CN111718955A - 番茄SlTRXz基因作为抑制靶标在防御南方根结线虫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了番茄SlTRXz基因作为抑制靶标在防御南方根结线虫中的应用。本发明要求保护一种培育对根结线虫抗性提高的植物的方法，包括如下步骤：抑制植物中SlTRXz基因的表达，得到对根结线虫抗性提高的植物。SlTRXz蛋白在植物中的含量和/或活性降低，植物对根结线虫抗性提高。SlTRXz基因在植物中的表达量降低，植物对根结线虫抗性提高。SlTRXz基因在植物中转录产物的丰度降低，植物对根结线虫抗性提高。本发明通过病毒诱导的基因沉默技术获得番茄SlTRXz瞬时沉默株系，在接种根结线虫后发现其根结指数显著降低，即植株对根结线虫的抗性提高。本发明丰富了番茄调控根结线虫抗性的相关基因，为番茄育种和在生物逆境中提高产量提供参考。

Description

番茄SlTRXz基因作为抑制靶标在防御南方根结线虫中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及番茄SlTRXz基因作为抑制靶标在防御南方根结线虫中的应用。

背景技术

根结线虫病是一种破坏性极强的植物寄生线虫，是世界上最难防治的蔬菜病害之一，在全世界广泛分布，侵染超过3000种植物，其病害发生后一般会造成减产10％-20％，严重的达75％以上。

番茄是全球栽培最为普遍的果菜之一，在我国主要以温室、塑料大棚及其他保护地设施进行大面积栽培。然而，近年来随着保护地栽培面积的逐步扩大，复种指数的提高，根结线虫危害日趋严重。而番茄对根结线虫十分敏感，是受害最严重的主要蔬菜之一。根结线虫主要侵染番茄的须根及侧根，解剖根结后可在病部组织内观察到有很多细小的乳白色线虫埋于其内，而根结上长出细弱的新根后会再度染病形成肥肿畸形瘤状结，这对番茄的的根系造成一系列的危害，进而影响整株植物的生长。

硫氧还蛋白TRX是一类存在于所有生物中的小分子蛋白，分子量约为12kDa。

发明内容

本发明的目的是提供番茄SlTRXz基因作为抑制靶标在防御南方根结线虫中的应用。

本发明要求保护一种培育对根结线虫抗性提高的植物的方法，包括如下步骤：抑制植物中SlTRXz基因的表达，得到对根结线虫抗性提高的植物。

抑制植物中SlTRXz基因的表达，可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。

在本发明的具体实施方式中，抑制植物中SlTRXz基因的表达具体是通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS技术)实现的。VIGS技术采用pTRV1载体和重组质粒pTRV2-SlTRXz。重组质粒pTRV2-SlTRXz是以pTRV2载体为出发载体构建的。重组质粒pTRV2-SlTRXz是在出发载体中插入干扰片段得到的，所述出发载体为pTRV2载体。所述干扰片段具体可为序列表的序列2中第109-407位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒pTRV2-SlTRXz具体为：将序列表的序列2中第109-407位核苷酸所示的双链DNA分子插入pTRV2载体的多克隆位点(例如XbaI和SmaI酶切位点之间)，得到的重组质粒。

本发明还要求保护一种培育对根结线虫抗性提高的植物的方法，包括如下步骤：沉默植物中SlTRXz基因，得到对根结线虫抗性提高的植物。

本发明还要求保护一种培育对根结线虫抗性提高的植物的方法，包括如下步骤：降低植物中SlTRXz蛋白的含量和/或活性，得到对根结线虫抗性提高的植物。

本发明还保护SlTRXz蛋白在调控植物对根结线虫抗性中的应用。

本发明还保护SlTRXz基因作为抑制靶标在培育对根结线虫抗性提高的植物中的应用。

本发明还保护用于抑制SlTRXz基因表达的物质在培育对根结线虫抗性提高的植物中的应用。所述用于抑制SlTRXz基因表达的物质具体可为通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS技术)抑制SlTRXz基因表达的物质。所述用于抑制SlTRXz基因表达的物质具体可为pTRV1载体和重组质粒pTRV2-SlTRXz。重组质粒pTRV2-SlTRXz是以pTRV2载体为出发载体构建的。重组质粒pTRV2-SlTRXz是在出发载体中插入干扰片段得到的，所述出发载体为pTRV2载体。所述干扰片段具体可为序列表的序列2中第109-407位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒pTRV2-SlTRXz具体为：将序列表的序列2中第109-407位核苷酸所示的双链DNA分子插入pTRV2载体的多克隆位点(例如XbaI和SmaI酶切位点之间)，得到的重组质粒。

本发明还保护用于沉默SlTRXz基因表达的物质在培育对根结线虫抗性提高的植物中的应用。

本发明还保护用于降低SlTRXz蛋白的含量和/或活性的物质在培育对根结线虫抗性提高的植物中的应用。

SlTRXz基因为编码SlTRXz蛋白的基因。

SlTRXz蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a3)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物根结线虫抗性相关的由其衍生的蛋白质；

(a4)来源于番茄且与(a1)具有98％以上同一性且与植物根结线虫抗性相关的蛋白质。

SlTRXz基因是如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)：

(1)编码区如序列表中序列2中第108-635位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(3)序列表中序列3所示的DNA分子；

(4)在严格条件下与(1)或(2)或(3)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(5)来源于番茄且与(1)或(2)或(3)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

SlTRXz蛋白在植物中的含量和/或活性降低，植物对根结线虫抗性提高。

SlTRXz基因在植物中的表达量降低，植物对根结线虫抗性提高。

SlTRXz基因在植物中转录产物的丰度降低，植物对根结线虫抗性提高。

对根结线虫抗性提高，具体可体现为植株的根结指数降低。

以上任一所述根结线虫为南方根结线虫。

以上任一所述植物为双子叶植物。

进一步地，所述双子叶植物为茄科植物。

更进一步地，所述茄科植物为番茄。

本发明通过VIGS技术获得番茄SlTRXz瞬时沉默株系，在接种根结线虫后发现其根结指数显著降低，即植株对根结线虫的抗性提高。本发明丰富了番茄调控根结线虫抗性的相关基因，为番茄育种和在生物逆境中提高产量提供参考。

附图说明

图1为SlTRXz基因的相对表达量。

图2为接种根结线虫14天后根系根结酸性品红染色的照片。

图3为根结指数结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

SlTRXz蛋白，获自番茄(Solanumlycopersicum)，如序列表的序列1所示。番茄的cDNA中，SlTRXz基因如序列表的序列2所示(序列2中，第108-635位核苷酸组成开放阅读框)。番茄的基因组DNA中，SlTRXz基因如序列表的序列3所示。

pTRV1载体、pTRV2载体记载于如下文献：杨淑明.利用VIGS技术研究棉花三个锌指蛋白基因的耐逆性[D]；南京农业大学；2015年。

实施例中所用的番茄为野生型番茄品种CM，即Solanumlycopersicumcv.Castlemart。简称野生型番茄。

实施例1、沉默番茄SlTRXz基因

一、VIGS重组载体的构建

将序列表的序列2中第109-407位核苷酸所示的双链DNA分子插入pTRV2载体的XbaI和SmaI酶切位点之间，得到重组质粒pTRV2-SlTRXz。重组质粒已进行测序验证。

将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pTRV2载体的XbaI和SmaI酶切位点之间，得到重组质粒pTRV2-PDS。重组质粒已进行测序验证。序列表的序列4所示的双链DNA分子为PDS基因片段，作为质控指示。PDS是八氢番茄红素脱氢酶，表达受抑制，会导致无色的八氢番茄红素大量积累，进而导致叶绿素、类胡萝卜素合成明显降低，使植株呈现白化(光漂白现象)。

二、重组农杆菌的构建

将pTRV1载体导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌pTRV1。

将pTRV2载体导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌pTRV2。

将重组质粒pTRV2-SlTRXz导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌pTRV2-SlTRXz。

将重组质粒pTRV2-PDS导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌pTRV2-PDS。

三、农杆菌转化并采用芽抽真空法侵染种子下胚轴

1、制备侵染液

(1)制备侵染buffer

制备侵染buffer：在98ml灭菌蒸馏水中加入1ml 1M MgCl₂水溶液、1ml 1M MES水溶液和200μl 200mM AS水溶液，混匀，然后调pH至5.6。

(2)制备侵染液

用侵染buffer悬浮重组农杆菌pTRV1，使菌液OD_600nm值为1.0～1.5，即为pTRV1菌液。

用侵染buffer悬浮重组农杆菌pTRV2，使菌液OD_600nm值为1.0～1.5，即为pTRV2菌液。

用侵染buffer悬浮重组农杆菌pTRV2-SlTRXz，使菌液OD_600nm值为1.0～1.5，即为pTRV2-SlTRXz菌液。

用侵染buffer悬浮重组农杆菌pTRV2-PDS，使菌液OD_600nm值为1.0～1.5，即为pTRV2-PDS菌液。

pTRV1菌液和pTRV2菌液等体积混合，然后加入SilwetL77并使其在体系中的浓度为0.05％(体积比)，静置3小时，得到P-侵染液。

pTRV1菌液和pTRV2-SlTRXz菌液等体积混合，然后加入SilwetL77并使其在体系中的浓度为0.05％(体积比)，静置3小时，得到P侵染液。

pTRV1菌液和pTRV2-PDS菌液等体积混合，然后加入SilwetL77并使其在体系中的浓度为0.05％(体积比)，静置3小时，得到P+侵染液。

2、侵染番茄种子

侵染对象为发芽的野生型番茄种子(胚根长到1.0～1.5cm)。

侵染过程：将侵染对象置于侵染液中，然后置于真空渗透器(由真空干燥器和便携式空气压缩机组装而成)中，抽真空，压强达到-25KPa时停止抽真空并保持30s，然后逐步放气，直到压强恢复。P-侵染组采用的侵染液为P-侵染液。P侵染组采用的侵染液为P侵染液。P+侵染组采用的侵染液为P+侵染液。

完成侵染后，将种子取出，播种于穴盘，置于“22℃光照16h/18℃黑暗8h”环境中培养。

完成侵染并培养14天后，P+侵染组可以观察到植株白化。

四、利用qRT-PCR检测SlTRXz基因被沉默后的mRNA表达量

供试植株：P-侵染组完成侵染并正常培养14天后的植株、P侵染组完成侵染并正常培养14天后的植株。

长势一致的供试植株，取真叶1-2片。提取真叶的RNA并反转录得到cDNA。采用Actin基因为内参基因，检测SlTRXz基因的相对表达量。

用于检测SlTRXz基因的引物如下：

SlTRXz RT-F：5’-CCACATGGTGTGGTCCTTGT-3’；

SlTRXz RT-R：5’-CGAACCTGCATATCTCGTGC-3’。

用于检测Actin基因的引物如下：

Actin-F：5’-GGAATGGGACAGAAGGAT-3’；

Actin-R：5’-CAGTCAGGAGAACAGGGT-3’。

结果见图1。图1中，TRV代表P-侵染组植株，TRV-TRXz-1、TRV-TRXz-2、TRV-TRXz-3分别为示例性的三株P侵染组植株。P侵染植株SlTRXz基因的相对表达量相比于P-侵染组植株下降至60％以下。

五、对南方根结线虫抗性鉴定

供试植株：6株P-侵染组植株、6株P侵染组植株(SlTRXz基因的相对表达量均下降至野生型植株的60％以下)。供试植株均在相同条件下培养。

1、供试植株长至“四叶一心”时接种根结线虫。

接种方法：将苗盆基质湿润，围绕番茄根部1.5cm处打4个孔，用移液枪将预先计数的南方根结线虫悬浮液均匀注入4个孔内，每株植株接种500头南方根结线虫。

2、酸性品红染色法观察根结侵染情况

接种根结线虫7天后或14天后，取植株根系，用清水冲洗根系表面基质，稍晾干，然后将根系置于1.5g/100ml次氯酸钠水溶液中浸泡5min，然后用清水冲洗30s，然后置于蒸馏水中浸泡15min，晾干；然后将根系置于200mL烧杯，加入3.5g/100ml酸性品红水溶液，室温放置染色45-60min(以绝大部分的根结被染成红色为准)，用流水冲洗根系表面的品红溶液，然后将根系置于蒸馏水中褪色2-5min，然后拍照(根结被染成红色，其他根系为淡黄色)。

接种根结线虫14天后的照片见图2。图2中，TRV代表P-侵染组植株，TRV-TRXz代表P侵染组植株。P侵染组植株相比于P-侵染组植株根结数量显著减少。

3、根结指数的测定

根结指数(Gall Index)＝根结数/根系鲜重(g)

结果见图3。图3中，TRV代表P-侵染组植株，TRV-TRXz代表P侵染组植株。与P-侵染组植株相比，P侵染组植株的根结指数显著降低。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京农学院

<120> 番茄SlTRXz基因作为抑制靶标在防御南方根结线虫中的应用

<130> GNCYX201939

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 175

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 1

Met Gln Ala Ala Ser Leu Ala Phe His Pro Pro Ala Leu Arg Thr Ser

1 5 10 15

Pro Ser Tyr Leu Ser Ser Lys Leu Pro His His Leu Asn Tyr Ser Leu

20 25 30

Phe Lys His Ala Pro Ser Thr Ser Thr Leu Ser Leu Thr Gln Val Leu

35 40 45

Ser Arg Asn Thr Ile Cys Lys Pro Pro Ala Val Gly Lys Tyr Val Arg

50 55 60

Glu Asp Tyr Leu Val Lys Lys Leu Ser Ala Lys Glu Ile Gln Glu Leu

65 70 75 80

Ile Lys Gly Glu Arg Asn Val Pro Leu Ile Ile Asp Phe Tyr Ala Thr

85 90 95

Trp Cys Gly Pro Cys Ile Leu Met Ala Gln Glu Leu Glu Met Leu Ala

100 105 110

Val Glu Tyr Glu Asn Asn Ala Leu Ile Val Lys Val Asp Thr Asp Asp

115 120 125

Glu Tyr Glu Phe Ala Arg Asp Met Gln Val Arg Gly Leu Pro Thr Leu

130 135 140

Tyr Phe Ile Ser Pro Asp Ser Ser Lys Asp Ala Ile Arg Thr Glu Gly

145 150 155 160

Leu Ile Pro Ile Gln Met Met Arg Asp Ile Ile Asp Asn Asp Leu

165 170 175

<210> 2

<211> 910

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 2

gtctcgttgg gaattttggc tctctctttc tttgctcctt aaaccccaaa cagagtctct 60

ctccctgtgc tgtgtgtcac tccggcagag cagataaagc tataagaatg caagctgcca 120

gtctcgcctt tcaccctccg gcactccgta cttcaccttc ttacctctcc tccaaacttc 180

cccaccacct caattattca ctcttcaaac acgctccttc aacttccaca ctatctttaa 240

cccaagtact ctccagaaat accatttgca aacccccagc tgttggaaaa tatgtcaggg 300

aggattatct tgtgaagaaa ttatctgcca aggagattca agaactgata aagggagaaa 360

ggaatgtgcc actgattatt gatttctatg ccacatggtg tggtccttgt attttgatgg 420

cgcaagaact tgaaatgctt gctgtggagt atgaaaacaa tgcacttatt gtgaaagtgg 480

acacagatga tgaatacgaa tttgcacgag atatgcaggt tcgaggacta cctacgttgt 540

atttcataag tccagattca agtaaggatg ctatcagaac tgaagggctc atcccgatac 600

aaatgatgcg ggacatcatt gataatgatt tatgatgaat aattcagttg gttctttgtt 660

agtggaatcc attgctcttt gctgtagttg tgaagctgcc ttttattagt tcgtagtgat 720

gtaccaatat gtggatctca acataatttt ttagcaattt ccttctgaag ctctcaggct 780

tggtatctgc caggcagtgg taagagttgt aacacaaatt ttgcacttgg aaacagttaa 840

aacaagtagt gcaacaaact gcaatttctg atgttaaaac agaaatggat gtttaaaatc 900

ttagaattcc 910

<210> 3

<211> 3428

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 3

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ctccctgtgc tgtgtgtcac tccggcagag cagataaagc tataagaatg caagctgcca 120

gtctcgcctt tcaccctccg gcactccgta cttcaccttc ttacctctcc tccaaacttc 180

cccaccacct caattattca ctcttcaaac acgctccttc aacttccaca ctatctttaa 240

cccaagtact ctccagaaat accatttgca aacccccagc tgttggaaaa tatgtcaggg 300

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ttgcttggag tttagttatg tcttgctatg cacactaggt tatctttgct aatgtcaaaa 2700

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tcccttgctt tcatcacata tttcataagt gcaaagctat ttgtctttca agaatttgca 3000

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<210> 4

<211> 320

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 4

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gaaggaacta gcaacgcttt ttcctgatga aatttcagca gatcaaagca aagcaaaaat 120

attgaagtac catgttgtca aaactccgag gtctgtttat aaaactgtgc caggttgtga 180

accctgtcgg cctttacaaa gatccccaat agaggggttt tatttagccg gtgactacac 240

gaaacagaaa tacttggctt caatggaagg cgctgtctta tcaggaaagc tttgtgctca 300

agctattgta caggattatg 320

Claims (10)

1.一种培育对根结线虫抗性提高的植物的方法，包括如下步骤：抑制植物中SlTRXz基因的表达，得到对根结线虫抗性提高的植物；

SlTRXz基因为编码SlTRXz蛋白的基因；

SlTRXz蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a3)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物根结线虫抗性相关的由其衍生的蛋白质；

(a4)来源于番茄且与(a1)具有98％以上同一性且与植物根结线虫抗性相关的蛋白质。

2.一种培育对根结线虫抗性提高的植物的方法，包括如下步骤：沉默植物中权利要求1中所述的SlTRXz基因，得到对根结线虫抗性提高的植物。

3.一种培育对根结线虫抗性提高的植物的方法，包括如下步骤：降低植物中权利要求1中所述的SlTRXz蛋白的含量和/或活性，得到对根结线虫抗性提高的植物。

4.权利要求1中所述的SlTRXz蛋白在调控植物对根结线虫抗性中的应用。

5.权利要求1中所述的SlTRXz基因作为抑制靶标在培育对根结线虫抗性提高的植物中的应用。

6.用于抑制权利要求1中所述的SlTRXz基因表达的物质在培育对根结线虫抗性提高的植物中的应用。

7.用于沉默权利要求1中所述的SlTRXz基因表达的物质在培育对根结线虫抗性提高的植物中的应用。

8.用于降低权利要求1中所述的SlTRXz蛋白的含量和/或活性的物质在培育对根结线虫抗性提高的植物中的应用。

9.如权利要求1至3中任一所述的方法或者如权利要求4至8中任一所述的应用，其特征在于：所述根结线虫为南方根结线虫。

10.如权利要求1至3中任一所述的方法或者如权利要求4至8中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为番茄。

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