录的调节DNA分子。“植物启动子”是能够启动在植物细胞中转录的启动子，无论其来源是否是植物细胞。例如，众所周知，某些土壤杆菌启动子在植物细胞中具有功能。因此，植物启动子包括从植物、植物病毒(特别是双链DNA病毒)和细菌如土壤杆菌属和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)细菌获得的启动子DNA。组成型启动子通常导致在植物的大多数或所有细胞中转录。特别是，如FMV启动子(FMV，美国专利6,051,753)、增强的35S启动子(E35S，美国专利5,359,142)、水稻肌动蛋白启动子(美国专利5,641,876)和各种嵌合启动子(美国专利6,660,911)等启动子在本发明中是有用的。在发育控制下的启动子的例子包括偏好在某些组织如叶、根或种子中启动转录的启动子。这些启动子被称为“组织偏好的”。只在特定组织中启动转录的启动子被称为“组织特异性的”。

相对于其它植物组织提供在根组织中增强表达的许多根特异性或根增强启动子或片段是本领域已知的(例如美国专利5,110,732、5,837,848；5,837,876；5,633,363；5,459,252；5,401,836；7,196,247；7,232,940；7,119,254；和7,078,589)。实例包括根增强的或根特异性的启动子，如CaMV-来源的as-1启动子或小麦POX1启动子(美国专利5,023,179)、酸几丁质酶基因启动子(Samac等人，Plant Mol.Biol.25：587-596(1994)；CaMV35S启动子的根特异性亚结构域(Lam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86：7890-7894(1989))；来自毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的根增强ORF13启动子(Hansen等人，Mol.Gen.Genet.254：337-343(1997)；用于烟草根特异性基因RB7的启动子(美国专利5,750,386)；和Conkling等人(Plant Physiol.93：1203-1211(1990)报道的根细胞特异性启动子。其它实例包括引导根特异性基因在水稻中转录的RCc2和RCc3启动子(Xu等人，PlantMol.Biol.27：237，1995)；大豆根特异性谷氨酰胺合成酶启动子(Hire等人，Plant Mol.Biol.20：207-218，1992)；四季豆GRP 1.8基因的根特异性控制元件(Keller和Baumgartner，Plant Cell 3：1051-1061，1991.)；毛根土壤杆菌甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子(Sanger等人，Plant Mol.Biol.14：433-443，1990)；和编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，它在大豆的根和根瘤中表达(Miao等人，PlantCell 3：11-22，1991)。也参见Bogusz等人，Plant Cell 2：633-641，1990，其中描述了两种从来自固氮非豆类糙叶山黄麻(Parasponiaandersonii)和相关非固氮非豆类山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的根特异性启动子。Leach和Aoyagi(1991)描述了对毛根土壤杆菌的高表达rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79：69-76)。其它根偏好的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，Plant Mol.Biol.29(4)：759-772，1995)；和rolB启动子(Capana等人，Plant Mol.Biol.25：681-691，1994)。线虫诱导的启动子的例子包括，例如，TobRB7启动子(Opperman等人，Science 263：221-223，1994)和美国专利6,262,344和7,193,136所述的启动子。

术语“抗性”或“耐受性”当用于比较转基因在转基因植物中的有效性时，是指转基因植物当暴露于线虫侵扰压力时，相对于类似条件下线虫敏感性非转基因植物呈现的表型，保持希望的表型的能力。抗性水平可以通过比较暴露或未暴露于线虫感染的转基因植物与非转基因植物的物理特性来确定。所观察的示例性的物理特性包括植物高度、能够在线虫攻击下存活的植物群体的增长(即，与寄生线虫接触的植物可以具有增强的根生长、增加的果实或谷粒产量，和繁殖线虫感染或群体增长率)。重组DNA的表达产物可能对线虫直接有毒(杀线虫)，或者可能影响迁移性、宿主发现、取食部位建立、繁殖力或具有其它线虫抑制效果。

“转化的种子”是由转化的植物产生的种子。转化的植物含有转化的细胞。转化的细胞是已经通过引入外源DNA分子而改变的细胞，或者在本发明中，包含异源甲基酮合酶或异源酰基载体蛋白或这两者的组合。

线虫包括但不限于植物寄生物种，例如，异皮线虫属(Heterodera)的种、球胞囊线虫属(Globodera)的种、根结线虫属(Meloidogyne)的种、肾形线虫属(Rotylenchulus)的种、纽带线虫属(Hoplolaimus)的种、刺线虫属(Belonolaimus)的种、短体线虫属(Pratylenchus)的种、长针线虫属(Longidorus)的种、拟毛刺线虫属(Paratrichodorus)的种、茎线虫属(Ditylenchus)的种、剑线虫属(Xiphinema)的种、锥线虫属(Dolichodorus)的种、螺旋线虫属(Helicotylenchus)的种、穿孔线虫属(Radopholus)的种、潜根线虫属(Hirschmanniella)的种、矮化线虫属(Tylenchorhynchus的种和毛刺线虫属(Trichodorus)的种，等等。

本发明提供重组DNA构建体，其包含当引入植物细胞中时赋予植物对线虫感染或线虫感染引起的植物病害的抗性的多核苷酸。这样的构建体一般也包含与所述多核苷酸可操作连接的启动子，以提供在植物细胞中的表达。其它构建体成分可以包括额外的调节分子，如5’前导区或3’非翻译区(如聚腺苷酸化位点)、内含子区和转运肽或信号肽。这样的重组DNA构建体可以采用本领域普通技术人员已知的方法装配。

根据本发明制备的重组构建体通常也包括3′非翻译DNA区(UTR)，该UTR一般在多核苷酸编码区后含有聚腺苷酸化序列。有用的3’UTR的例子包括但不限于来源于根癌土壤杆菌的胭脂氨酸合酶基因(nos)的3’UTR，编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶-加氧酶(rbcS)小亚基的基因，和根癌土壤杆菌的T7转录物。

构建体和载体也可包括用于靶向蛋白质产物的转运肽，特别是靶向至叶绿体、白色体或其它质体细胞器、线粒体、过氧化物酶体或液泡或胞外位置。关于叶绿体转运肽的应用的说明，参见美国专利5,188,642和美国专利5,728,925。许多叶绿体定位的蛋白质从核基因表达为前体，并且被叶绿体转运肽(CTP)靶向至叶绿体。其它这样的分离的叶绿体蛋白质的例子包括但不限于如美国专利7,193,133所述的与核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(EPSPS)和转运肽有关的蛋白质。已经在体内和体外证明，可以利用与异源CTP的蛋白质融合将非叶绿体蛋白质靶向至叶绿体，并且CTP足以将蛋白质靶向至叶绿体。已经证明，合适的叶绿体转运肽如拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS CTP(CTP2，Klee等人，Mol.Gen.Genet.210：437-442，1987)和矮牵牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(CTP4，della-Cioppa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：6873-6877，1986)的引入可将异源EPSPS蛋白序列靶向至转基因植物中的叶绿体。通过表达包含氨基末端CTP与草甘膦抗性EPSPS酶的融合蛋白产生草甘膦抗性植物是本领域技术人员公知的(美国专利5,627,061，美国专利5,633,435，美国专利5,312,910，EP 0218571，EP189707，EP 508909和EP 924299)。本领域技术人员应当认识到，可以制备各种嵌合构建体，该构建体利用CTP的功能性将各种甲基酮合酶或酰基载体蛋白输入到植物细胞质体中。

合适的植物转化方法实际上包括可以将DNA引入细胞中的任何方法，如直接输送DNA(例如，通过PEG介导的原生质体转化，通过电穿孔，通过用碳化硅纤维搅动，以及通过加速DNA包被的颗粒)，通过土壤杆菌介导的转化，通过病毒或其它载体。一种优选的植物转化方法是微粒轰击，例如，如美国专利5,015,580(大豆)、5,550,318(玉米)、5,538,880(玉米)、6,153,812(小麦)、6,160,208(玉米)、6,288,312(水稻)和6,399,861(玉米)和6,403,865(玉米)所述。

土壤杆菌介导的植物(特别是作物)转化的详细步骤包括，例如，美国专利5,004,863、5,159,135、5,518,908、5,846,797和6,624,344(棉花)；5,416,011、5,569,834、5,824,877、5,914,4516,384,301和7,002,058(大豆)；5,591,6165,981,840和7,060,876(玉米)；5,463,174和5,750,871(芸苔属的种，包括油菜籽和油菜)，和美国专利申请公开2004/0244075(玉米)、2004/0087030(棉花)和2005/0005321(大豆)所公开的步骤。土壤杆菌介导的转化的其它步骤在WO9506722(玉米)中公开。对于许多植物种，包括双子叶植物和单子叶植物，尤其包括花生(Cheng等人，Plant Cell Rep.，15：653，1996)；芦笋(Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5345，1987)；大麦(Wan和Lemaux，Plant Physiol.，104：37，1994)；水稻(Toriyama等人，Bio/Technology，6：10，1988；Zhang等人，Plant Cell Rep.，7：379，1988；小麦(Vasil等人，Bio/Technology，10：667，1992；Becker等人，Plant J.，5：299，1994)；紫花苜蓿(Masoud等人，Transgen.Res.，5：313，1996)；芸苔属的种(Radke等人，Plant Cell Rep.，11：499-505，1992)；和番茄(Sun等人，Plant Cell Physiol.，47：426-431，2006)，已经报道了类似的方法。转基因植物细胞和转基因植物也可以通过用其它载体转化获得，例如但不限于使用病毒载体(例如，烟草蚀纹病毒(TEV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)以及Edwardson和Christie，“The PotyvirusGroup：Monograph No.16”，1991，Agric.Exp.Station，Univ.of Florida提到的病毒、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或任何其它合适的克隆载体，使用合适的转化方案时，例如但不限于细菌感染(例如，如上所述使用土壤杆菌)、二元细菌人工染色体构建体，直接输送DNA(例如，通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄取、电穿孔、使用碳化硅纤维搅动，以及微粒轰击)。本领域普通技术人员应当清楚，可以使用各种转化方法，并且可以为了从任何数目的感兴趣的植物种产生稳定的转基因植物而进行改变。例如，稳定遗传的重组DNA构建体和小染色体的构建可以用作构建转基因植物的载体(美国专利7,235,716)。

本发明的植物包括但不限于金合欢、紫花苜蓿、莳萝、苹果、杏、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、黑莓、蓝莓、花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、油菜、哈密瓜、胡萝卜、木薯、菜花、芹菜、樱桃、香菜、柑橘、克莱门小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、苦苣、宽叶莴苣(escarole)、桉树、茴香、无花果、林木、葫芦、葡萄、柚子、蜜露、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭菜、柠檬、莱檬、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、燕麦、秋葵、洋葱、橙子、观赏植物、木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松树、菠萝、大蕉、李子、石榴、杨树、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、菊苣、萝卜、油菜籽、木莓、水稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香、橘子、茶、烟草、番茄、草皮草、葡萄藤、西瓜、小麦、山药、和西葫芦。作物被定义为为了产生一种或多种商业产品而栽培的植物。这样的作物或作物植物的例子包括但不限于大豆、油菜、芸苔、棉花(棉籽)、花生、向日葵、木豆、鹰嘴豆、等等，和谷物，如玉米、小麦、水稻、燕麦、小米、黑麦、等等。芸苔、油菜籽和菜籽油在本申请公开内容中作为同义词使用。

产生含有稳定整合的重组DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法优选地在组织培养基中并且在受控制的环境中实施。受体细胞目标包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、未成熟的胚或胚的部分、配子细胞如小孢子，花粉，精子和卵细胞。涉及可以再生能育植物的任何细胞，作为用于实施本发明的有用的受体细胞。愈伤组织可以从各种组织来源开始，包括但不限于未成熟的胚或胚的部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够增殖为愈伤组织的细胞可以作为用于遗传转化的受体细胞。用于制备本发明的转基因植物的实用的转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚的转化，和随后能育转基因植物的再生)，例如，在美国专利6,194,636和6,232,526和美国专利申请公开2004/0216189中公开。

在普通的转化实践中，在任何一个转化实验中只将DNA导入一小部分目标细胞中。标记基因通常用来提供鉴别那些被转基因DNA构建体转化的细胞的有效系统。优选的标记基因提供选择性标记，该选择性标记提供对选择剂如抗生素或除草剂的抗性。植物细胞可能耐受的任何抗生素或除草剂都可能是有用的选择剂。使可能被转化的细胞暴露于选择剂。存活细胞群体中将是那些通常以足以使细胞在选择剂的存在下存活的水平表达抗性基因的细胞。也可以进一步测试细胞，以证实重组DNA的整合。常用的选择性标记基因包括提供抗生素抗性的基因，所述抗生素如卡那霉素或巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、庆大霉素(aac3和aacC4)和草丁膦(bar或pat)、草甘膦(EPSPS)和麦草畏(麦草畏单加氧酶)。有用的选择性标记基因和选择剂的例子在美国专利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中说明。也可以使用可筛选的标记或报道基因，如提供目视鉴别转化体的标记。有用的可筛选的标记的非限制性实例包括，例如，表达通过作用于产色底物产生可检测颜色的蛋白质的基因(例如，β-葡糖醛酸酶，GUS，uidA，或萤光素酶luc)或其本身可以被检测，如绿色荧光蛋白(GFP，gfp)或免疫原性分子。本领域技术人员将认识到可以使用许多其它有用的标记或报道基因。

性状堆积和育种：

例如，通过表达其它转基因，本发明的重组DNA构建体可以与其它提供额外的农学性状的重组DNA堆积(例如在被转化植物的情况下，性状包括但不限于除草剂抗性、昆虫抗性、冷发芽耐受性、缺水耐受性、产量提高、质量提高、真菌、病毒和细菌病抗性)。本发明的重组DNA构建体也可以转化到携带天然害虫或病原体抗性基因的植物品种中，以提高抗性表型的效力。用于基因表达协调降低和/或提高的构建体在美国专利申请公开2004/0126845A1中公开。可以收获转基因能育植物的种子并用来长成在基因组中包含重组DNA构建体的本发明转基因植物的后代，包括杂种代。因此，除了用本发明的重组DNA构建体直接转化植物以外，也可以通过使具有重组DNA的第一植物与缺乏该构建体的第二植物杂交制备本发明的转基因植物。例如，重组DNA可以导入适合转化的植物系中，以产生转基因植物，该转基因植物可以与第二植物系杂交，以将重组DNA渗入得到的后代中。本发明的转基因植物可以与具有其它重组DNA或天然存在的提供一种或多种额外性状(例如但不限于除草剂抗性、害虫或病害抗性、环境应激抗性、养分含量改变、和产量提高)的遗传区的植物系杂交，以产生具有提供希望的靶序列表达行为和额外的性状的重组DNA的后代植物。一般来说，在这种用于组合性状的育种中，提供额外性状的转基因植物是雄性株系，而携带基本性状的转基因植物是雌性株系。这一杂交的后代分离，使得一些植物将携带两个亲本性状的DNA，而一些植物携带一个亲本性状的DNA；这些植物可以根据与亲本重组DNA相关的标记进行鉴定。携带两个亲本性状的DNA的后代植物可以与雌性亲本系回交多次，例如，通常6-8代，以产生与一个原转基因亲本系具有基本相同的表型但是具有另一转基因亲本系的重组DNA的后代植物。

本发明的转基因植物、植物部分、种子或后代植物可以加工为在商业上有用的产品。这些产品包括但不限于粗粉、面粉、油、干草、淀粉、汁液、蛋白质提取物和纤维。

实施例

以下实施例用来说明本发明的实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现在实施本发明中工作良好的技术。但是，本领域技术人员根据本公开内容应当理解，可以对公开的具体实施方案进行许多变化，而仍然获得相同的或相似的结果，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，应当明白，化学和生理相关的某些试剂可以替代此处公开的试剂，而将获得相同的或相似的结果。本领域技术人员明白的所有这些相似的替代和改变被认为包括在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

实施例1

本实施例说明各种甲基酮的惊人的杀线虫效果。在体外针对秀丽隐杆线虫(C.elegans)L1和L4幼虫和南方根结线虫(M.incognita)寄生前J2幼虫(在土壤中发现的散布幼虫阶段)测试了各种链长的甲基酮。如表1所示，对于中等长度的甲基酮类(10-14碳链长度)观察到杀线虫活性。该表显示对秀丽隐杆线虫L1和L4幼虫和南方根结线虫J2幼虫有效的各种甲基酮的体外IC30值(单位为百万分之一)。IC30被定义为秀丽隐杆线虫暴露4小时及南方根结线虫暴露24小时后30％的线虫被杀死时的甲基酮的浓度。

表1.各种甲基酮对线虫的体外效果

利用全植物分析来确定甲基酮类对大豆植物和番茄植物分别感染线虫大豆胞囊线虫和南方根结线虫的效力。将种子种植在2英寸方形塑料罐子中的100％沙子中，并生长成足以进行处理的大小。当大豆植物显示第一三叶开始出现时以及当番茄植物达到2-3叶阶段时，施加甲基酮化学处理。甲基酮处理后，向每个罐子中接种线虫，对于大豆，在收获前培养28天，而对于番茄，在收获前培养21天。

向4个罐子中的每一个的表面上施加5毫升适当的化学溶液，以确保避免接触植物的底部。在化学物质应用后立即用化学物质中的水湿充分润罐表面。每4个罐子1豪克化学物质大致等于每公顷1千克化学物质。标准试验采用4次重复。对于2kg/ha以上的施用量，称重希望的化学物质量加到30ml小瓶中(例如：8kg/ha施用量＝30ml小瓶中的8mg化学物质)。将化学物质溶解在2ml适当溶剂中，通常是丙酮。对于低于2kg/ha的施用量，称重2毫克化学物质加到小瓶中，并且溶解在2ml溶剂中。然后向单独的30ml小瓶中加入适量的化学浓缩物，并加入溶剂使体积达到2ml(实例：0.5kg/ha＝0.5ml浓缩物+1.5ml溶剂)。然后使用0.05％Triton X-100表面活性剂溶液使每种溶解的浓缩物达到总共20毫升。

将SCN或RKN线虫卵添加到蒸馏水中，以产生每升水1000个蠕虫状卵的浓度。化学处理后至少4小时，将卵加至处理过的罐子加未处理的对照植物。在罐子表面打一个大约1cm深的小洞。将1毫升线虫卵浆液施加到这个洞中。之后立即轻轻覆盖这个洞。测试植物的浇水限于防止萎蔫所需的最小体积，持续24小时的一段时间。24小时的限制浇水后，在试验期间进行正常的地下灌溉。

在温室研究中针对沙子中番茄根的南方根结线虫感染测试2-十一烷酮、2-十三烷酮和2-十五烷酮。番茄植物是对线虫感染敏感的商业品种(例如，Mountain Spring)，并且不积累在某些野生番茄种的叶毛状体中发现的甲基酮类。表2显示观察到的各种甲基酮针对接种到含番茄植物的处理过的罐子中的根结线虫(南方根结线虫)的高水平的杀线虫活性。在40千克/公顷(kg/ha)(100％对照)和8kg/ha(97％对照)时，2-十三烷酮在控制线虫诱导的虫瘿形成(galling)方面非常有效，而2-十一烷酮和2-十五烷酮也证明有线虫控制。列出的千克/公顷(kg/ha)施用量基于测试罐子的表面积；在这些分析中，1kg/ha等于大约1.65mg化合物/千克土壤。

表2.各种甲基酮对根结线虫病的活性

化合物	用量(kg/ha)	％形成虫瘿的根	％对照
				2-十一烷酮	40	21	65％
2-十一烷酮	8	39	35％
				2-十三烷酮	40	0	100％
2-十三烷酮	8	2	97％
				2-十五烷酮	40	38	37％
2-十五烷酮	8	45	25％
				未添加化合物	-	60	NA

也在温室中测定了2-十三烷酮对大豆中大豆胞囊线虫的控制(表3)。当在线虫接种前作为土壤浸湿施加2-十三烷酮时，在40kg/ha(96％对照，相对于未处理的)和8kg/ha(80％对照，相对于未处理的)时观察线虫控制(胞囊数/植物)。

表3.甲基酮对大豆的胞囊线虫感染的效果

实施例2

本实施例提供对使用的组合物的说明，或涉及单独或任意组合在控制植物寄生的线虫中的应用。表4提供组合物列表。包含选择表达盒和在细菌细胞中保持质粒必需的元件的作物转化基础载体用来装配当与在本发明中提供功能性的DNA区段可操作连接时提供调节活性的DNA区段(启动子，前导序列，内含子，3’UTR)。这些DNA区段的装配可以利用重组DNA技术领域公知的方法完成。本发明的DNA编码序列，如被鉴定为SEQ ID NO：1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、59、60和61的任一种或多种DNA分子，克隆并插入表达盒中或插入与表达盒的另一编码序列或遗传元件的可操作连接中。本领域技术人员可以选择并测试在植物组织中提供甲基酮的功能性表达的其它遗传元件。

表4.遗传元件的说明.

实施例3

本实施例描述了表达MKS的番茄或大豆转基因毛根的产生和线虫感染分析。毛根培养物允许根组织大规模地快速生长，可以如此处所述用于检测感兴趣的基因的有效性，用于控制作物的植物寄生的线虫侵扰。毛根的特征是快速生长、频繁分枝、斜向性和合成与完整植物根相同的化合物的能力(David等人，Biotechnology 2：73-76，1984)。位于毛根土壤杆菌的根诱导质粒Ri上的基因向植物基因组中转移和整合以及它们在其中表达(White和Nester，J Bacteriol.，141：1134-1141，1980)。这些类型的根在体外在不含激素的培养基中继续生长，也显示高度的遗传稳定性(Aird等人，Plant Cell Tiss.Org.Cult.15：47-57，1988)。土壤细菌毛根土壤杆菌将基因转化到宿主植物基因组中的天然能力导致在感染部位形成根。植物感染毛根土壤杆菌导致T-DNA在植物基因组中整合和表达，这引起毛根的发育。毛根培养物快速生长，显示斜向性根生长，并且在不含激素的培养基上高度分枝。

对于大豆毛根，毛根土壤杆菌株K599在LB、基本A或酵母提取物和蛋白胨(YEP)培养基上生长并保持。产生用于评价根腐或根结线虫的转基因番茄毛根培养物的方法与使用毛根土壤杆菌D1株没有明显不同。通过在受控制的条件下置于氯气中12-16小时，然后在洁净空气柜中充气至少30分钟，将大豆种子表面灭菌。种子在含有1/4MS的培养皿中发芽。

使用解剖刀创伤6天大的幼苗的胚轴或子叶。然后将创伤的子叶浸没在新鲜生长的含构建体的毛根土壤杆菌中，接着真空渗透。除了向1/4MS琼脂板添加抗生素头孢噻肟以防止毛根土壤杆菌随后生长以外，子叶在与种子发芽相同的条件下培养。从接种毛根土壤杆菌的胚轴或子叶上切下不定根。推断的转化的根在含有3％蔗糖加3g/lGelrite、BASTA和头孢噻肟的Gamborg′s B-5琼脂上培养。将通过选择的根转移到新鲜培养基中并保持。培养的根保持在设置在24-30℃的避光培养箱中。根在Gamborg′s B-5琼脂上保持。每2-4周切下一片根尖并转移到新鲜培养基中。

在毛根系选择后，将用于植物线虫生物测定的根转移到含有Gamborg′s B-5培养基的新鲜平板上，并且使之生长大约2周，以在接种根腐线虫或大豆胞囊线虫(SCN)或根结线虫(RKN)第二阶段幼虫的混合群体之前提供足够用于线虫感染的组织。各个毛根尖置于感染平板上。20个平板用于测试转化的根与根腐、SCN或RKN的反应。每个平板含有来自单独整合的转化的根。也测试了另外20个含有转化的根腐敏感的、SCN敏感的或RKN敏感的对照的平板和另外20个含有转化的SCN抗性或RKN抗性对照的平板。转化的对照是空载体。然后平板接种大约400个无菌根腐蠕虫或1000个无菌大豆胞囊线虫J2s或450个无菌南方根结线虫J2s，并且在26-28℃(SCN或RKN)或25℃或30℃(根腐线虫)孵育。

接种南方根结线虫后大约6周或接种大豆胞囊线虫后5周，从琼脂平板上取下感染的番茄或大豆毛根，计数虫瘿或胞囊的数目。对于SCN毛根平板，直接计数胞囊，而对于RKN，可以估计虫瘿的数目。虫瘿得分基于大小进行加权估计。在打分过程开始时建立等级。最小虫瘿给予1分，随着虫瘿面积逐渐增大，虫瘿得分增加。然后在实验中利用该等级评估每个平板上的每个虫瘿。对于番茄毛根中的RKN感染，在第42天对卵数目打分。感染后第42天，微波处理平板，并筛选，以收集根。将根称重，然后在10％漂白溶液中混合，并倾倒在一系列网筛上以除去根碎片，并收集卵。从每个平板上收集卵，并计数。对于根腐线虫，大约56天后通过将根置于充满含有50mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素的无菌水的玻璃碗中收获平板。经9-10天使蠕虫离开根后，在显微镜下计数蠕虫。为了确定重量，微波处理根碗以熔化琼脂，并用网筛收集根。额外的水用纸巾吸收，并且记录根重量。

准备无菌根腐、SCN和RKN幼虫用于毛根培养系统。无菌SCN J2如下产生。收集清洁的大豆胞囊线虫卵(即，已除去土壤和其它碎片的卵)，并置于含有30ml 10％漂白溶液的50ml离心管中。轻轻搅拌该漂白溶液，然后静置2-3分钟。再次轻轻搅拌小瓶，以重悬浮卵，然后以1000rpm离心1分钟。在无菌柜中，将漂白溶液移除到容器中，向装有卵的小瓶中添加25ml无菌水。在无菌柜中重新盖上小瓶，轻轻搅拌以重悬浮卵，并以1000rpm离心1分钟。在无菌柜中，倒掉该液体，再将25ml无菌水加至小瓶中。在无菌柜中重新盖上小瓶，重复搅拌和离心过程。使用无菌水洗涤卵的过程重复大约4次，以充分漂洗卵中的漂白剂。在无菌柜中最后一次漂洗后，除去液体，获得大约1-2ml的卵浓缩物。无菌卵通过在置于5mM硫酸锌溶液中的潮湿滤纸表面孵育而孵化，该溶液的深度恰好覆盖滤纸的表面。2-3天后，将J2幼虫收集在滤纸下的溶液中。离心J2，并使用氯己定进一步清洁(Atkinson等人，J.Nematol.28：209-215，1996)。

通过将切碎的RKN感染的根与足量的10％漂白溶液置于混合器中收集卵，由此准备无菌RKN幼虫。混合器以5秒的间隔脉冲开/关。该过程重复5-6次。使根浆液通过一系列网筛，其中卵和小碎片收集在500微米的网筛中。从该卵/碎片充分漂洗剩余的任何漂白溶液。将20毫升卵/碎片加到50ml锥形试管中，并将20ml 40％蔗糖溶液加到试管底部，使总体积为40毫升。该溶液然后以3750rpm离心5分钟，以从碎片中分离卵。离心后，除去卵，充分漂洗，以除去剩余的任何蔗糖溶液。然后将卵置于含有用刚好足够覆盖卵的充气自来水润湿的滤纸的孵化碗中。1-2天后，将J2幼虫收集在滤纸下的溶液中。离心J2幼虫，并使用氯己定进一步清洁(Atkinson等人(1996，见上)。

由在玉米外植体平板上生长的根腐线虫准备无菌根腐幼虫。通过将根与培养基置于灭菌玻璃碗中由金属丝网筛支持的滤纸上收获线虫，该碗充满含有50mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素的无菌水。水的量足以淹没琼脂，将碗储存在室温(25℃)下2天。移除网筛，将溶液倾倒到50ml锥形试管中，然后在室温下以3500xg离心5分钟。在蠕虫沉到试管底部后(再温育15分钟)，倒出上清液。然后将灭菌水加到含有12mg/L抗真菌化合物Imazilil和50mg/L卡那霉素的蠕虫沉淀物中。

下面是在用于控制毛根中植物寄生线虫感染的各种启动子、转运肽和甲基酮合酶编码序列组合的转基因表达后发现的结果。对转基因大豆毛根接种板中的SCN胞囊进行计数，将每个重复的平均胞囊数(重复1和重复2)制表。表5所示的结果证明含有嵌合CTP-甲基酮合酶编码区的转基因大豆根提供对SCN感染的抗性，其中所有具有与甲基酮合酶融合的异源CTP的处理显示平均胞囊计数与转基因空载体对照4211相比减少。缺乏异源CTP的构建体(FMV-LsMKS1和FMV-LhMKS1)不显示胞囊计数减少。

表5.表达MKS的转基因大豆根减少SCN感染(胞囊).

从下面的表6可以看出，具有或不具有特定靶向活性位点突变的含有CTP前导区的MKS构建体的表达导致根结线虫感染植物根的能力降低。除了上表列出的元件以外，所示构建体含有并入融合甲基酮合酶转录物的5’非翻译区(UTR)的约540个核苷酸序列的肌动蛋白7内含子，和在T-DNA中共表达的可视荧光DsRED标记(由FMV启动子驱动)，其位于MKS开放阅读框下游。

表6.表达MKS的转基因番茄根减少根结线虫感染(卵)

对照	测试构建体	测试构建体	测试构建体
				8221	E35sp-ctp2/LsMKS1	E35sp-ctp2/LsMKS1 sN	E35sp-ctp2/LsMKS1 sd
1884.5	968.5	-	1333.4
				3059.8	1927.4	-	1558
716.7	-	283.3	298.1

从下面的表7可以看出，具有或不具有特定靶向活性位点突变的含有CTP前导区的MKS构建体的表达导致根腐线虫感染植物根的能力降低。除了上表列出的元件以外，所示构建体含有并入融合甲基酮合酶转录物的5’非翻译区(UTR)的约540个核苷酸序列的肌动蛋白7内含子，和在T-DNA中共表达的可视荧光DsRED标记(由FMV启动子驱动)，其位于MKS开放阅读框下游。

表7.表达MKS的转基因番茄根减少根腐线虫感染(幼虫)

对照	测试构建体	测试构建体	测试构建体
				8221	E35sp-ctp2/LsMKS1	E35sp-ctp2/LsMKS1 sN	E35sp-ctp2/LsMKS1 sd
5857.8	4842.4	3926.2	4897.2

实施例4

本实施例描述了可用于产生转基因大豆植物和转基因种子的植物转化方法。其它方法是植物细胞转化领域已知的，可以利用本发明的DNA构建体进行。

对于土壤杆菌介导的转化，大豆种子发芽过夜，并且切下分生组织外植体(参见美国专利No.7,002,058)。将分生组织和外植体置于创伤容器中。大豆外植体和诱导的来自含有具有本发明表达盒和植物选择性标记盒的质粒DNA的菌株的土壤杆菌细胞在从种子发芽开始起的大约14小时内混合，并利用超声处理创伤。创伤后，将外植体置于共培养物中2-5天，此时转移到选择培养基中6-8周，以允许对转基因芽进行选择和生长。大约6-8周后收获性状阳性的芽，并置于选择性生根培养基中2-3周。将生根的芽转移到温室中，并盆栽在土壤中。将选择后保持分离但不生根的芽转移到非选择性生根培养基中另外2周。在转移到温室并盆栽在土壤中之前，对选择后生根的任何芽的根检测植物选择性标记的表达。另外，如美国专利5,015,580所述，可以通过微粒轰击将DNA构建体转移到大豆细胞基因组中，并且细胞再生为能育的大豆植物。

用本发明的重组DNA转化转基因大豆植物细胞。选择提供害虫抗性，特别是线虫抗性的被转化植物细胞的后代转基因植物和种子。

实施例5

利用大豆胞囊线虫罐试验来评估包含甲基酮合酶编码序列的转基因大豆植物对大豆胞囊线虫对根的感染和繁殖的抗性。直径为3或4英寸的方罐中填满干净的沙子，并且充分浇水。在罐的中心种植转基因和对照大豆种子或任何生根的植物部分，每罐一个，并且充分浇水，以除去气穴。将罐子在温室或生长室中20℃至30℃温育，直到植物达到合适的接种年龄。从种子开始的大豆一般在种植后2-3周接种，而移植物在种植后1-3天接种。测试接种物由来自从土壤和侵扰的大豆植物根中收集的成熟大豆胞囊线虫胞囊的卵组成。利用250微米网筛收集胞囊，然后在Tenbroeck玻璃组织匀浆器中破碎，以释放卵。通过筛选和在40％蔗糖溶液上以4000RPM离心5分钟对卵进一步纯化。用于实验的接种物由每mL含有500个蠕虫状卵的水组成。将5mL卵悬浮液加到含有测试植物的沙子表面上，并对卵略微浇水。然后将测试植物放回温室或生长室中，温育3-4周，以允许根感染和胞囊形成。然后通过轻轻除去罐子和沙子并在水中漂洗收获根。线虫感染的严重程度通过计数附着到根系上的线虫胞囊数来确定。可替代地，沙子和根可以在水中稀释，并通过250微米的筛子，以收集和浓缩胞囊，用于储存或计数。

实施例6

本实施例描述了转基因植物细胞中重组DNA构建体的检测和测定。检测或测定本发明的转基因植物细胞中重组DNA构建体的转录可以通过任何合适的方法完成，包括蛋白质检测方法(例如，Western印迹法、ELISA和其它免疫化学方法)、酶活性测定或核酸检测方法(例如，Southern印迹法、Northern印迹法、PCR、RT-PCR、荧光原位杂交)。这些方法是本领域普通技术人员周知的，大量可以获得的手册可以证明；参见，例如，Joseph Sambrook and David W.Russell，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(第三版)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY，2001；Frederick M.Ausubel等人(编著)“Short Protocols in Molecular Biology”(第五版)，John Wiley and Sons，2002；John M.Walker(editor)“Protein Protocols Handbook”(secondedition)，Humana Press，2002；和Leandro(编著)“TransgenicPlants：Methods and Protocols”，Humana Press，2004。

本发明提供的DNA序列信息允许制备能够与此处公开的选择的多核苷酸的DNA序列特异性杂交的相对较短的DNA(或RNA)序列。本发明公开的多核苷酸包括SEQ ID NO：1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、59、60和61。在这些方面，制备适当长度的核酸探针。核酸探针与这些基因编码序列中的一种或多种特异性杂交的能力使它们特别可用于多种实施方案中。最重要的是，探针可以在多种检测给定样品中互补序列的存在的分析中使用。

在某些实施方案中，使用寡核苷酸引物是有利的。使用本发明多核苷酸序列的一部分设计这些引物的序列，它们与用于利用PCR^TM技术检测、扩增定义的多核苷酸区段的序列同源或互补(A Guide toMethods and Applications，Academic Press：San Diego，1990)。PCR引物对可以来源于已知序列，例如，通过使用用于该目的的计算机程序，如Primer(Version 0.5，(1991，Whitehead Institute for BiomedicalResearch，Cambridge，Mass.)。基于此处公开的序列的引物和探针可以用来证实，并且在必要时，用来通过常规方法修饰公开的序列，例如，通过再克隆和再测序。示例性的PCR反应条件可以包括：成分量/体积需要的亚文库等份1μl基因特异性引物1，1μl(100pmol，GenomeWalker^TM)衔接子引物1(AP1)，1μl dNTP混合物(每种dNTP各10mM)，1μl DMSO 2.5μl(或2-5％终浓度)10X PCR缓冲液，5μl(1X终浓度)Amplitaq Gold^TM，0.5μl蒸馏水，至最终反应体积为50μl，主PCR的反应条件：

A.95℃9分钟；

B.94℃2秒，70℃3分钟；重复94℃/70℃循环总共7次；

C.94℃2秒，65℃3分钟；重复94℃/65℃循环总共36次；

D.65℃.4分钟，作为最终延伸；

E.10℃.延长温育。

巢式PCR(次PCR反应)成分量/体积需要的1∶50稀释的主PCR反应；1μl基因特异性引物2；1μl(100pmol，GenomeWalker^TM衔接子引物2；1μl或3(AP2或AP3)，dNTP混合物(每种dNTP各10mM)；1μl DMSO；2.5μl含有MgCl₂的10X PCR缓冲液；5μl(1X终浓度)AmplitaqGold^TM；0.5μl蒸馏水，至最终反应体积为50μl反应。巢式PCR的条件：

A.95℃9分钟；

B.94℃2秒，70℃3分钟；重复94℃/70℃循环总共5次；

C.94℃2秒，65℃3分钟；重复94℃/65℃循环总共24次；

D.65℃4分钟，作为最终延伸；

E.10℃延长温育.

熟练技术人员在产生扩增子的方法中可以从所述的条件改变PCR条件。

外来基因在转基因植物中的表达的检测通过免疫学方法进行监测，例如ELISA(酶联免疫吸附测定)，用于定量测定获得的相应蛋白质的水平。转基因植物叶中编码蛋白质的定量测定利用ELISA进行，例如，如Clark等人，：ELISA Techniques.In：Weissbach A，Weissbach H(eds)Methods in Enzymology 118：742-766，Academic Press，Florida(1986)所述。

此处引用的所有出版物和专利都全文通过参考并入本文。

Claims (22)

1.编码与异源转运肽可操作连接的植物甲基酮合酶的多核苷酸。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所述植物甲基酮合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示，其中所述多肽具有甲基酮合酶活性。

3.权利要求1的多核苷酸，其中所述转运肽是叶绿体转运肽。

4.权利要求3的多核苷酸，其中所述叶绿体转运肽选自EPSPS叶绿体转运肽、小亚基核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶叶绿体转运肽、铁氧还蛋白叶绿体转运肽、铁氧还蛋白氧化还原酶叶绿体转运肽、集光复合蛋白I和蛋白II叶绿体转运肽和硫氧还蛋白F叶绿体转运肽。

5.权利要求1的多核苷酸，其中所述编码植物甲基酮合酶的多核苷酸序列为选自SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38的多核苷酸序列。

6.一种构建体，其包含与在植物中具有功能性的启动子可操作连接的权利要求1的多核苷酸。

7.包含含有权利要求1的多核苷酸的植物组织的加工产品。

8.权利要求7的加工产品，其选自粗粉、面粉、油、干草、淀粉、汁液、蛋白质提取物和纤维。

9.控制植物中的病原体或害虫的方法，包括在植物中表达权利要求6的构建体。

10.权利要求9的控制植物中的病原体或害虫的方法，其中所述构建体包含与编码酰基载体蛋白的序列可操作连接的编码第二异源转运肽的序列。

11.权利要求10的方法，其中所述病原体或害虫是线虫。

12.权利要求11的方法，其中所述线虫选自异皮线虫属的种、球胞囊线虫属的种、根结线虫属的种、肾形线虫属的种、纽带线虫属的种、刺线虫属的种、短体线虫属的种、长针线虫属的种、拟毛刺线虫属的种、茎线虫属的种、剑线虫属的种、锥线虫属的种、螺旋线虫属的种、穿孔线虫属的种、潜根线虫属的种、矮化线虫属的种和毛刺线虫属的种。

13.权利要求10的方法，其中所述病原体或害虫是昆虫害虫。

14.权利要求13的方法，其中所述昆虫害虫选自玉米根虫属(Diabrotica)、非耳象属(Diaprepes)、桔根象属(Pachnaeus)、短喙象属(Asynonychus)、厉眼蕈蚊属(Lycoriella)、蕈蚊属(Sciara)、Stenophlus和迟眼蕈蚊属(Bradysia)。

15.生产种子的方法，包括将包含权利要求1的多核苷酸的植物与其自身或第二植物杂交。

16.一种多核苷酸，其为进一步连接与编码酰基载体蛋白的序列可操作连接的编码第二异源转运肽的序列的权利要求1的多核苷酸。

17.权利要求16的多核苷酸，其中所述酰基载体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:41、43、45、47、49、51、53、55或57所示。

18.权利要求16的多核苷酸，其中所述第二转运肽是叶绿体转运肽。

19.权利要求16的多核苷酸，其中所述第二转运肽选自EPSPS叶绿体转运肽、小亚基核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶叶绿体转运肽、铁氧还蛋白叶绿体转运肽、铁氧还蛋白氧化还原酶叶绿体转运肽、集光复合蛋白I和蛋白II叶绿体转运肽和硫氧还蛋白F叶绿体转运肽。

20.权利要求16的多核苷酸，其中所述编码酰基载体蛋白的序列为选自SEQ ID NO:40、42、44、46、48、50、52、54和56的多核苷酸序列。

21.植物、植物部分、种子或后代的加工产品，其中所述产品包含含有权利要求1的多核苷酸的植物细胞。

22.权利要求21的加工产品，其中该加工产品选自粗粉、面粉、油、干草、淀粉、汁液、蛋白质提取物和纤维。