CN103747671A - 具有靶标特异性种子序列的小干扰rna - Google Patents

Abstract

本发明披露了用于设计和合成siRNA文库的方法、由此产生的siRNA文库、siRNA分子、及其用途。

Description

具有靶标特异性种子序列的小干扰RNA

发明领域

本发明涉及用于基于靶标特异性siRNA序列的富集而设计小干扰RNA（siRNA）的方法、由此产生的siRNA、以及用于使用这些siRNA的方法。更具体地，本发明涉及具有对抗有害生物或病原体活性的小干扰RNA以及它们在植物中的用途。

背景

在过去十年中，已经对多种有机体广泛如植物、真菌、线虫、水螅、以及人类中的RNA干扰（RNAi）进行了描述以及表征化。Zamore（扎穆尔）和Haley（哈利）（2005）Science（《科学》）309,1519-24。在植物中的RNA干扰通常是指转录后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中是指抑制（quelling）。认为转录后基因沉默的过程是进化保守的细胞防御机制，该机制被用来防止外源基因的表达并且通常由不同的植物（flora）和动物门（phyla）共享。Fire（菲尔）（1999）TrendsGenet.（《遗传学趋势》）15,358-363。

当一种有机体识别双链RNA分子并且水解它们时，RNA干扰发生。所生成的水解产物是具有19-24个核苷酸长度的小RNA片段，称为小干扰RNA（siRNA）或微RNA（miRNA）。然后这些siRNA扩散或被携带至整个有机体，包括越过细胞膜，在那里它们与mRNA（或其他的RNA）杂交并且导致RNA水解。干扰RNA由RNA干扰沉默复合体（RISC）识别，RNA的效应链（或“引导链”）位于该复合体中。此引导链充当用于双链体序列的识别和破坏的模板。此过程被重复，每次siRNA与它的互补RNA靶标杂交，有效防止了那些mRNA被翻译，并且因此“沉默”特异基因的表达。大多数植物miRNA示出它们的靶标mRNA的广泛碱基配对，并且引导它们的靶标mRNA的切割。Jones-Rhoades（琼斯-罗兹）等人（2006）Annu.Rev.Plant Biol.（《植物生物学年度评论》）57,19-53；Llave（莱乌）等人（2002）Proc.Natl.Acad.Sci.（《美国国家科学院院刊》）USA97,13401-13406。在其他实例中，干扰RNA可以结合至具有非完美互补性的靶标RNA分子，导致在没有mRNA降解的情况下的翻译阻抑。到目前为止，多数研究的动物miRNA似乎以此方式发挥功能。

基于miRNA作为基因表达内源性调节剂的作用，已经作出朝着用于基因表达靶标性调节的miRNA的设计的实质性努力。例如，可以通过用工程化的或合成的21个核苷酸序列替换21个核苷酸的成熟miRNA序列以及互补序列（即miRNA*链或miRNA星号链）两者来设计前miRNA。此类人工前miRNA具有与天然前miRNA的序列相同的序列，除了编码成熟miRNA和星号链的区域。通过此方法，人工miRNA（amiRNA）已经被设计为可以用互补序列来靶标并且沉默特异性mRNA转录物。

在miRNA序列内，6-7个核苷酸的高度保守区域称为种子序列，负责与靶标基因/RNA的碱基配对。这些种子序列位于从miRNA分子的5′-端线性数起的核苷酸2-7或2-8处，同时剩余的核苷酸称为非种子序列。是相同miRNA家族的成员的miRNA（即在核苷酸2-8处具有相同序列的miRNA）共享相同的预计mRNA靶标。参见Bartel（巴特尔）（2009）Cell（《细胞》）136,215-233。

考虑到它们在序列特异性基因调节中的作用，siRNA被设想具有许多应用，包括基因功能的研究、对与异常蛋白表达或累积关联的病症的疗法的开发、以及用于给予所希望性状（包括在植物中）的方法。为了满足这个需要，本发明提供了用于靶标特异性siRNA、siRNA文库、以及由此产生的siRNA分子的有效设计的方法、以及用于使用它们的方法。

概述

在此所述的本发明是一种制备小干扰RNA（siRNA）的文库的方法、由此产生的siRNA及其用途。

本发明的一方面是制备小干扰RNA（siRNA）文库的方法，包括合成多个RNA分子，其中每个RNA分子包括(a)包括随机核苷酸的种子序列，以及(b)包括特指核苷酸的非种子序列。

本发明的另一方面是制备小干扰RNA（siRNA）文库的方法，包括合成多个RNA分子，其中每个RNA分子包括(a)包括一些核苷酸的种子序列，这些核苷酸代表靶标有机体或与靶标有机体相关的有机体的一个或多个微RNA种子序列，以及(b)包括特指核苷酸的非种子序列。

本发明的另一方面是制备小干扰RNA（siRNA）文库的方法，该方法进一步包括以下步骤：(a)将在种子序列内包括以低频率存在于靶标有机体或与靶标有机体相关的有机体的微RNA序列的相应位置处的一个或多个核苷酸的RNA分子排除；(b)将在种子序列内包括同型四联体的RNA分子排除；和/或(c)将包括在位置1-9处具有比在位置11-19处的GC含量更多的GC含量的种子序列的RNA分子排除。

本发明的另一方面是包括多个RNA分子的siRNA文库，其中每个RNA分子包括(a)包括随机核苷酸的种子序列，以及(b)包括特指核苷酸的非种子序列。本发明的另一方面是包括多个RNA分子的siRNA文库，其中每个RNA分子包括(a)包括一些核苷酸的种子序列，这些核苷酸代表靶标有机体或与靶标有机体相关的有机体的一个或多个微RNA种子序列，以及(b)非种子序列。在一方面，siRNA文库是计算机siRNA文库。

本发明的另一方面包括siRNA文库，其中非种子序列包括来自植物有害生物或病原体或来自与植物有害生物或病原体相关的有机体的共有微RNA序列。本发明的一方面是siRNA文库，其中非种子序列包括占据SEQ ID NO:47的位置1和9-19的核苷酸。本发明的另一方面是siRNA文库，其中非种子序列包括占据SEQ ID NO:50的位置1和9-19的核苷酸。本发明的另一方面是siRNA文库，其中非种子序列进一步包括一个或多个核苷酸置换从而改进微RNA稳定性。

本发明的另一方面是siRNA文库，该文库排除：(a)在种子序列内包括一个或多个以低频率存在于靶标有机体或与靶标有机体相关的有机体的微RNA序列的相应位置处的核苷酸的RNA分子；(b)在种子序列内包括同型四联体的RNA分子；和/或(c)包括在位置1-9处具有比在位置11-19处的GC含量更多的GC含量的种子序列的RNA分子。

本发明的另一方面是siRNA文库，该文库排除包括与宿主核酸互补的种子序列的RNA分子。本发明的额外一方面是siRNA文库，该文库包括具有SEQ ID NO:49的残基2-8的种子序列。本发明的另一方面是siRNA文库，该文库包括具有SEQ ID NO:51的残基2-8的种子序列。

本发明的另一方面是siRNA分子，该siRNA分子包括(a)包括一些核苷酸的种子序列，这些核苷酸代表靶标有机体或与靶标有机体相关的有机体的一个或多个微RNA种子序列，以及(b)非种子序列。本发明的另一方面是包括至少约19个核苷酸的siRNA分子，并且其中种子序列包括6-8个核苷酸。本发明的一方面是包括21个核苷酸的siRNA分子，其中种子序列包括占据该RNA分子的位置2-8的核苷酸，并且其中非种子序列包括占据该RNA分子的位置1和9-21的核苷酸。本发明的另一方面是siRNA分子，其中非种子序列包括共有微RNA序列。

本发明的另一方面是siRNA分子，其中非种子序列包括来自植物有害生物或病原体或来自与植物有害生物或病原体相关的有机体的共有微RNA序列。本发明的一方面是siRNA分子，其中非种子序列包括占据SEQ ID NO:49的位置1和9-19的核苷酸。

本发明的另一方面是siRNA分子，其中非种子序列包括占据SEQID NO:51的位置1和9-19的核苷酸。本发明的另一方面是siRNA分子，其中非种子序列进一步包括一个或多个核苷酸置换从而改进微RNA稳定性。

本发明的另一方面是siRNA分子，该分子包括具有SEQ ID NO:49的残基2-8的种子序列。本发明的另一方面是siRNA分子，该分子包括具有SEQ ID NO:48的残基2-8的种子序列。本发明的另外一方面是siRNA分子，该分子包括具有SEQ ID NO:1–14中任一个的残基2-8的种子序列。本发明的额外一方面是siRNA分子，该分子包括具有SEQID NO:51的残基2-8的种子序列。

本发明的另一方面是siRNA分子，该分子包括SEQ ID NO:1–14的任一个中的核苷酸序列。本发明的另一方面是siRNA分子，该分子包括SEQ ID NO:51的核苷酸序列。

本发明的另一方面是包括siRNA分子的人工RNA分子，该人工RNA分子包括SEQ ID NO:16–29的任一个中的核苷酸序列。本发明的另外一方面是包括siRNA分子的人工RNA分子，该人工RNA分子包括SEQ ID NO:51的核苷酸序列。

本发明的另一方面是包括siRNA分子的载体，该载体包括SEQ IDNO:31-44的任一个中的核苷酸序列。本发明的额外一方面是包括siRNA分子的载体，该载体包括SEQ ID NO:51的核苷酸序列。

本发明的另一方面是包括具有SEQ ID NO:1-51中任一个的siRNA分子的转基因植物或其部分。在一方面，该转基因植物是大豆。在另一方面，该转基因植物是玉蜀黍。

本发明的另一方面是包括具有SEQ ID NO:1-51中任一个的siRNA分子的植物产品。本发明的另外一方面是包括具有SEQ ID NO:1-51中任一个的siRNA的商品。

本发明的另一方面是对赋予靶标有机体所希望的表型结果的siRNA进行鉴别的方法，该方法包括：(a)使靶标有机体与siRNA文库中的siRNA分子接触；并且(b)使(a)的siRNA处理与希望的表型结果相关。本发明的另一方面是鉴别赋予对大豆胞囊线虫的抗性的siRNA的方法，该方法包括：(a)使大豆胞囊线虫与siRNA文库中的siRNA分子接触；并且(b)使(a)的siRNA处理与大豆对大豆胞囊线虫侵染的抗性相关。本发明的另外一方面是鉴别赋予对玉米根虫的抗性的siRNA的方法：(a)使玉米根虫与siRNA文库中的siRNA分子接触；并且(b)使(a)的siRNA处理与玉米对玉米根虫侵染的抗性相关。

本发明的另一方面是赋予植物的线虫抗性的方法，该方法包括在植物中表达一种核酸，该核酸包括具有SEQ ID NO:1–14的siRNA，由此该植物对线虫有抗性。本发明的另一方面是赋予植物的昆虫抗性的方法，该方法包括在植物中表达一种核酸，该核酸包括具有SEQ ID NO:51的siRNA，由此该植物对昆虫有抗性。

本发明的另一方面是降低植物的线虫侵染性的方法，该方法包括使线虫与包括SEQ ID NO:1–14的siRNA的核酸接触，由此线虫侵染性降低。本发明的另一方面是降低植物的昆虫侵染性的方法，该方法包括使昆虫与包括SEQ ID NO:51的siRNA的核酸接触，由此昆虫侵染性降低。

本发明的一个方面是降低植物中线虫侵染风险的方法，该方法包括在植物中表达一种核酸，该核酸包括具有SEQ ID NO:1–14的siRNA，由此线虫侵染风险降低。本发明的另一方面是降低植物中线虫侵染风险的方法，该方法包括在植物中表达一种核酸，该核酸包括具有SEQ IDNO:51的siRNA，由此昆虫侵染风险降低。

本发明的另一方面是提供种植者一种控制线虫有害生物的手段的方法，该方法包括向种植者供应种子，其中该种子包含：包括SEQ ID NO:1–14的siRNA的核酸。本发明的另外一方面是提供种植者一种控制昆虫有害生物的手段的方法，该方法包括向种植者供应种子，其中该种子包含：包括SEQ ID NO:51的siRNA的核酸。

本发明的另一方面是一种siRNA分子，该siRNA分子靶向线虫基因以及与抗线虫植物表型相关的内源性植物基因两者。

本发明的另一方面是一种转基因植物或其部分，与相同物种的非转基因植物相比，具有乙烯应答基因的降低水平的表达，其中该转基因植物包括一种siRNA，该siRNA抑制一种有害生物线虫基因的表达，并且其中与单独从该乙烯应答基因的降低水平的表达或该线虫基因的抑制所预期的相比，该转基因植物具有对该线虫有害生物的侵染的更大耐受性。

本发明的另一方面是增强一种植物或其部分对一种线虫有害生物的侵染的抗性的方法，该方法包括将一种核酸导入该植物或其部分，该核酸包括抑制一种线虫基因表达由此降低该线虫侵染该植物或其部分的能力的一种siRNA分子，其中与没有该siRNA分子的相同物种植物或其部分相比，该植物或其部分额外地具有乙烯应答基因的降低水平的表达，由此与单独从该线虫基因的抑制亦或该乙烯应答基因的抑制所预期的相比，包含该siRNA的该植物或其部分对该线虫的侵染具有更大抗性。

序列简述

序列表提供了具有以下序列的、为本发明具体方面的siRNA和amiRNA的披露。

SEQ ID NO:1–15是siRNA的核酸序列，还列于下文表8中。

SEQ ID NO:16-30是amiRNA的核酸序列，还列于下文表9中。

SEQ ID NO:31-45是表达载体中的amiRNA的核酸序列，还列于下文表10中。SEQ ID NO:46是空表达载体对照。

SEQ ID NO:47，5′-UNNNNNNNUGUUGAUCUGGUU-3′是包含随机种子序列以及非种子序列的siRNA的序列，该非种子序列是秀丽隐杆线虫miRNA的共有序列，如在下文实例1中所述。

SEQ ID NO:48，5′-URDSDKVDUGUUGAUCUGGUU-3′涵盖在富集文库中所有siRNA的序列，如在下文实例1中所述制备的。

SEQ ID NO:49，5′-URDBDKVDUGUUGAUCUGGUU-3′涵盖用于具有对抗大豆胞囊线虫活性的siRNA的序列，如在下文实例4中所述。

SEQ ID NO:50，5′-UNNNNNNNUAUCCGGAUUCUU-3′是包含随机种子序列以及非种子序列的siRNA的序列，该非种子序列是赤拟谷盗miRNA的共有序列，如在下文实例6中所述。

SEQ ID NO:51，5′-UNDNWDNNUAUCCGGAUUCUU-3′涵盖在富集文库中所有siRNA的序列，如在下文实例6中所述制备的。

SEQ ID NO:52是大豆ETR1核酸（gma-ETR1）的核苷酸序列，Genbank登录号EF210138。

SEQ ID NO:53是包括结合至siRNA0097和siRNA0145的大豆ETR1mRNA部分的核苷酸序列。

SEQ ID NO:54是包括结合至siRNA0097*和siRNA0145*的大豆ETR1mRNA部分的核苷酸序列。

SEQ ID NO:55是siRNA0097*的核苷酸序列。

SEQ ID NO:56是siRNA0145*的核苷酸序列。

SEQ ID NO:57是描述具有对amiRNA0043*低的互补性的大豆ETR1mRNA序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO:58是描述具有对amiRNA0046*低的互补性的大豆ETR1mRNA序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO:59是siRNA0043*的核苷酸序列。

SEQ ID NO:60是siRNA0046*的核苷酸序列。

发明详述

本发明提供了制备小干扰RNA（siRNA）文库的方法、通过这些方法产生的文库、以及单独的siRNA分子。如在此所述，文库设计包括富集具有靶标特异性序列的siRNA。文库对于选择当与靶标有机体接触时引起所希望表型的一种或多种siRNA是有用的。还提供了由此产生的siRNA以及用于使用它们的方法。

siRNA分子

在此披露的本发明提供了设计在靶标有机体中具有活性的siRNA的策略。还提供了由此产生的具有用于众多应用的效用的siRNA，如在下文在此所述。本发明的范围不局限于这样一些核酸或文库：这些核酸或文库包括在此披露了其具体序列的siRNA。相反，可以使用来自任何有机体（已知的以及当前未知的两者）的序列而根据所披露方法设计siRNA。

术语“RNA”包括任何包括至少一个核糖核苷酸残基的分子，包括具有以下碱基的一个或多个天然核糖核苷酸的那些：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、以及尿嘧啶；对应地缩写为A、C、G、和U，经修饰的核糖核苷酸，以及非核糖核苷酸。“核糖核苷酸”是指在D-呋喃核糖部分的2′位置处具有羟基的核苷酸。

如在此使用的，术语以及短语“RNA”、“RNA分子”、以及“RNA序列”可互换使用，以便指介导RNA干扰的RNA。这些术语和短语包括单链RNA、双链RNA、分离的RNA、部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组RNA、细胞内的RNA，以及通过添加、删除、置换、和/或改变一个或多个核苷酸而与天然发生的RNA不同的RNA。“mRNA”是指信使RNA，是由转录产生的RNA。

“干扰RNA”（例如siRNA和miRNA）是能够进行转录后基因沉默或抑制、RNA沉默、和/或减少基因表达的RNA分子。干扰RNA通过与靶标核酸的mRNA序列的碱基配对而影响动物和植物中的序列特异性的、转录后的基因沉默。因此，siRNA至少部分地与沉默基因互补。部分互补的siRNA可以包括一个或多个错配、凸起、内部环、和/或非沃森-克里克碱基对（即G-U摇摆碱基对）。

术语“沉默”和“抑制”可互换使用，以便大体上描述在细胞中可利用的、用于由核糖体结合和译码的mRNA的量的大量的以及可测量的减少。经转录的RNA可以处于有义方向而发挥作用，称为共抑制，处于反义方向而发挥作用，称为反义抑制，或在两个方向上产生双链RNA而发挥作用，称为RNA干扰。“沉默”基因是指经受由基因编码的mRNA的沉默或抑制的基因。

“小干扰RNA”和“siRNA”的描述在此可互换使用，以便描述合成的或非天然的干扰RNA。术语“miRNA”或“微RNA”通常是指天然的或内源性干扰RNA。如在此使用，“miRNA”是指已经或将会在体外或体内被从前-微RNA前体加工以形成活性干扰RNA的干扰RNA。siRNA和miRNA两者是约19-24个核苷酸的RNA分子，尽管更短或更长（例如长度在18和26个核苷酸之间）的siRNAs/miRNA也可以是有用的。siRNA或miRNA可以是单链或双链。

微RNA是由被转录但不翻译为蛋白的基因（非编码DNA）所编码，尽管一些miRNA是由与编码蛋白的基因重叠的序列所编码。miRNA是从称为初级-miRNA（pri-miRNA）的初级转录物加工为称为前miRNA（pre-miRNA）的短茎环结构，这些前miRNA被进一步加工而创造功能性siRNA/miRNA。典型地，前体miRNA的一部分被切割为产生最终的miRNA分子。茎环结构的范围可以是从例如约50至约80个核苷酸、或约60个核苷酸至约70个核苷酸（包括miRNA残基，与miRNA配对的那些、以及任何介入区段）。茎环结构的二级结构不是完全碱基配对的；错配、凸起、内部环、非沃森-克里克碱基配对（即G-U摇摆碱基对）、以及其他的特征被频繁地在前miRNA中观察到，并且认为此类特征对于加工是重要的。成熟miRNA分子与一种或多种信使RNA分子是部分互补的，并且它们发挥调节基因表达的功能。本发明的siRNA具有内源性miRNA的结构和功能特性（例如基因沉默和抑制功能）。因此，在本发明的不同方面中，本发明的siRNA可以从前体转录物的一部分加工，该前体转录物的一部分任选地折叠为稳定的发夹（即双链体）或茎环结构。

短语“靶标特异性小干扰RNA”、“靶标特异性siRNA”、“靶标特异性微RNA”、“靶标特异性miRNA”、“靶标特异性amiRNA”、以及“靶标特异性核苷酸序列”是指已经被设计为选择性地与靶标有机体中但不是非靶标有机体（例如宿主有机体—表达或产生miRNA的有机体，或者宿主有机体的消费者）中的核酸杂交的干扰RNA。因此，“靶标特异性siRNA或amiRNA”仅在靶标有机体中产生表型而在非靶标有机体中不产生表型。

在本发明的一方面中，siRNA分子包括(a)包括一些核苷酸的种子序列，这些核苷酸代表靶标有机体或与靶标有机体相关的有机体的一个或多个微RNA种子序列或其共有序列，以及(b)非种子序列。此类siRNA分子包括至少约19个核苷酸，其中种子序列包括6-7个核苷酸。

如在此使用的描述“种子序列”是指siRNA分子的与靶标基因或RNA至少部分互补的一个区域。如在使用的，种子序列由6-7个核苷酸组成，开始于从siRNA5′端的第二个残基（例如，如从siRNA5′端线性计数的核苷酸2-7或2-8）。种子序列是后生动物miRNA中最高度保守的区域，并且在核苷酸2-8处具有相同序列的miRNA共享相同的预计mRNA靶标。参见Bartel（巴特尔）（2009）Cell（《细胞》）136,215-233。

在本发明的一方面中，在种子序列内的核苷酸是基于具体核苷酸在“靶标有机体”（即，本发明的siRNA在其中对于基因沉默预期是有功能的有机体）的miRNA种子序列中被观察到的频率。类似地，在种子序列内的核苷酸可以是基于具体核苷酸在“与靶标有机体相关的有机体”的miRNA种子序列中被观察到的频率。在此背景下，不论进化关系是由表型性状、分子标志物、和/或物种形成和/或灭绝的速率的变化来确定还是由序列一致性或相似性来确定，“相关”意为在有机体之间和之中相对的系统发生的接近性。相关的程度可以是在一些方面中，通过系统发生而紧密相关，例如共享相同的属或科。在其他方面，系统发生相关的程度可以是远离的，例如仅共享相同的门或纲。在其他方面，可能与靶标有机体没有系统发生的相关性，但非种子序列可以通过序列同源性、相似性、或一致性而与靶标有机体“相关”。共有非种子序列还可以从来自靶标有机体和/或来自与靶标有机体相关的一种或多种有机体的非种子序列制备。如在此使用，任何包含能够与在此披露的本发明的种子序列相互作用的核酸的有机体均为“靶标”有机体。

该种子序列的核苷酸可以进一步基于在天然发生的miRNA中在每个位置处观察到的频率来选择，例如通过排除以低频率观察到的那些核苷酸。低频率可以包括在一组天然发生的miRNA中观察到的小于约50%、或小于约45%、或小于约40%、或小于约35%、或小于约30%、或小于约25%、或小于约20%、或小于约15%、或小于约10%、或小于约5%的发生率。

该种子序列可以可替代地包括靶标有机体和/或与靶标有机体相关的有机体的两个或更多个miRNA种子序列的共有序列。还参见实例1。如在此使用，短语“共有序列”是指这样一种核苷酸序列：其中当相似或相关的序列如在此所述的与彼此比较以用于确定相似性或一致性时（参见下文），每个核苷酸代表在该序列中具体位置处最频繁观察到的核苷酸。如在此使用的，siRNA的共有序列或其部分是指在有机体、种、属、科、目、纲、门、界、或域内呈保守的被选组的siRNA亦或所有siRNA。术语“共有序列”（“consensus”）还涵盖从该序列或从类似的或同源的序列已知的或预计的结构元件，例如在对于miRNA加工而言被认为是重要的初级mRNA、前miRNA、miRNA或siRNA序列中观察到的除其他之外的双链体、错配、凸起、G-U摇摆碱基对、环、发夹、四环。参见例如Saxena（赛克森纳）等人（2003）J.Biol.Chem.（《生物化学杂志》）278,44312-44319。

本发明的代表性siRNA种子序列包括SEQ ID NO:48的残基2-8，它是简并的共有序列，简并度是基于在秀丽隐杆线虫的天然发生miRNA中的相同的位置处观察到的核苷酸的频率。额外的代表性种子序列包括SEQ ID NO:1-14的任一个中的残基2-8，以及SEQ ID NO:49的残基2-8，该SEQ ID NO:49是SEQ ID NO:1-14的种子序列的共有序列。此外，SEQ ID NO:51是简并的共有序列，简并度是基于在赤拟谷盗的天然发生的miRNA中的相同位置处观察到的核苷酸的频率。

如在此使用，描述“非种子序列”是指siRNA或miRNA中不是种子序列的所有序列。对于21个核苷酸的siRNA，非种子序列包括线性核苷酸1和8-21或1和9-21，取决于该种子序列是由6个核苷酸（例如位置2-7）还是由7个核苷酸（例如位置2-8）组成。在本发明的一方面，非种子序列包括天然发生的miRNA非种子序列。在本发明的另一方面，非种子序列包括共有的微RNA非种子序列，即miRNA非种子序列的共有序列。这样的共有序列可以从两个或更多个miRNA非种子序列，例如三个miRNA序列、或四个miRNA序列、或五个miRNA序列、或六个miRNA序列、或七个miRNA序列、或八个miRNA序列、或九个miRNA序列、或十个miRNA序列、或二十个miRNA序列、或三十个miRNA序列、或四十个miRNA序列、或五十个miRNA序列或更多来制备。本领域普通技术人员理解用于制得此类比对的技术和计算机工具，并且能易于使用任何数目的miRNA序列来制备共有序列。

在本发明的一方面，miRNA非种子序列或miRNA非种子序列的共有序列包括来自靶标有机体（即本发明的siRNA在其中对于基因沉默预期是有功能的有机体）的非种子序列的共有序列。类似地，miRNA非种子序列的共有序列可以包括与靶标有机体相关的非种子序列的共有序列。在此背景下，“相关”意为如在此上文关于种子序列的设计所述的、在有机体之间或之中相对的系统发生的接近性。

在本发明的另一方面，非种子序列是部分或全部合成的，即示出如通过模型或经验所确定的所希望功能特性的非天然发生序列。例如，非种子序列可以包括相对于天然发生的miRNA序列、siRNA序列、或miRNA/siRNA共有序列而言的一个或多个核苷酸置换，例如3′-末端的尿苷或脱氧胸苷，以改进siRNA稳定性。参见实例1。

例如，在靶标有机体是植物寄生线虫时，有用的非种子序列可以包括模式线虫秀丽隐杆线虫的miRNA非种子序列的共有序列。具有这些特性的代表性非种子序列列出为SEQ ID NO:47的核苷酸1以及9-19。参见实例1。作为另一个实例，在靶标有机体是植物寄生线虫时，其他有用的种子序列包括在表6中经鉴定的一种或多种线虫的miRNA非种子序列的共有序列。作为另外的实例，在靶标有机体是昆虫有害生物时，有用的非种子序列可以包括有机体赤拟谷盗的miRNA非种子序列的共有序列。具有这些特性的代表性非种子序列列出为SEQ ID NO:50的核苷酸1以及9-19。参见实例6。

本发明的代表性siRNA包括SEQ ID NO:1-14，它们是从在实例1中描述的siRNA文库获得。本发明的额外的siRNA分子包括通过在此下文所述的方法而产生的siRNA文库中的分子。

本发明还提供“人工微RNA”或“amiRNA”，它们是能够表达siRNA分子的非天然发生的核酸序列。在本发明的一方面，使用大豆miRNA前体gma-MIR164的序列作为起始序列或主链以用于设计靶向线虫的、将在植物宿主中表达的人工微RNA。用于大豆中使用的这种人工微RNA的设计描述于美国临时申请61/421275中，并且用于拟南芥中的amiRNA的用途的类似方法由Schwab（施瓦布）等人描述于（2006）Plant Cell（《植物细胞》）18,1121-1133中，两者均以其全文结合在此。本发明的代表性amiRNA包括：包括SEQ ID NO:1–14的任一个的siRNA的amiRNA，例如列出为SEQ ID NO:16-29的amiRNA。

上述siRNA、或其中的种子或非种子序列、或其前体（例如初级miRNA和前miRNA）可以进一步通过一个或多个核苷酸的添加、删除、置换、和/或改变而改变，从而导入变化；从而修饰特异性；从而改变互补性；从而导入或去除二级结构元件，例如错配、凸起、环、单链区、双链区、突出、或其他基序；从而增强或维持RNA在体外或体内RISC复合体中被加工的能力；从而改进RNA分子在体外或体内的稳定性（即RNA分子被保持而不被核酸酶降解的能力，和/或它的折叠成稳定二级或三级结构的能力）；和/或从而增强与靶标基因/RNA杂交的能力。

共享实质性程度的互补性的核酸将例如通过匹配碱基对而形成彼此间的稳定的相互作用。术语“互补的”或“互补性”是指在核酸中的核苷酸碱基的特异性碱基配对。如在此使用的短语“完美的互补性”是指在核酸的连续区域内，例如如在此所述的siRNA与它的在靶标基因/RNA中的互补序列之间的完全（100%）的碱基配对“部分互补性”或“部分互补的”是指两个序列可以彼此发生碱基配对，尽管互补性不是100%。如在此使用，短语“与一个序列互补的序列”用于描述能够与另一个序列发生碱基配对的核苷酸序列，虽然互补性可以不是100%。

可替代地说明的，关于两个核苷酸序列的短语“与一个序列互补的序列”指示这两个核苷酸序列具有足够的互补性并且具有与彼此相互作用以形成双链分子的天然趋向。两个核苷酸序列可以在序列互补性的宽范围内彼此形成稳定的相互作用。具有高度互补性的核苷酸序列大体上比具有低度互补性的核苷酸序列更强和/或更稳定。对于不同的过程可以需要不同强度的相互作用。例如，用于在体外形成稳定核苷酸序列双链体的目的的相互作用的强度可以不同于用于在体内形成siRNA和结合序列之间稳定相互作用的目的的相互作用的强度。相互作用的强度可以易于由本领域普通技术人员经实验确定或者用适当的软件预测。

如在此使用，术语“杂交”（“hybridize”）或“杂交”（“hybridization”）是指核酸序列或分子与互补序列碱基配对并且形成双链体核酸结构的能力。杂交可以用于测试两个多核苷酸是否基本上彼此互补，并且用于测量相互作用有多么稳定。享有足够程度互补性的多核苷酸将在不同的杂交条件下彼此杂交。因此，享有高度互补性的多核苷酸因此形成强的稳定的相互作用并且将在严格杂交条件下彼此杂交。“严格杂交条件”在本领域中是熟知的，如描述于Sambrook（萨姆布鲁克）等人（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室指南》），第二版，Cold Spring Harbor Laboratory（冷泉港实验室），冷泉港，纽约州。示例性严格杂交条件包括在6×氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中，在约45℃的杂交，随后在50℃-65℃在0.2×SSC和0.1%SDS中进行一次或多次洗涤。

如在此使用，“同源的”、“同源性”、“一致的”、以及“一致性”是指在核酸序列中的比较。当提及核酸分子时，“同源性”、“相似性”、“一致性”、或“百分比一致性”是指这样一种具体核酸序列的核苷酸百分比：该具体核酸序列已经通过序列分析程序被匹配为相似的或一致的核苷酸序列。如在本领域中已知，序列“一致性”或“相似性”是两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较这些序列所确定的。在本领域中，一致性还意为在多核苷酸序列之间的序列关联性的程度，如通过在此类序列之间的匹配所确定。为了确定两个核酸序列的一致性或相似性百分比，出于最佳比较的目的将序列进行比对（即缺口可以导入第一核酸序列的序列中，用于与第二核酸序列的最佳比对）。然后比较在相应核苷酸位置处的核苷酸。当在第一序列中的位置是由如在第二序列中的相应位置的相同的或相似的核苷酸占据时，则对应地分子在那个位置是一致的或相似的。在两个序列之间的一致性或相似性百分比是由序列共享的相同的或相似的位置的数目的函数（即，一致性百分比（%）是一致位置的数目除以位置的总数目（例如，重叠位置）×100）。共享100%序列一致性的两个序列是一致的。共享小于100%一致性但是大于50%一致性的两个序列是相似的。具有小于50%一致性的序列是不相似的。

一致性和相似性两者均能易于计算。通常被采用以确定序列之间一致性或相似性的方法包括但不局限于在Carillo（卡里略）等人（1988）SIAM J.Applied Math.（《工业和应用数学学会应用数学杂志》）48,1073中披露的那些。被用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin（卡尔林）等人（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）87,2264-2268的算法，修改的如在Karlin（卡尔林）等人（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）90,5873-5877中。这样一种算法被结合进Altschul（阿尔丘尔）等人（1990）J Mol.Biol.（分子生物学杂志）215,403-410的NBLAST和XBLAST程序中。为了获得用于比较目的的缺口比对（gappedalignment），可以利用如在Altschul（（阿尔丘尔））等人（1997）Nucleic Acids Res.（《核酸研究》），25:3389-3402中描述的GappedBLAST。可替代地，可以使用PSI-Blast进行迭代搜索，该迭代搜索检测在分子之间的远的关系。当使用BLAST、Gapped BLAST、以及PSI-Blast程序时，可以使用对应程序（例如XBLAST和NBLAST）的缺省参数。额外地，还可以使用FASTA方法。参见Altschul（阿尔丘尔）等人（1990）J.Mol.Biol.（《分子生物学杂志》）215,403-410。对于比较序列有用的数学算法的另一个实例是Myers（迈尔斯）等人（1988）CABIOS（《生物科学中的计算机应用》）4,11-17的算法。在两个序列之间的一致性百分比还可以使用Needleman（尼德曼）和Wunsch（温施）（1970）J.Mol.Biol.（《分子生物学杂志》）48,443-453的算法来确定。另一个用于计算两个序列之间的一致性百分比的算法是使用局部同源法来确定。Smith（史密斯）和Waterman（沃特曼）（1981）J.Mol.Biol.（《分子生物学杂志》）147,195-197。最优比对可以通过插入缺口以使匹配数目最大化来产生。

本发明提供了用于使用小干扰RNA（siRNA）而衰减或抑制细胞中的基因表达的方法。siRNA包含在细胞的生理条件下与有待抑制的基因（即靶标基因）的靶标mRNA的至少一部分核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。在此描述的方法不要求siRNA与靶标基因之间的100%序列一致性或互补性。通过利用生物信息学工具，序列可以包含错配核苷酸对。因此，本发明的方法具有能够耐受一些序列变化的优点，由于基因突变、株多态性、或进化趋异可能预期到这些序列变化。

在不受理论约束的情况下，认为根据本发明的经转化的植物转录一种或多种具有与有害生物靶标基因同源的区域以及互补的区域的RNA分子，并且其中这一个或多个转录物形成双链RNA分子（dsRNA）。植物将dsRNA识别为潜在的外源物质（例如病毒源的物质）。植物的dicer酶将双链RNA切为具有约23个核苷酸长度的单链RNA片段，称为小干扰RNA（siRNA）。这些siRNA通过已经由植物细胞（例如角质）的消化进入植物的侵入有害生物而被消耗。一旦被吸收，siRNA可以结合进有害生物的RNA诱导的沉默复合体中。然后RISC复合体可以消化有害生物的同源基因的mRNA，限制了有害生物危害植物的能力。

siRNA文库

多个上述siRNA分子，即两个或更多个siRNA，可以用于制备siRNA文库。基于siRNA分子的靶标特异性设计，此类文库提供了用于筛选靶标有机体中所希望的表型的有效手段。

因此，在本发明的一方面中，制备小干扰RNA（siRNA）文库的方法包括合成多个RNA分子，其中每个RNA分子包括(a)包括随机核苷酸的种子序列，以及(b)包括特指核苷酸的非种子序列。在本发明的另一方面，制备小干扰RNA（siRNA）文库的方法包括合成多个RNA分子，其中每个RNA分子包括(a)包括一些核苷酸的种子序列，这些核苷酸代表靶标有机体或与靶标有机体相关的有机体的一个或多个微RNA种子序列，以及(b)包括特指核苷酸的非种子序列。

根据所披露的方法，可以通过多个siRNA分子中的每一个的实际合成来制备文库，这可以使用如本领域中已知的技术（包括自动化学合成）、任选地使用核苷酸的混合物以创造随机序列来完成。本发明还涵盖文库的计算机制备，即使用计算机技术以产生多个siRNA分子的每一个的序列。在许多实例中，计算机文库制备将对于文库制备的初始步骤中是有用的，包括如以下进一步所述，用于排除siRNA分子从而由此富集靶标特异性序列的步骤。

在本发明的一个方面中，siRNA文库包括siRNA分子，其中每个分子包含随机种子序列，即四个标准核糖核苷酸（即腺苷、胞苷、鸟苷、以及尿苷）的每个可能的组合是随机地呈现在该随机种子序列内的各个位置。在本发明的其他方面，siRNA文库的制备涉及排除具有低复杂性和/或低特异性的siRNA分子的一个或多个步骤。

例如，在本发明的一些方面，制备文库的方法可以进一步包括(a)将在种子序列内包括一个或多个以低频率存在于靶标有机体或与靶标有机体相关的有机体的微RNA序列的相应位置处的核苷酸的RNA分子排除；(b)将在种子序列内包括同型四联体的RNA分子排除；和/或(c)将包括在位置1-9处具有比在位置11-19处的非种子序列的GC含量更多的GC含量的种子序列的RNA分子排除。

以低频率存在于靶标有机体的miRNA中的核苷酸的描述是指在一组天然发生的miRNA中观察到的小于约50%、或小于约45%、或小于约40%、或小于约35%、或小于约30%、或小于约25%、或小于约20%、或小于约15%、或小于约10%、或小于约5%的发生率。

可替代地说明的，如果siRNA在种子序列内包含在天然发生的miRNA中的阈值水平观察到的核苷酸，则可以保留文库中的siRNA。此类阈值水平可以如所希望的而变化，其中更高阈值大体上与增加的靶标特异性相关。例如，阈值水平可以是核苷酸在天然发生的miRNA中被观察到的至少约1%、或更大的频率，或约5%或更大、或约10%或更大、或约20%或更大、或约30%或更大、或约40%或更大、或约50%或更大、或约60%或更大、或约70%或更大、或约80%或更大、或约90%或更大、或约95%或更大。在本发明的一个具体方面，频率阈值是指与从秀丽隐杆线虫基因组调查的种子序列的一致序列相比，在种子序列中的相应位置处以大于约20%而存在的核苷酸。参见实例1。在本发明的另一方面，频率阈值是指与从赤拟谷盗基因组调查的种子序列的一致序列相比，在种子序列中的相应位置处以大于约20%而存在的核苷酸。参见实例6。

“同型核苷酸四联体”是指在种子序列内依次重复四次的相同的核苷酸，例如AAAA。

序列的“GC含量”（或鸟苷-胞苷含量）是指在核酸分子或序列或序列的特定区域中是鸟苷亦或胞苷的碱基的百分比。例如，当种子序列具有至少约60%、至少约50%、或至少约40%、或至少约30%、或至少约20%、或至少约10%、或至少约5%、或至少约1%的GC含量时，同样对应地非种子序列具有最多约40%、最多约50%、或最多约60%、或最多约70%、或最多约80%、或最多约90%、或最多约95%、或最多约99%的GC含量。

可替代地或另外地，制备文库的方法可以进一步包括排除与宿主核酸互补的RNA分子的步骤。以此方式，文库的siRNA分子将不包括对于宿主有机体中的基因沉默而言可能有功能的siRNA。

“宿主”是预期用于siRNA表达或生产的有机体。在本发明的一方面，宿主有机体与靶标有机体相同，即siRNA被表达或产生在预期在其中是有功能的相同的有机体中。在本发明的另一方面，宿主有机体充当siRNA到靶标有机体的运载体。作为一个实例，宿主有机体可以包括一种植物，其中该靶标有机体是植物的有害生物或病原体。在本发明的具体方面，宿主有机体是大豆。

在本发明的其他方面，宿主有机体是玉蜀黍。

本发明的siRNA文库包括如在此所述的siRNA分子。因此，在该文库内的siRNA分子的种子和非种子序列可以包括靶标特异性的种子和非种子序列（包括共有序列），如在此上文中所述。本发明的范围不局限于这样一种文库：该文库包括在此披露了其具体序列的siRNA。相反，可以使用来自任何有机体（已知的以及当前未知的两者）的序列而根据所披露方法制备靶标特异性siRNA，如在此下文进一步描述。

包括siRNA的额外组合物

本发明还提供了包括所披露的siRNA、人工miRNA、以及siRNA文库的核酸。此类核酸总体上对于siRNA以它们可以接触靶标核酸（即有待被siRNA调节的核酸）的方式而生产或表达是有用的。

在本发明的背景下，短语“核酸”或术语“核苷酸”是指寡核苷酸和多核苷酸，例如核糖核苷酸（RNA）和脱氧核糖核苷酸（DNA）。可应用的话，短语核酸还应被理解为包括单链（例如有义或反义）和双链多核苷酸。根据本发明的核酸可以是部分或全部合成的，并且可以是分离的和/或纯化的（即从它们的天然环境），处于基本上纯的或均质的形式、或没有或基本上没有其他核酸。

包括本发明的siRNA的代表性核酸包括表达构建体和载体。术语“表达构建体”是指适用于在细胞中表达或生产的核酸。术语“载体”是指可以用于将本发明的异源的或天然的多核苷酸递送至宿主细胞中的核酸分子（质粒、病毒、噬菌体、人工的、异源的或经切割的DNA分子）。载体能够被复制并且包含用于导入外源多核苷酸的克隆位点。

本领域普通技术人员易于能制备在此披露的本发明的表达构建体和载体，并且重组地表达它们。对于进一步的细节参见例如Sambrook（萨姆布鲁克）等人（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室指南》），第二版，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.（纽约州）。用于操纵核酸的此类可应用的技术和方案，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA导入细胞中以及基因表达、以及蛋白的分析均详细描述于Protocols in Molecular Biology（《分子生物方案》），第二版，Ausubel（奥苏贝尔）等人编，John Wiley&Sons（约翰威利父子公司），1992中。

在植物上取得广泛成功的先前使用的特异性表达技术和载体由Bevan（贝文），Nucl.Acids Res.（《核酸研究》）（1984）12,8711-8721、以及Guerineau（盖里纳）和Mullineaux（马利诺），（1993）“Plant transformation and expression vectors，”（“植物转化和表达载体”）Plant Molecular Biology Labfax(Croy（克罗伊）RRD，编）Oxford（牛津），BIOS Scientific Publishers（BIOS科学出版商），121-148描述。

表达构建体包括一个启动子，该启动子可操作地连接至包括如在此上文所述的siRNA（例如，人工微RNA）的核酸。有用的启动子包括组成型启动子、在空间和时间上指导受调节的表达的启动子（例如组织特异性启动子以及发育阶段特异性启动子）、以及诱导型启动子。表达构建体还可以包括如本领域中已知的基因表达的增强子。

可以利用组织优先启动子以靶向在具体植物组织内的感兴趣序列的增强表达。组织优先启动子包括Yamamoto（山本）等人（1997）Plant J.（《植物杂志》）12,255-265；Kawamata（川俣正）等人（1997）PlantCell Physiol.（《植物细胞生理学》）38,792-803；Hansen（汉森）等人（1997）Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学和基因组学》）254,337-343；Russell（拉塞尔）等人（1997）Transgenic Res.（《转基因研究》）6,157-168；Rinehart（莱因哈特）等人（1996）Plant Physiol.（《植物生理学》）112,1331-1341；Van Camp（范坎普）等人（1996）Plant Physiol.（《植物生理学》）112,525-535；Canevascini（坎尼瓦塞尼）等人（1996）Plant Physiol.（《植物生理学》）112,513-524；Yamamoto（山本）等人（1994）Plant Cell Physiol.（《植物细胞生理学》）35,773-778；Lam（拉姆）（1994）Results Probl.Cell Differ.（《细胞分化的结果与问题》）20,181-196；Orozco（奥罗兹科）等人（1993）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）23,1129-1138；Matsuoka（松冈）等人（1993）Proc Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）90,9586-9590；以及Guevara-Garcia（格瓦拉-加西亚）等人（1993）Plant J.（《植物杂志》）4,495-505。如果需要，此类启动子可以被修饰用于微弱表达。

叶子优先的启动子在本领域中是已知的。参见例如Yamamoto（山本）等人（1997）Plant J.（《植物杂志》）12,255-265；Kwon（权）等人（1994）Plant Physiol.（《植物生理学》）105,357-67；Yamamoto（山本）等人（1994）Plant Cell Physiol.（《植物细胞生理学》）35,773-778；Gotor（哥特）等人（1993）Plant J.（《植物杂志》）3,509-18；Orozco（奥罗斯科）（1993）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）23,1129-1138；以及Matsuoka（松冈）等人（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）90,9586-9590。此外，还可以使用cab和rubisco的启动子。参见例如Simpson（辛普森）等人（1958）EMBO J.（《欧洲分子生物学组织杂志》）4,2723-2729以及Timko（蒂姆科）等人（1988）Nature（《自然》）318,57-58。

根优先的启动子是已知的，并且可以从可得自文献中的许多来选择，或者从不同的相容物种重新分离。参见例如Hire（海尔）等人（1992）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）20,207-218（大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因）；Keller（凯勒）和Baumgartner（鲍姆加特纳）（1991）Plant Cell3（《植物细胞3》），1051-1061（在法国菜豆的GRP1.8基因中的根特异性控制元件）；Sanger（桑格）等人（1990）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）14,433-443（根瘤土壤杆菌的甘露碱合成酶（MAS）基因的根特异性启动子）；以及Miao（苗）等人（1991）Plant Cell3（《植物细胞3》），11-22（即对在大豆的根和根瘤中表达的胞质谷氨酰胺合成酶（GS）进行编码的全长cDNA克隆）。还参见Bogusz（博古什）等人（1990）Plant Cell2（《植物细胞2》），633-641，其中描述了从来自固氮的非豆科植物榆科山黄麻（Parasponia andersonii）以及相关的非固氮的非豆科植物山黄麻（Trema tomentosa）的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子被连接至13-葡萄糖醛酸酶报道基因并且被导入非豆科植物烟草（Nicotiana tabacum）以及豆科植物百脉根（Lotus corniculatus）两者中，并且在两个实例中根特异性启动子活性被保留。Leach（利奇）和Aoyagi（青柳）（1991）描述了他们对发根土壤杆菌的高表达的roIC和roID根诱导基因的启动子的分析。参见Plant Science（《植物科学》）（Limerick（利默里克））79,69-76。他们推断在那些启动子中增强子和组织优先的DNA决定簇不相关联。Teen（提恩）等人（1989）使用与lacZ的基因融合以示出编码章鱼碱合酶的土壤杆菌属T-DNA基因尤其是在根尖的表皮中有活性，并且TR2′基因在完整植物中具有根特异性并且被叶组织中的创伤刺激，这是用于与杀昆虫的或杀幼虫的基因一起使用的特征的尤其所希望的组合。参见EMBO J.（《欧洲分子生物学组织杂志》）8343-350。与nptll（新霉素磷酸转移酶II）融合的TR1′基因示出相似特征。额外的根优先的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子和roIB启动子。还参见Kuster（奎斯特）等人（1995）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）29,759-772；Capana（卡潘纳）等人（1994）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）25,681-691。还参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；以及5,023,179。菜豆蛋白基因是由Murai（穆雷）等人（1983）在Science（《科学》）23,476-482、以及Sengopta-Gopalen（森古普塔-高普兰）等人（1988）在Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）82,3320-3324中进行了描述。

在一些方面，将有益的是使用诱导型启动子（例如来自有害生物或病原体诱导的启动子）来表达本发明的siRNA。此类启动子包括来自病程相关蛋白（PR蛋白）的那些，这些病程相关蛋白在由病原体侵染后被诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见例如Redolfi（雷多尔菲）等人（1983）Neth.J.Plant Pathol.（《荷兰植物病理学杂志》）89:245-254；Uknes（优卡尼斯）等人（1992）Plant Cell（《植物细胞》）4,645-656；以及Van Loon（范龙）（1985）PlantMol.Virol.（《植物分子病毒学》）4,111-116。还参见PCT国际申请号WO99/43819。

在有害生物侵染的位点处或附近局部地表达的启动子是特别感兴趣的。参见例如Marineau（马里洛尔）等人（1987）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）9,335-342；Matton（马东）等人（1989）MolecularPlant-Microbe Interactions（《植物-微生物分子相互作用》）2,325-331；Somsisch（绍姆希奇）等人（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）83,2427-2430；Somsisch（绍姆希奇）等人（1988）Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学和基因组学》）2,93-98；以及Yang（杨）（1996）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）93,14972-14977。还参见Chen（陈）等人（1996）Plant J.（《植物杂志》）10,955-966；Zhang（张）等人（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）91,2507-2511；Warner（华纳）等人（1993）Plant J.（《植物杂志》）3,191-201；Siebertz（赛贝茨）等人（1989）Plant Cell（《植物细胞》）1,961-968；美国专利号5,750,386（线虫诱导的）；Cordero（科德罗）等人（1992）Physiol.Mol.Plant.Path.（《生理与分子植物病理学》）41,189-200，以及在其中引用的参考文献。

额外地，当有害生物或病原体通过创伤或昆虫损害进入宿主植物时，伤口诱导型启动子可以用于本发明的构建体中。此类伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制子（pin II）基因（Ryan（赖安）（1990）Ann.Rev.Phytopath.（《植物病理学年度评论》）28,425-449；Duan（段）等人（1996）Nature Biotech.（《自然生物技术》）14,494-498）；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；winl和wing（Stanford（斯坦福）等人（1989）Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学和基因组学》）215,200-208)；系统素基因（systemin）（McGurl（麦格尔）等人（1992）Science（《科学》）225,1570-1573)；WIP1（Rohmeier（罗米耶）等人（1993）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）22,783-792；Eckelkamp（艾克尔坎普）等人（1993）FEBS Lett.（《FEBS快报》）323,73-76）；以及MPI基因（Corderok（科德拉克）等人（1994）PlantJ.（《植物杂志》）6,141-150）。已经报道在受伤的马铃薯植物的叶子中金属羧基肽酶-抑制剂蛋白的积聚（Graham（格雷姆）等人（1981）Biochem.Biophys.Res.Comm.（《生物化学与生物物理学研究通讯》）101,1164-1170）。其他研究已经集中于响应环境胁迫或刺激（例如盐度增加、干旱、以及病原体创伤）的可诱导调节的基因（Graham（格雷姆）等人，J.Biol.Chem.（《生物化学杂志》），260:6555-6560（1985）；Graham（格雷姆）等人，J.Biol.Chem.（《生物化学杂志》），260:6561-6564（1985），Smith（史密斯）等人，Planta（《植物》），168:94-100（1986））。其他的植物基因可以被茉莉酮酸甲酯、诱导子、热休克、厌氧胁迫、或除草剂安全剂诱导。

美国专利号5,589,622和5,824,876描述了在线虫附着后植物的取食位点处或邻近处特异性表达的植物基因的鉴定。然后这些植物靶标基因的启动子可以用于指导对有害生物靶标基因有害的amiRNA的特异性表达。

除了以上鉴定的启动子之外，美国专利申请公开号2004/0016025、2007/0056055、2008/0120750、2009/0183283、以及美国专利号7,550,578和7,615,624描述了来自水稻（Oryza sativa）和拟南芥的多种启动子，这些启动子也可以用于如在此所述的siRNA表达。刚命名的专利文件的具体启动子序列以及关于此类启动子的用途的披露通过引用结合在此。

可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。取决于目的，在应用化学品诱导基因表达时，启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学品阻抑基因表达时，启动子可以是化学阻抑型启动子。化学诱导型启动子在本领域中是已知的，并且包括但不局限于玉米In2-2启动子（它是由苯磺酰胺除草剂安全剂激活）、玉米GST启动子（它是由用作发芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活）、以及烟草PR-1a启动子（它是由水杨酸激活）。其他感兴趣的化学调节型启动子包括类固醇类固醇应答启动子（参见例如Schena（斯凯纳）等人（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）88,10421-10425以及McNellis（麦克内利斯）等人（1998）PlantJ.（《植物杂志》）14,247-257）中的糖皮质激素诱导型启动子）以及四环素诱导型和四环素阻抑型启动子（参见例如Gatz（加茨）等人（1991）Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学和基因组学》）227,229-237、以及美国专利号5,814,618和5,789,156.）。

一些适当的启动子仅或者主要在某些细胞类型中启动转录。因此，如在此所使用的，一种细胞类型的启动子或组织优先的启动子是优选在靶标组织中驱动表达、但也可以在其他细胞类型或组织中导致某种表达的启动子。应理解，示出靶标组织中表达的优先靶标性的一些启动子还可以在非优先靶标的组织中展现出“遗漏的”表达。一个实例可以是在玉米种子中其表达谱示出优先表达、然而在成熟的叶组织中展现强表达的启动子。用于在植物基因组DNA中鉴定并表征启动子区的方法包括例如在以下参考文献中所说明的那些：Jordano（约旦）等人（1989）Plant Cell（《植物细胞》）1,855-866；Bustos（布斯托斯）等人（1989）Plant Cell（《植物细胞》）1,839-854；Green（格林）等人（1988）EMBO J.（《欧洲分子生物学组织杂志》）7,4035-4044；Meier（迈耶）等人（1991）Plant Cell（《植物细胞》）3,309-316；以及Zhang（张）等人（1996）Plant Physiol.（《植物生理学》）110,1069-1079。

为了驱动绿色组织（如叶和茎）中的转录而在光合组织中有活性的启动子是本发明特别感兴趣的。最适合的是仅或主要在此类组织中驱动表达的启动子。该启动子可以组成性地赋予遍及该植物的表达（或相对于绿色组织差异性地、或相对于其中发生表达的绿色组织的发育阶段差异性地、或响应外部刺激）。此类启动子的实例包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（RbcS）启动子，如来自北美落叶松（Larix laricina）的RbcS启动子、松树cab6启动子（Yamamoto（山本）等人（1994）Plant CellPhysiol.（《植物细胞生理学》）35,773-778）、来自小麦的Cab-1基因启动子（Fejes（费耶斯）等人（1990）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）15,921-932）、来自菠菜的Cab-1启动子（Lubberstedt（拉伯斯泰特）等人（1994）Plant Physiol.（《植物生理学》）104,997-1006）、来自稻的cab1R启动子（Luan（卢兰）等人（1992）Plant Cell（《植物细胞》）4,971-981）、来自玉米的丙酮酸正磷酸双激酶（PPDK）启动子（Matsuoka（松冈）等人（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）90:9586-9590）、烟草Lhcb1*2启动子（Cerdan（塞尔当）等人（1997）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）33,245-255）、拟南芥SUC2蔗糖-H+共输送体启动子（Truernit（特鲁尼特）等人（1995）Planta（《植物》）196,564-570）、以及来自菠菜的类囊体膜蛋白启动子（psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS）。在美国专利公开号2007/0006346中描述了在茎、叶和绿色组织中驱动转录的其他启动子。

任何上述启动子或其他已知的启动子可以用于表达本发明的siRNA。本领域普通技术人员能够易于在适当时选择用于具体应用的启动子。

本发明的表达构建体和载体可以用于制备赋予靶标或宿主有机体性状的组合物，如在此下文所述。在本发明的一方面中，这种组合物是一种杀线虫组合物，该杀线虫组合物包括：包括SEQ ID NO:1–14的任一个的核苷酸2-8的siRNA，例如包括SEQ ID NO:1–14列出的序列的siRNA。用于赋予性状的组合物还包括两种或更多种siRNA。

靶标有机体

靶标有机体是本发明的siRNA预期在其中是有功能（即介导基因沉默或抑制）的有机体。在本发明的一方面中，靶标有机体也是宿主有机体，如在此下文所述。在本发明的其他方面中，靶标有机体是分开的并且不同于充当在靶标有机体中有功能的siRNA来源的宿主有机体。

如在此使用，术语“靶标”（“targeting”或“target”）是指在一个具体有机体中，siRNA分子与互补的mRNA分子形成碱基对、由此导致基因沉默或抑制的能力。这种有机体称为靶标有机体。“靶标核酸”或“靶标序列”是来自靶标有机体或在靶标有机体中的核酸序列或分子。靶标序列还隐含被选择用于抑制的核酸序列，并且不局限于编码多肽的多核苷酸。靶标序列典型地包括基本上或完全与siRNA互补的序列。靶标序列包括但不局限于包括靶标序列的RNA、DNA、或其他多核苷酸。

在本发明的一方面中，“靶标有机体”是植物有害生物或病原体，它们对植物的损害可以根据本发明被减轻或消除。代表性植物有害生物和病原体包括昆虫、线虫、真菌、细菌、病毒、以及寄生植物（例如独脚金属（striga）、菟丝子、以及槲寄生（mistletoe））。根据本发明可以被靶向的昆虫有害生物包括不局限于咀嚼型、吮吸型、以及蛀孔型昆虫，这些昆虫属于例如非限制性的目：鞘翅目、双翅目、半翅目、异翅亚目、同翅目、膜翅目、鳞翅目、以及直翅目。此类昆虫有害生物的非限制性实例示于表1中。可以根据本发明被靶向的线虫的非限制性实例包括列于表2中的那些。可以根据本发明被靶向的真菌、霉菌、以及锈菌的非限制性实例包括列于表3中的那些。细菌的非限制性实例示于表4中。可以被靶向的植物病毒的非限制性实例示出于表5中。

如在此使用，“非靶标有机体”是除了靶标有机体之外的任何有机体。在靶标有机体和宿主有机体不同时，非靶标有机体可以包括宿主有机体以及消费宿主有机体或以另外方式接触在宿主有机体中表达的siRNA的有机体。如在此所述，siRNA的靶标特异性设计规定此类siRNA在非靶标有机体中具有很少的或没有基因沉默活性。

宿主有机体

如在此使用，“宿主”或“宿主有机体”是指表达或产生siRNA的有机体。宿主有机体可以瞬时地或稳定地表达siRNA。宿主有机体可以是一种转基因有机体。在本发明的一方面，宿主有机体与靶标有机体相同，即siRNA被表达在预期发挥功能的相同有机体中。在本发明的另一方面，宿主有机体充当siRNA到靶标有机体的运载体。作为一个非限制性实例，宿主有机体是一种植物，其中该靶标有机体是植物的有害生物或病原体。在另一个实例中，宿主有机体可以是靶标有机体的食物来源。

“宿主核酸”是来自宿主有机体或在宿主有机体中的核酸，例如来自植物或植物部分或者在植物或植物部分中的核酸。

如在此使用，关于siRNA或miRNA的术语“表达”是指由其启动子驱动的siRNA/miRNA核苷酸序列的转录。如在此使用，表达还包括从更大的RNA转录物产生siRNA或miRNA。这样，宿主有机体可以表达这样一种RNA：该RNA被加工以产生或表达一种或多种siRNA或miRNA。

作为宿主有机体有用的植物包括植物界的不同的光合的、真核的、多细胞的任何有机体，包括单子叶植物和双子叶植物这二者。术语“植物”包括关于全部植物、植物部分、植物器官、植物组织、植物细胞、种子、以及它们的子代。植物细胞包括不局限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生区、愈伤组织、叶、根、嫩枝、配子体、孢子体、花粉、以及小孢子的细胞。植物还指稳定地或瞬时地表达基因产物（包括siRNA）的植物或植物部分。

“植物部分”是植物的任何部分，不管它是否分离或附接至完整的植物。短语“植物部分”包括已分化的和未分化的组织，包括但不局限于以下项：根、茎、嫩枝、叶、花粉、种子、肿瘤组织、以及细胞和培养物的不同形式（例如，单一的细胞、原生质体、胚、以及愈伤组织）。植物组织可以在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。植物部分还包括植物产品，例如谷物、种子、果实、以及坚果或商品。

“植物产品”是指从植物、植物部分或种子创造的农业或商业产品。植物产品的非限制性实例包括花、花粉、叶子、藤、茎、果实、蔬菜、瓜类蔬菜、根、块茎、球果、荚、种子、豆类、谷物、核、以及壳。

一些植物产品被加工并且因此变成“商品”。如在此使用，“商品”包括但不局限于：整个或经处理的种子、豆类、谷物、核、壳、谷类粗粉、粗磨粉、面粉、糖、淀粉、蛋白浓缩物、蛋白、脂类、糖类、核酸、代谢物、叶绿素、蜡、油、浸出物、汁、浓缩物、液体、糖浆、饲料、青贮饲料、纤维、木材、纸浆、纸、颜料、天然产物、毒素、或其他从植物生产的食物或产品。

包含本发明的一种或多种核酸序列的，或者从含有本发明的一种或多种核酸序列的经转化植物、重组植物、或种子产生的商品确切地被考虑为本发明的方面，作为一种鉴别或检测植物产品或商品的来源的手段。这样的方面在此称为“生物样品”。在一种或多种生物样品中的本发明的一种或多种核酸序列的鉴别或检测是植物产品或商品包括在此披露的本发明的植物或植物部分的事实证据。

如在此使用，“本发明的核苷酸序列”包括如在此披露的siRNA、miRNA、或它们的构建体。本发明的此类核苷酸序列可以用于使用本领域普通技术人员已知的任何多种技术（例如通过基于PCR的方法，DNA印迹、RNA印迹、或微阵列分析）来鉴别包含本发明的一种或多种核苷酸序列的植物、植物产品、或商品。在这个具体方面，本发明的核苷酸序列（即siRNA或miRNA）的功能性是无形的，并且在植物或植物产品中该核苷酸序列的存在用于确切地鉴别或检测植物部分、植物产品、或商品的来源。

代表性宿主植物包括大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、卡罗拉油菜（canola）（欧洲油菜、芜菁亚种（Brassica rapa ssp.））、苜蓿（紫苜蓿（Medicago sativa））、水稻（Oryza sativa）、黑麦（Secalecereale）、高粱（两色蜀黍（Sorghum bicolor）、Sorghum vulgare）、向日葵（Helianthus annuus）、小麦（Triticum aestivum）、烟草（Nicotiana tabacum）、马铃薯（阳芋（Solanum tuberosum））、花生（Arachis hypogaea）、棉花（陆地棉（Gossypium hirsutum））、甘薯（Ipomoea batatas）、木薯（Manihot esculenta）、咖啡（咖啡属亚种）、椰子（Cocos nucifera）、菠萝（Ananas comosus）、柑桔树（柑橘属物种）、可可（Theobroma cacao）、茶（茶树（Camelliasinensis））、香蕉（芭蕉属物种）、鳄梨（Persea americana）、无花果（Ficus carica）、番石榴（Psidium guajava）、芒果（Mangiferaindica）、橄榄（油橄榄（Olea europaea））、番木瓜（Caricapapaya）、腰果树（Anacardium occidental）、澳洲坚果（Macadamiaintegrifolia）、扁桃（巴旦杏（Prunus amygdalus））、甜菜（Betavulgaris）、燕麦、大麦、蔬菜类、观赏物、以及松柏类植物。

本发明的额外的宿主植物是作物植物，例如谷类以及干豆、玉米、小麦、马铃薯、树薯（tapioca）、水稻、高粱、粟、木薯（cassava）、大麦、豌豆、以及其他根、块茎、或种子作物。用于本发明的重要的种子作物是油籽油菜、甜菜、玉米、向日葵、大豆、以及高粱。可以应用于本发明的园艺植物可以包括莴苣、菊苣、以及蔬菜芸苔属（包括卷心菜、西建兰以及花椰菜），以及香石竹、天竺葵、喇叭花、以及秋海棠。本发明可以应用于烟草、瓜类蔬菜、胡萝卜、草莓、向日葵、番茄、胡椒、菊、杨木、桉树、以及松木。任选地，本发明的植物包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。任选地，本发明的植物包括油籽植物。油籽植物包括卡罗拉油菜（canola）、棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉米、苜蓿、棕榈、椰子、等。任选地，本发明的植物包括豆科植物。豆科植物包括豆类（beans）和豌豆（peas）。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、滨豆、鹰嘴豆、等。在本发明中有用的宿主植物是行间作物和撒播作物。有用的行间作物的非限制性实例是玉米、大豆、棉花、苋菜、蔬菜、水稻、高粱、小麦、买罗高粱、大麦、向日葵、硬粒小麦、以及燕麦。有用的撒播作物的非限制性实例是向日葵、粟、水稻、高粱、小麦、买罗高粱、大麦、硬粒小麦、以及燕麦。在本发明中有用的宿主植物是单子叶植物和双子叶植物。有用的单子叶植物的非限制性实例是水稻、玉米、小麦、棕榈树、草坪草、大麦、以及燕麦。有用的双子叶植物的非限制性实例是大豆、棉花、苜蓿、卡罗拉油菜、亚麻、番茄、甜菜、向日葵、马铃薯、烟草、玉米、小麦、水稻、莴苣、芹菜、黄瓜、胡萝卜、以及花椰菜、葡萄、以及草坪草。在本发明中有用的宿主植物包括出于美学或嗅觉上的益处而栽培的植物。非限制性实例包括有花植物、树、草、阴生植物、以及开花的和不开花的观赏植物。在本发明中有用的宿主植物包括用于营养价值、纤维、木材、以及工业产品而栽培的植物。

本领域普通技术人员将认识到，多种多样的宿主细胞可以用根据在此披露的本发明的载体来转化。此类细胞的非限制性实例是在胚性组织、I型、II型和III型愈伤组织、下胚轴、分生组织、根组织、用于在韧皮部的表达的组织、等中的那些细胞。

几乎所有的植物组织可以使用适当的在此描述的技术而在未分化期间被转化。受体细胞靶标包括但不局限于分生细胞、I型、II型、和III型愈伤组织、未成熟的胚、以及配子细胞（例如小孢子、花粉、精子、以及卵细胞）。在此考虑到，从其可以再生任何能育植物的任何细胞作为受体细胞是有用的。I型、II型、和III型愈伤组织可以起发自包括但不局限于以下项的组织来源：未成熟的胚、未成熟的生殖苞、幼苗顶端分生组织、小孢子、等。

能够作为愈伤组织增殖的那些细胞也是用于遗传转化的受体细胞。用于转化未成熟胚以及后续的能育转基因植物的再生的技术在本领域中是熟知的。未成熟胚的直接转化排除了受体细胞培养物长期发育的需要。花粉以及它的祖细胞小孢子可以能够发挥作为用于遗传转化的受体细胞的功能、或者发挥作为携带用于在受精过程中掺入的外源DNA的载体的功能。直接的花粉转化排除了细胞培养的需要。

分生细胞（即能够连续进行细胞分裂并且其特征在于未分化的细胞学形态的植物细胞，正常在植物的生长点或组织（例如根尖、茎端、侧芽等）处发现）可以代表另一类型的受体植物细胞。由于它们的未分化的生长以及用于器官分化和全能性的能力，单个经转化的分生细胞可以恢复为完全转化的植物。事实上，认为胚性悬浮培养物可以是由培养基环境控制的体外分生细胞系统，保留了在未分化状态下进行连续细胞分裂的能力。

多种多样的技术对于在允许siRNA的稳定维持以及表达的条件下将本发明的siRNA导入宿主中是可用的。转化技术的具体选择将是由其转化某些植物物种的效率连同用选择的具体方法学实践本发明的人员的经验和偏好来确定。对于技术人员将清楚的是，将核酸导入植物细胞的转化系统的具体选择对于本发明不是必要的或不是本发明的限制，用于植物再生的技术的选择对于本发明也不是必要的或也不是本发明的限制。

转化方案连同用于将异源核酸导入植物中的方案可以取决于被靶向用于转化的植物或植物细胞的类型（即单子叶植物或双子叶植物）而变化。导入DNA构建体的适合的方法包括显微注射（Crossway（克罗思维）等人（1986）Biotechniques（《生物技术》）4,320-334；以及美国专利号6,300,543）；有性杂交，电穿孔（Riggs（里格斯）等人（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）83,5602-5606）；土壤杆菌属介导的转化（Townsend（汤森）等人，美国专利号5,563,055和5,981,840）；直接基因转移（Paszkowski（帕克沃斯基）等人（1984）EMBO J.（《欧洲分子生物学组织杂志》）3,2717-2722）；以及弹道离子加速（ballistic particle acceleration）（参见例如Sanford（桑福德）等人，美国专利号4,945,050；Tomes（托姆斯）等人，美国专利号5,879,918；Tomes（托姆斯）等人，美国专利号5,886,244；Bidney（比得尼）等人，美国专利号5,932,782；在Gamborg（甘贝格）和Phillips（菲利普斯）编写的Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods（《植物细胞、组织与器官培养：基本方法》）（Springer-Verlag（施普林格出版社），柏林）中的Tomes（托姆斯）等人（1995）“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment,”（“经由微粒轰击将DNA直接转移进完整的植物细胞中”）；以及McCabe（麦凯布）等人（1988）Biotechnology（《生物技术》）6,923-926）。还参见Weissinger（威辛格）等人（1988）Ann.Rev.Genet.（《遗传学年度评论》）22,421-477；Sanford（桑福德）等人（1987）Particulate Science and Technology（《微粒科学与技术》）5,27-37（洋葱）；Christou（克里斯托）等人（1988）Plant Physiol.（《植物生理学》）87,671-674（大豆）；Finer（费恩尔）和McMullen（麦克马伦）（1991）In Vitro Cell Dev.Biol.（《体外细胞发育生物学》）27P,175-182（大豆）；Singh（辛格）等人（1998）Theor.Appl.Genet.（《遗传学理论与应用》）96,319-324（大豆）；Datta（达塔）等人（1990）Biotechnology（《生物技术》）8,736-740（水稻）；Klein（克莱因）等人（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）85,4305-4309（玉米）；Klein（克莱因）等人（1988）Biotechnology（《生物技术》）6,559-563（玉米）；Tomes（托姆斯），美国专利号5,240,855；Buising（比辛）等人,美国专利号5,322,783和5,324,646；Klein（克莱因）等人（1988）Plant Physiol.（《植物生理学》）91,440-444（玉米）；Fromm（弗洛姆）等人(1990)Biotechnology（《生物技术》）8,833-839（玉米）；Hooykaas-Van（霍伊卡-范）Slogteren（斯洛格特伦）等人（1984）Nature（《自然》）311,763-764；Bowen（鲍恩）等人，美国专利号5,736,369（谷类）；Bytebier（佰特比尔）等人（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）84,5345-5349（百合科）；De Wet（德维特）等人（1985）在TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues（《胚珠组织的实验操作》）,Chapman（查普曼）等人编（Longman（朗文公司），纽约)中的197-209页（花粉）；Kaeppler（凯普勒）等人（1990）Plant Cell Reports（《植物细胞报告》）9,415-418以及Kaeppler（凯普勒）等人（1992）Theor.Appl.Genet.（《遗传学理论与应用》）84,560-566（晶须（whisker）介导的转化）；D’Halluin等人（1992）Plant Cell（《植物细胞》）4,1495-1505（电穿孔）；Li（李）等人（1993）Plant Cell Reports（《植物细胞报告》）12,250-255以及Christou（赫里斯图）和Ford（福特）（1995）Annals of Botany（《植物学年报》）75,407-413（水稻）；Osjoda（奥斯乔达）等人（1996）Nature Biotechnology（《自然生物技术》）14,745-750（经由根瘤土壤土壤杆菌的玉米）；美国专利号5,736,369（分生组织转化）；以及美国专利号5,302,523和5,464,765（晶须技术（whiskers technology））。

本发明的核酸可以通过用病毒或病毒核酸接触植物而被导入植物中。通常，此类方法涉及将本发明的表达构建体掺入病毒DNA或RNA分子内。另外，应认识到，有用的启动子涵盖被用于由病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。用于涉及病毒DNA或RNA分子而将表达构建体导入植物中并且在其中表达被编码的蛋白的方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利号5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367；以及5,316,931。

根据常规方法，例如通过同源重组或整合的其他方法（包括在具体宿主染色体位点的靶标性整合），可以将包含siRNA的DNA构建体整合进宿主细胞基因组中。

在本发明的其他方面，瞬时表达可以是希望的。在那些情况下，可以使用标准的瞬时转化技术，例如病毒转化方法以及DNA或RNA的显微注射，连同在本领域中熟知的其他方法。

可以根据常规技术，使来自植物的、已经稳定掺入核酸序列的细胞生长到植物中。参见例如McCormick（麦考密克）等人（1986）PlantCell Reports（《植物细胞报告》）5,81-84。然后这些植物可以生长，并且用相同的转化株亦或不同的株授粉，并且所得杂交体具有所希望的表型特征的组成型表达，该所希望的表型特征由包含在靶标位点或转移盒（transfer cassette）内的感兴趣核苷酸序列和/或遗传标记所给予。可以生长两代或更多代从而确保所希望表型特征的表达被稳定地维持并遗传，并且然后收获种子以确保已经完成所希望表型特征的表达。

可以通过使用标记基因来协助包含siRNA表达构建体的细胞和/或植物的初始鉴别和选择。如果存在用于鉴别重组子的灵敏方法，例如，如果靶标基因修饰可以易于由PCR分析检测，或如果它导致某些表型，则可以在不选择的情况下进行基因靶标。然而，在大多数情况下，将通过使用标记物来协助基因靶标事件的鉴别。有用的标记物包括阳性和阴性选择标记物连同协助筛选的标记物（例如可视标记物）。可选择的标记物包括携带对抗生素有抗性的基因，这些抗生素例如壮观霉素，（例如aada基因，Svab（什瓦布）等人（1990）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）14,197）；链霉素，（Jones（琼斯）等人（1987）Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学和基因组学》）210,86）；卡那霉素（例如nptll，Fraley（弗雷利）等人（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）80,4803）；潮霉素（例如，HPT，Vanden Elzen（万登埃尔岑）等人（1985）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）5,299）；庆大霉素（Hayford（海福德）等人（1988）Plant Physiol.（《植物生理学》）86,1216）；腐草霉素、博莱霉素（zeocin）、或博来霉素（bleomycin）（Hille（希利）等人（1986）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）7,171）；或对除草剂有抗性的基因，这些除草剂例如草丁膦（bar基因）；或磺酰脲（乙酰乳酸合酶（ALS））（Charest（查尔斯特）等人（1990）Plant Cell Rep.（《植物细胞报告》）8,643）；满足在不完全培养基上生长要求的基因，例如在酵母中的HIS3、LEU2、URA3、LYS2、以及TRP1基因；以及其他在本领域中已知的此类基因。阴性选择标记物包括胞嘧啶脱氨酶（codA）（Stougaard（斯特加德）（1993）Plant J.（《植物杂志》）3,755-761）；tms2（DePicker（德佩克）等人（1988）Plant Cell Rep.（《植物细胞报告》）7,63-66）；硝酸盐还原酶（Nussame（努塞姆）等人（1991）Plant J.（《植物杂志》）1,267-274），SU1（O’Keefe（欧基夫）等人（1994）PlantPhysiol.（《植物生理学》）105,473-482）；来自土壤杆菌属Ti质粒的aux-2；以及胸苷激酶。可筛选的标记物包括荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白（GFP）（Chalfie（查尔菲）等人（1994）Science（《科学》）263,802；美国专利号6,146,826；美国专利号5,491,084；以及PCT国际申请号WO97/41228）；报告酶，例如13-葡萄糖醛酸酶（GUS）（Jefferson（杰弗逊）R.A.（1987）Plant Mol.Biol.Rep.（《植物分子生物学报告》）5,387，美国专利号5,599,670，以及美国专利号5,432,081）、13-半乳糖苷酶（lacZ）；碱性磷酸酶（AP）；谷胱甘肽S-转移酶（GST）以及荧光素酶（美国专利号5,674,713；以及Ow（欧威）等人（1986）Science（《科学》）234:856-859），可视标记物（visual marker），例如花色苷，如CRC（Ludwig（路德维格）等人（1990）Science（《科学》）247:449-450）R基因家族（例如Lc,P,S）；果蝇中的A,C,R-nj，身体和/或眼睛颜色基因，哺乳动物系统中的毛色基因（coat colorgene），以及其他在本领域中已知的标记物。

可以使用一种或多种标记物以便对siRNA到具体基因座的靶标（这还称为位点特异性整合）进行选择和筛选。用于位点特异性整合的一个通用策略涉及使用无启动子可选择标记物。由于可选择的标记物缺乏启动子，所以随机的整合事件通常不引起基因转录。基因靶标事件将会使可选择的标记物放在靶标位点处的启动子的控制之下。通过对可选择标记物的表达进行选择来鉴别基因靶标事件。另一个通用策略利用阳性-阴性选择方案。此方案利用两种可选择标记物，赋予抗性（R⁺）的标记物与赋予选择性（S⁺）的标记物偶联，各自具有一个启动子。当包含这两种标记物的异源核酸被随机插入时，所得表型是R⁺/S⁺。当基因靶标事件产生时，这两种标记物解偶联，并且所得表型是R⁺/S^-。使用阳性-阴性选择的实例发现于Thykjer（塔克尔）等人（1997）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）35,523-530；以及PCT国际申请号WO01/66717中。

尽管在此传授了作为分开方法的不同转化方法，但是技术人员将仍然易于认识到，某些方法可以组合使用以增强转化过程的效率。此类方法的非限制性实例包括用土壤杆菌属包被的微粒进行轰击（EP486234），或者微粒轰击以诱导创伤随后与土壤杆菌属共培养（EP486233）。

直接递送还可以用于转化根据在此披露的本发明的宿主。通过非限制性举例的方式，此类直接递送方法包括聚乙二醇处理、电穿孔、脂质体介导的DNA吸收或涡旋方法。参见例如Freeman（弗里曼）等人(1984）Plant Cell Physiol.（《植物细胞生理学》）29,1353以及Kindle（金德勒），(1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）87,1228。直接的DNA递送的一种形式是直接将基因转移至来自胚性细胞悬浮培养物的原生质体中。参见Lazzeri（拉泽里）和Lorz（洛尔斯）(1988）Advances in Cell Culture（《细胞培养进展》），卷6，Academic Press（学术出版社），291页；OziasAkins（欧兹耶斯阿肯斯）和Lorz（洛尔斯）(1984）Trends in Biotechnology（生物技术动态）2,119。

技术人员意识到基因型依赖型转化的某些挑战，这些挑战是起发自谷类的低再生潜力。因此，在本发明的一个实施例中，转化是通过基于授粉途径的基因型独立型转化方法来完成的。Ohta（奥塔）（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）83,715-719。在玉米中，高效基因转化可以通过花粉和外源DNA的混合物来完成。Luo（罗）和Wu（吴）（1989）Plant Mol.Biol.Rep.（《植物分子生物学报告》）7,69-77。玉米可以通过自花授粉和异花授粉两种技术培育。玉米在同一个植物上具有分开的雄花和雌花，各自位于雄穗和雌穗上。当风将花粉从雄穗吹到从雌穗顶突出的花丝时，则在玉米中发生自然授粉。

用根据本发明的异源多核苷酸对番茄和甜瓜的转化可以经由授粉途径而完成于完整植物中。参见Chesnokov（切斯诺科夫），等人（1999）USSR专利号1708849；USSR专利公报，第4期；Chesnokov（切斯诺科夫）和Korol（科罗利）（1993）；Genetika USSR,29,1345-1355。基于授粉受精途径的遗传转化的程序包括：(i)采用花粉和转化DNA的混合物（糊料）；(ii)在授粉后，将外来种DNA递送入花粉管中；并且(iii)进行小孢子（microspore）或花粉粒（pollen grain）的微粒轰击。

在本发明的一方面，使用土壤杆菌属技术（例如根瘤土壤杆菌以及发根土壤杆菌）来转化植物宿主。土壤杆菌属介导的转移是用于将基因导入植物细胞中的广泛可应用的系统，这是因为DNA可以被导入整个植物组织中，由此绕过了从原生质体使完整植物再生的需要。使用土壤杆菌介导的植物整合载体以将DNA导入植物细胞中在本领域中是熟知的。参见例如，由Lloyd（劳埃德）等人（1986）Science（《科学》）234,464-466；Horsch（霍施）等人（1987）“Agrobacterium-mediatedtransformation of plants,”（“植物中土壤杆菌属介导的转化”）PlantBiology（《植物生物学》）Alan R.Liss（艾伦R.利斯），NY317-329页；以及Wang（王）（2006）Agrobacterium protocols（《土壤杆菌属方案》），卷2，Humana Press（胡马纳出版社），Totowa（特图瓦市）NJ（新泽西州）以及美国专利号5,563,055描述的方法。

土壤杆菌属介导的转化可以有效地与本发明的双子叶宿主植物一起使用，这些植物通过非限制性举例的方式包括拟南芥属、玉米、大豆、棉花、卡诺拉油菜、烟草、番茄、以及马铃薯。

土壤杆菌属介导的转化还可适用于本发明的几乎所有的单子叶植物。通过非限制性实例的方式，此类单子叶植物技术适用于水稻、小麦、以及大麦。参见例如Hiei（日江井）等人（1994）Plant J.（《植物杂志》）6,271-282；Zhang（张）等人（1997）Mol.Biotechnol.（《分子生物技术》）8,223-231；Ishida（石田）等人（1996）Nat.Biotechnol.（《国家生物技术》）14,745-750；McCormac（麦考麦克）等人（1998）Euphytica（荷兰植物育种杂志）99,17-25，Tingay（廷盖）S.等人（1997）Plant J.（《植物杂志》）11,1369-1376；以及美国专利号5,591,616。

土壤杆菌属介导的转化可以用培养的分离原生质体或通过完整细胞或组织的转化来完成。在双子叶植物中，与其他转化方法（例如粒子轰击法、电穿孔、聚乙二醇介导的转化方法、等）相比，土壤杆菌属介导的转化协助更大的异源核酸的递送。此外，土壤杆菌属介导的转化似乎导致相对少的基因重排，并且更典型地导致低数量的基因拷贝整合入植物染色体中。

现代土壤杆菌属转化载体能够在大肠杆菌（E.coli）连同土壤杆菌属中复制，允许如所述的方便操纵。Klee（克利）等人（1987）Ann.Rev.Plant Physiology（《植物生理学年度评论》）38,467-486。此外，在用于土壤杆菌属介导的基因转移的载体的最近技术进展已经改进了载体中的基因排列以及限制酶切位点，从而协助能够表达不同多肽编码基因的载体的构建。由Horsch（霍施）等人描述的载体具有方便的侧翼为启动子的多接头区域以及聚腺苷酸化位点，用于插入多肽编码基因的直接表达，并且适用于本发明目的。Horsch（霍施）等人（1987）“Agrobacterium-mediated transformation of plants,”（“植物中土壤杆菌属介导的转化”）Plant Biology（《植物生物学》）Alan R.Liss（艾伦R.利斯），NY317-329页。此外，包含武装的（armed）和非武装（disarmed）的Ti基因两者的土壤杆菌属可以用于转化。在土壤杆菌属介导的转化有效的那些植株中，由于该基因转移的容易以及受限定的性质，所以它是选择的方法。

在土壤杆菌属用于转化根据本发明的植物细胞时，可以将有待插入的核酸克隆进入特殊质粒中，即进入中间载体或进入二元载体中。可以通过借助与T-DNA中的序列同源的序列的同源重组而将中间载体整合入Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包括T-DNA转移所需要的vir区。在土壤杆菌属中，中间载体不能复制它们自身。可以借助于辅助质粒将中间载体转移进根瘤土壤杆菌中（结合）。

在大肠杆菌和土壤杆菌属两者中二元质粒可以复制它们自身。此类载体可以包括选择标记物基因以及接头或多聚接头，它们由右边和左边的T-DNA边界区限定框架。它们可以被直接转化入土壤杆菌属中。Holsters（霍尔斯特）等人（1978）Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学和基因组学》）163,181-187。用作宿主细胞的土壤杆菌属可以包括携带vir区的质粒。vir区对于将T-DNA转移入植物细胞中是必要的。可以包含额外的T-DNA。如此被转化的细菌用于植物细胞转化。可以有利地将植物外植体与根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌一起培育，用于将DNA转移入植物细胞中。然后整个植物可以在适合的培养基（该培养基可以包含抗生素或杀生物剂，用于选择）中从受侵染的植物材料（例如，叶片、茎段、根，还有原生质体或悬浮培养的细胞）再生。然后可以对这样获得的植物中的插入核酸的存在进行测试。

赋予所希望性状的方法

本发明进一步提供了鉴别赋予靶标有机体中所希望表型结果的siRNA的方法。在本发明的一方面，该方法包括(a)使靶标有机体与如在此所述的siRNA文库中的siRNA分子接触；并且(b)使(a)的siRNA处理与希望的表型结果相关。例如，赋予对大豆胞囊线虫抗性的siRNA是通过以下步骤来鉴别：(a)使大豆胞囊线虫与本发明的siRNA文库中的siRNA分子接触；并且(b)使(a)的siRNA处理与大豆对大豆胞囊线虫侵染的抗性相关。参见实例2和4。

如在此使用，短语“使siRNA处理与...相关”是指测量靶标有机体与siRNA分子接触的效应的、并且确定所希望的表型结果是否已经借助此类siRNA处理而在靶标有机体中获得的方法。总体上，siRNA处理的相关性是相对于对照处理来测量的。

例如，表达siRNA的转基因大豆毛状根与大豆胞囊线虫（SCN）接触。将在多重独立的生物学重复实验中形成的SCN胞囊的数目进行确定，并且与不表达siRNA的对照进行比较。在与对照比较，实验过程中观察到所形成的胞囊数目的统计学上显著减少。因此，siRNA表达与SCN的减少的侵染性（即大豆对SCN侵染的抗性）相关。参见实例2和4。

如在此使用，术语“接触”以及“给予”或短语“与…接触”可互换使用，并且是指一种过程，通过该过程本发明的siRNA或miRNA被递送或给予至靶标有机体从而抑制靶标有机体中一种基因的表达。接触描述了siRNA或miRNA与靶标有机体的物理靠近，使得它们相互作用。可以按任意种方式（包括但不局限于直接导入）将siRNA或miRNA给予或递送至细胞中（即，细胞内）；或者在细胞外导入靶标有机体的腔—胞间隙、或循环中，经口导入，可以通过将靶标有机体浸浴在一种含有siRNA或miRNA的溶液中而导入siRNA或miRNA，或者siRNA或miRNA可以存在于食物来源中。用于经口导入的方法包括siRNA或miRNA与靶标有机体的食物来源直接混合，连同工程化方法，其中将用作食物的物种工程化以表达siRNA或miRNA，并且然后向有待被影响的靶标有机体饲喂该物种。例如，可以将siRNA或miRNA构建体喷洒到植物上，或可以将siRNA施用至根附近的土壤，由植物和/或靶标有机体摄取，或可以将植物进行基因工程化以便按足以杀死或不利地影响一些或全部的植物所暴露于的靶标有机体的量表达这种siRNA或miRNA。因此，“接触”是指任何的这样的过程：通过该过程siRNA或miRNA被给予或递送至靶标有机体，从而由此抑制靶标有机体中一种基因的表达。

如在此使用，“接触”还指将有害生物、病原体、或靶标有机体放置于宿主植物或其部分之上或附近，使得有害生物、病原体、或靶标有机体具有与之相互作用、攻击、或侵染该植物或植物部分的机会，这有效地导致宿主植物中表达的siRNA与靶标有机体之间的靠近。

siRNA可以按任何导致siRNA与靶标核酸的物理靠近而容许相互作用的方式被“接触”或“给予”至靶标。在本发明的一方面，siRNA可以在宿主有机体内表达，并且然后被动扩散或者主动运输至靶标有机体。在宿主内的表达可以是瞬时的、或稳定的、和/或可诱导的。siRNA可以表达为前体、或者无活性形式，该无活性形式在靶标有机体内变得有活性。可以使用在此所述的任何表达构建体以及载体来完成在宿主中的表达。

接触的其他实例包括但不局限于：直接导入细胞（即细胞内）；在细胞外导入靶标有机体的腔—胞间隙、或循环中；经口导入；可以通过将靶标有机体浸浴或浸渍在含有siRNA的溶液中而将siRNA导入。用于经口导入的方法包括siRNA与靶标有机体的食物直接混合，连同工程化方法，其中将用作食物的物种工程化以表达siRNA，并且随后向有待被影响的靶标有机体饲喂该物种。

在靶标有机体或宿主有机体是植物时，可以将包括siRNA的组合物喷洒在植物上，或者可以将siRNA施用至根附近的土壤，由植物和/或靶标有害生物或病原体摄取，或者可以将植物进行修饰以表达siRNA。

表达异源siRNA的宿主有机体是“转基因的”。如在此使用，术语“转基因”是指在其基因组内包括异源多核苷酸的宿主有机体或其部分或细胞。转基因宿主有机体可以被稳定转化或瞬时转化。如果异源siRNA被稳定地整合入基因组内，则它被传递或遗传至连续世代。可以单独地或作为表达构建体的部分而将异源siRNA整合入基因组中。在此使用转基因以包括：已经通过异源核酸的存在改变其基因型的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初被这样改变的那些转基因连同通过来自最初转基因细胞的繁殖、有性杂交、或无性生殖所创造的那些。

如在此使用，短语“所希望的表型”是指由于siRNA基因沉默或抑制，已经在靶标有机体和/或宿主有机体中引出的预期效果。本发明提供了用于鉴别赋予所希望表型的siRNA的方法。在本发明的一方面，该方法包括设计与靶标基因互补的siRNA，已知这些靶标基因的调节具有所希望的效果。例如，在靶标有机体是植物有害生物或病原体时，该方法可以包括设计与涉及植物有害生物或病原体的发育、存活或病原性的靶标基因互补的siRNA。在本发明的另一个方面，该方法包括通过筛选如在此所述的siRNA文库，从经验上鉴别能够引出所希望表型的siRNA。参见实例2和4。此外，可以组合这两种通用方法。

在宿主或靶标有机体是植物时，所希望的表型包括对有害生物或病原体的抗性、对非生物性胁迫的抗性、以及改进的生长或产量。在靶标有机体是植物有害生物或病原体时，所希望的表型包括降低的侵染性、减少的持久性、降低的致病能力、或有害生物的死亡。

如在此使用，“对靶标有机体的抗性”是指宿主有机体抵抗或降低有害生物或病原体折磨、侵染、或疾病的严重性的能力。抗性可以通过宿主存活于有害生物侵染下的能力、降低的有害生物易感性、减少的有害生物负担、增加的产量、减少的耗损或死亡、或其他适合的农学指示来测量。

如在此使用，短语“非生物性胁迫”、“胁迫”、或“胁迫条件”是指植物、植物部分、植物细胞或类似物向可以对植物的代谢、生长、发育、繁殖、和/或存活（统称为“生长”）产生有害影响的非生命（即非生物性物理胁迫、化学剂、或环境的）条件中的暴露。例如，由于环境因子（例如水，例如洪涝、干旱、以及脱水）；厌氧条件，（例如低水平的氧）；异常的渗透条件、盐度或温度（例如热/加热，冷，冰冻，霜冻）；缺乏营养物；暴露至污染物，或者通过暴露于激素、第二信使或其他分子，可以将非生物性胁迫施加在植物上。例如，厌氧胁迫是由于足以产生胁迫应答的氧水平降低（低氧或缺氧）。洪涝胁迫可以是由于植物、植物部分、组织或分离的细胞在液体介质中的延长的或短暂的浸渍，例如发生在雨季、湿季、暴洪、或植物的过度灌溉、或类似情况期间。冷胁迫或热胁迫可以对应地是由于从具体植物物种生长温度的最优范围的温度降低或升高而发生。对于本领域的普通技术人员来说，这里的最优生长温度范围易于确定或知道。脱水胁迫可以通过细胞、组织、器官、植物部分、或整个植物中水的损失、减小的膨压、或减少的水含量来诱导。干旱胁迫可以由细胞、组织、器官、或有机体中水的剥夺或减少的水供应来诱导或与它们关联。盐度诱导的胁迫（即盐胁迫）可以与细胞的胞内或胞外环境的渗透势的扰动相关联或由它们诱导。

如在此使用，“对非生物性胁迫的抗性”、“非生物性胁迫抗性”、或“非生物性胁迫耐受性”包括但不局限于：更大的水优化；对脱水、缺水条件、或干旱的更大的耐受性；从脱水、缺水条件、或干旱的更好的恢复性；增加的根生长；增加的侧根形成；增加的根分枝；增加的根表面积；增加的根质量；更多的根毛；增加的营养物摄取；增加的微量营养素摄取；增加的代谢效率；更大的光合能力；更快速的生长速率；更多的果实或种子产量；改进型的植物构造；增强的除草剂抗性；减小或增加的高度；减少或增加的分枝；增加的冷和霜冻的耐受性；提高的活力；增强的颜色；增强的健康以及营养特征；改进的存储；增加的产量；增强的盐耐受性；木材或植物组织对腐烂的增强的抗性；增强的重金属耐受性；增加的甜度；改善的质地；减少的磷酸盐含量；增加的发芽；改进的淀粉组成；改进的花寿命；新颖树脂的产生；新颖蛋白或肽的产生；增强的农艺性状；或任何其他的农艺学上所希望的或商业上有利的性状或特征。

技术人员可以使用在此披露的本发明容易地鉴别靶标的有害生物或病原体基因。这种靶标基因可以是在这种有害生物对宿主植物的有害作用中起着直接或间接作用的任何有害生物基因。仅通过举例的方式，这种基因可以是在有害生物生长、发育、复制和繁殖、以及侵入或者侵染中起作用的基因。

例如，用于在本发明中使用的靶标基因可以包括但不局限于在具体有害生物的生存力、生长、发育、繁殖以及侵染中起着重要作用的那些。这些靶标基因可以是提供可观察到的表型（具体是导致对刺激的响应、运动、摄取、生长、发育、繁殖、以及侵染性受抑制的，或者最终导致有害生物或病原体死亡的表型）的任何管家基因、转录因子、或有害生物-或病原体-特异性基因中的一种或多种。

被靶向用于抑制的基因还可以包括对于基本功能所必需的那些，这些基本功能例如DNA复制、RNA转录、蛋白合成、氨基酸生物合成、氨基酸降解、核苷酸合成、核苷酸降解、肌肉形成、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节以及转运、消化酶合成、细胞膜电势的维持、精子形成、外激素（pheromone）合成、外激素感测、触角形成、翼形成、腿形成、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传导、细胞分裂、能量代谢、发育和分化、呼吸、以及凋亡。

例如，被推测在产生此类表型中有效的靶标基因与在秀丽隐杆线虫中已示出影响生存力、生长、发育、运动性、神经刺激、肌肉功能、以及繁殖的那些基因相似，包括但不局限于以下表型：(Adl)成虫致死，(Age)，(Bli)泡状，(Bmd)身体形态缺陷，(Ced)细胞死亡异常，(Clr)透明（clear），(Daf)永久性幼虫形成（DAuer Formation），(Dpy)粗短，(Egl)产卵缺陷，(Emb)胚胎致死，(Evl)阴户外翻（everted vulva），(Fem)XX和XO动物的雌性化，(Fgc)较少的生殖细胞，(Fog)种系的雌性化，(Gon)生殖腺发育异常，(Gro)慢生长，(Him)雄性后代的高发生率，(Hya)机能亢进，(Let)幼虫致死，(Lin)谱系异常，(Lon)长的身体，(Lpd)，(Lva)幼虫捕获，(Lvl)幼虫致死，(Mab)异常雄性，(Mei)有缺陷的减数分裂，(Mig)细胞迁移异常，(Mlt)脱毛缺陷，(形态学)，(Mut)增变，(Muv)多阴户，(Oma)卵母细胞成熟缺陷，(Pat)麻痹的、延伸两倍的捕获（Paralyzed,Arrested elongation at Two-fold），(Pch)鳞片状着色（PatCHy coloration），(Pnm)在早期胚中原核迁移改变（Pronuclearmigration alteration in early embryo），(Prl)麻痹，(Prz)瘫痪，(Pvl)阴户突出（protruding vulva），(Pvu)突出的阴户（protruding vulva），(Rde)，（繁殖），(Rol)滚筒型（roller），(Rot)中心体对以及关联的原核旋转异常（centrosome pair and associated pronuclear rotationabnormal），(Rup)爆破（exploded），(Sck)病态，(Sle)胚胎发育缓慢，(Slu)呆滞，(Sma)小，(Spd)纺锤体，异常胚，(Spo)异常胚胎纺锤体位置和方位（embryonic spindle position and orientation），(Step)不育，(Stp)后代不育，(Unc)不协调，(无类别的)，(Vul)无阴户，(WT)，（缺陷)形态学或行为上的缺陷。

作为另外的实例，潜在的鞘翅目靶标基因包括：依赖溶胀的氯离子通道（swelling-dependent chloride channel）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶；葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶；几丁质酶；液泡ATP酶D亚基1；ADP-核糖基化因子；保幼激素酯酶；转录因子IIB；结合胞质保幼激素的蛋白；肌动蛋白直系同源物；几丁质酶；α-微管蛋白；液泡ATP酶A亚基2；液泡ATP酶E；ATP合酶A链；内切葡聚糖酶；ADP/ATP转位酶；转录激活因子；mRNA加帽酶；apple ATP酶2；核糖体蛋白L9；核糖体蛋白L19；26S蛋白酶体调节亚基p28；染色质域螺旋酶-DNA-结合蛋白（chromodomain helicase-DNA-binding protein）；以及β-微管蛋白。参见美国专利号7,812,219以及Baum（鲍姆）等人(2007)Nat.Biotech.（《国家生物技术》）25,1322-1326，包括补充信息中的表1，所有文献通过引用以其全文结合在此。

在果蝇中或秀丽隐杆线虫中，额外的靶标基因对不同的基因产物进行编码，当这些基因产物被破坏时产生负效果或可观察到的表型。

在不同有机体中的另外的靶标基因列于表6中。

本发明进一步提供了靶向线虫基因（例如大豆胞囊线虫基因）和与抗线虫植物表型相关的内源植物基因两者的siRNA分子。在一个实施例中，siRNA分子能够抑制线虫基因和内源植物基因的表达。在另一个实施例中，当siRNA在一种转基因植物或其部分中表达时，赋予该植物或其部分对线虫侵染耐受性的一个水平，该水平比单独从线虫基因亦或内源性植物基因的抑制将预期的水平更高。仍在另一个实施例中，内源植物基因是乙烯应答基因。具体地，本发明涵盖被设计为靶向还能够调节乙烯应答（ETR）核酸（例如ETR1、EIN1、QITR、Q8、TETR、TGETR1、TGETR2等）的基因沉默的线虫基因的siRNA。

多种乙烯应答基因已经被表征化。认为来自拟南芥属的ETR1基因连同ETR1和ETR2的其他植物同系物是乙烯受体。（参见例如Gamble（盖姆布尔）等人（1998）PNAS USA（《美国国家科学院院刊》）95,7825-7829）。拟南芥属ETR1蛋白包含具有疏水结构域的氨基端一半，负责乙烯结合以及膜定位（Gamble（盖姆布尔）等人，同前）。拟南芥属ETR1结构域的羧基端一半包含具有与组氨酸激酶和应答调节因子同源的结构域（Gamble（盖姆布尔）等人，同前）。

植物中乙烯产生涉及植物对多种生物性的和非生物性的胁迫的应答。已经研究了携带ETR基因中突变的植物。例如，已经发现具有ETR1基因突变的乙烯不敏感大豆植物具有对一些病原体增加的抗性，但对其他病原体具有减小的抗性（Hoffman（霍夫曼）等人，（1999）Plant Physiology（《植物生理学》）119,935-949）。此外，在大豆中乙烯敏感性的改变已经关系到对大豆胞囊线虫的耐受性（Bent（本特）等人2006.Crop Science（《作物科学》）46:893-901）。

在另一个实施例中，本发明的ETR1基因是大豆ETR1。在另一个实施例中，大豆ETR1基因包括SEQ ID NO:52或其互补序列。

在另一个实施例中，靶向大豆胞囊线虫基因以及大豆ETR1基因的siRNA分子包括SEQ ID NO:3（siRNA0097）或SEQ ID NO:4（siRNA00145）。仍在另一个实施例中，siRNA的星号链靶向ETR1并且包括SEQ ID NO:55（siRNA0097*）或SEQ ID NO:56（siRNA0145*）。仍在另一个实施例中，结合至siRNA0097（SEQ IDNO:3）和siRNA0145（SEQ ID NO:4）的大豆ETR1基因mRNA部分包括SEQ ID NO:53。仍在另一个实施例中，结合siRNA0097*（SEQ IDNO:55）和siRNA0145*（SEQ ID NO:56）的大豆ETR1基因mRNA部分包括SEQ ID NO:54。

在另一个实施例中，本发明涵盖被设计为靶向线虫植物有害生物的基因的siRNA分子，当与线虫有害生物接触时，线虫有害生物具有降低的侵染对线虫侵染敏感的植物的能力，并且其中该siRNA当在植物中表达时，抑制内源植物基因的表达，其中植物基因的抑制赋予植物对线虫植物有害生物的抗性。在另一个实施例中，内源植物基因是乙烯应答基因。仍在另一个实施例中，乙烯应答基因是大豆ETR1基因。在另一个实施例中，大豆ETR1基因包括SEQ ID NO:52。在另一个实施例中，有害生物线虫是大豆胞囊线虫。仍在另一个实施例中，siRNA选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3（siRNA0097）、SEQ ID NO:4（siRNA0145）、SEQ ID NO:55（siRNA0097*）以及SEQ ID NO:56（siRNA0145*）。仍在另一个实施例中，与相同物种的野生型植物相比，ETR1基因在转基因植物中的表达水平被抑制了至少约30%。

在另一个实施例中，本发明涵盖这样一种siRNA分子：该siRNA分子被设计为靶向线虫植物有害生物的基因，其中该siRNA分子能够抑制线虫基因和内源植物基因的表达，由此线虫基因和内源植物基因的抑制赋予表达该siRNA分子的转基因植物或其部分对线虫的抗性。在另一个实施例中，内源植物基因是乙烯应答基因。仍在另一个实施例中，转基因植物或其部分是大豆植物或其部分。仍在另一个实施例中，乙烯应答基因是大豆ETR1基因。在另一个实施例中，大豆ETR1基因包括SEQID NO:52。在另一个实施例中，线虫是大豆胞囊线虫。仍在另一个实施例中，siRNA选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3（siRNA0097）、SEQ ID NO:4（siRNA0145）、SEQ ID NO:55（siRNA0097*）以及SEQ ID NO:56（siRNA0145*）。仍在另一个实施例中，与相同物种的非转基因植物或其部分相比，ETR1基因在转基因植物或其部分中的表达水平被抑制了至少约30%。

在一个实施例中，本发明提供了一种转基因植物或其部分，与相同物种的非转基因植物或其部分相比，具有乙烯响应基因的降低水平的表达，其中该转基因植物或其部分包含一种siRNA，该siRNA抑制一种线虫有害生物基因的表达，并且其中与单独从该乙烯响应基因的降低水平的表达或该线虫基因的抑制将预期的相比，该转基因植物具有对该线虫有害生物的侵染的更强耐受性。在另一个实施例中，该转基因植物是一种大豆植物。在另一个实施例中，乙烯应答基因是大豆ETR1基因。在另一个实施例中，ETR1基因包括SEQ ID NO:52。在另一个实施例中，有害生物线虫是大豆胞囊线虫。仍在另一个实施例中，siRNA选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3（siRNA0097）、SEQ ID NO:4（siRNA0145）、SEQ ID NO:55（siRNA0097*）以及SEQ ID NO:56（siRNA0145*）。仍在另一个实施例中，在转基因植物中的ETR1基因的表达水平降低了至少约30%。仍在另一个实施例中，对大豆胞囊线虫的侵染的更强耐受性是通过在大豆根上的胞囊数目来测量的。在另一个实施例中，在根上的胞囊数目减少了至少约52%。

在一个实施例中，本发明涵盖赋予植物或其部分线虫有害生物抗性的方法，该方法包括在该植物或其部分中表达一种核酸，该核酸包括抑制线虫有害生物基因表达的siRNA，并且其中该植物或其部分是乙烯不敏感的，由此与单独从该siRNA亦或乙烯不敏感性将预期的相比，该植物或其部分对该线虫有害生物具有到一个更高程度的抗性。在另一个实施例中，该植物或其部分是一种大豆植物。在另一个实施例中，乙烯不敏感性是由于ETR1基因（乙烯应答基因）的抑制。在另一个实施例中，ETR1基因包括SEQ ID NO:52。在另一个实施例中，线虫有害生物是大豆胞囊线虫。仍在另一个实施例中，siRNA选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3（siRNA0097）、SEQ ID NO:4（siRNA0145）、SEQ ID NO:55（siRNA0097*）以及SEQ ID NO:56（siRNA0145*）。仍在另一个实施例中，在该植物或其部分中的ETR1基因的表达水平降低了至少约30%。仍在另一个实施例中，对大豆胞囊线虫的侵染的抗性是通过在大豆根上的胞囊数目来测量的。在另一个实施例中，在根上的胞囊数目减少了至少约52%。

在另一个实施例中，本发明涵盖增强植物或其部分对线虫有害生物的侵染的抗性的方法，该方法包括将一种核酸导入植物或其部分，该核酸包括抑制线虫基因表达由此降低线虫侵染植物或其部分的能力的一种siRNA，其中与没有该siRNA的相同物种植物或其部分相比，该植物或其部分额外地具有乙烯响应基因的降低水平的表达，由此与单独从线虫基因的抑制亦或乙烯响应基因的抑制将预期的相比，包括该siRNA的植物或其部分对线虫的侵染具有更强的抗性。在另一个实施例中，该植物或其部分是一种大豆植物。在另一个实施例中，乙烯应答基因是ETR1基因。在另一个实施例中，ETR1基因包括SEQ ID NO:52。在另一个实施例中，线虫有害生物是大豆胞囊线虫。仍在另一个实施例中，siRNA选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3（siRNA0097）、SEQID NO:4（siRNA0145）、SEQ ID NO:55（siRNA0097*）以及SEQ IDNO:56（siRNA0145*）。仍在另一个实施例中，在该植物或其部分中的ETR1基因的表达水平降低了至少约30%。仍在另一个实施例中，对大豆胞囊线虫的侵染的更强抗性是通过在大豆根上的胞囊数目来测量的。在另一个实施例中，在根上的胞囊数目减少了至少约52%。

仍在另一个实施例中，本发明涵盖减轻在易受大豆胞囊线虫侵染的大豆根上的胞囊发展的方法，该方法包括将一种核酸分子导入大豆植物或其部分的细胞中，该核酸分子包括一种siRNA，在与该大豆胞囊线虫接触时导致该大豆胞囊线虫在大豆根上产生减少数目的胞囊，并且其中该大豆植物或其部分具有降低水平的ETR1基因，由此与单独从该siRNA接触该大豆胞囊线虫亦或ETR1基因降低的表达水平所预期的相比，在大豆根上的胞囊发展在更大程度上降低。在另一个实施例中，ETR1基因包括SEQ ID NO:52。仍在另一个实施例中，siRNA选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3（siRNA0097）、SEQ ID NO:4（siRNA0145）、SEQ ID NO:55（siRNA0097*）以及SEQ ID NO:56（siRNA0145*）。仍在另一个实施例中，在该植物或其部分中的ETR1基因的表达水平降低了至少约30%。在另一个实施例中，在根上的胞囊数目减少了至少约52%。

实例

本发明的这些方面（包括优选方面）的以上说明仅出于说明和描述的目的而呈现，并且不是旨在为穷尽性的或不是旨在将本发明限制为所披露的精确形式。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，它的许多修饰和改变将对于本领域普通技术人员来说是清楚的。

实例1

大豆胞囊线虫siRNA文库设计和构建

制备具有靶向有害生物或病原体mRNA的部分随机种子序列的小干扰RNA文库。大豆胞囊线虫（SCN）被选作靶标有害生物，用于测试这个siRNA文库。

21个核苷酸的小干扰RNA文库被设计为具有位于从5′-端在位置2-8处的随机种子序列，并且位置1、9-21被固定。由于小RNA被设计为靶向线虫基因，所以非种子序列基于秀丽隐杆线虫微RNA。经预测并已知的秀丽隐杆线虫miRNA的生物信息学分析揭示，在miRNA的非种子区（即位置1和11-19）的每个位置处保守的核苷酸。选择这些核苷酸用于siRNA文库的非种子序列。选择尿苷残基用于位置20和21，以便增加用于体外筛选的分子的稳定性。从共有序列秀丽隐杆线虫miRNA产生的模式非种子序列是5′-UNNNNNNNUGUUGAUCUGGUU-3′（SEQID NO:47），其中在种子序列中N指示随机核苷酸（即，A、C、G、亦或U）此示例性序列的siRNA文库是由47（即，4×4×4×4×4×4×4）个不同的RNA分子、或者16,384个可能的序列组成。

为了减小RNA文库的复杂性（即包含在文库中的序列数目），将序列的亚群从文库中排除。具体地，通过用计算机排除以更低频率存在于秀丽隐杆线虫miRNA种子序列中具体位置处的核苷酸来减小siRNA文库的复杂性。在此实例中，频率阈值选为20%。因此，任何使用生物信息学分析被确定为以小于20%存在于秀丽隐杆线虫种子序列中的具体位置处的核苷酸在那个具体位置处被排除。将以20%或更大的频率存在于秀丽隐杆线虫种子序列中的核苷酸包括在文库中。表7示出频繁在每个位置被观察到的核苷酸。

在种子序列内7个位置处的核苷酸的减少的组合等于2×3×2×3×2×3×3、或648个可能序列，这是复杂度上的25倍的减少。

此外，如果所得小RNA序列包含同型核苷酸四联体（例如AAAA），则从文库排除这种RNA序列。另外，还排除在位置1-9处（即位置1和种子序列）具有比在位置11-19处的GC含量更多的GC含量的小RNA序列。在这两个额外参数考虑之后，文库中siRNA序列的数目被减少至563个序列。siRNA共有基序是5′-URDSDKVDUGUUGAUCUGGUU-3′（SEQ ID NO:48）。

使用标准的自动化合成将563个siRNA合成为双链体。为了增强稳定性，可以将3′-残基稳定化对抗核溶解降解，例如，使它们由嘌呤核苷酸组成。可替代地，嘧啶核苷酸由修饰的类似物的置换（例如尿苷由2′-脱氧胸苷的置换）是容许的，并且不影响RNA干扰的效率。合成siRNA，其中在3′-端具有呈突出端的dTdT二核苷酸，以增加稳定性并且防止核溶解降解。

实例2

体外筛选

将大豆胞囊线虫的第二阶段幼虫（J2）在0.01%HgCl₂中进行表面消毒，并且然后在无菌水中漂洗3次，之后重悬浮于包含50mM奥克巴胺以及浓度为0.5mg/mL的单一siRNA双链体（大约0.4mM RNA双链体）的NGM培养基（1.7%细菌琼脂粉、0.25%蛋白胨、0.3%NaCl、1mM MgSO₄、1mM CaCl₂、25mM KH₂PO₄、pH6.0）中。

将含有500个J2的浸渍溶液的100μL等分部分分配至48孔板上的单孔中，并且在26℃孵育5天。每天观察J2。靶向大豆孢囊线虫（H.glycines）hg-rps23基因的siRNA双链体被用作阳性对照。使用没有siRNA双链体的浸渍溶液作为阴性对照。

在5天的孵育后，对比对照，对J2它们的活性进行观察，并且然后将J2接种在生长在萌发小袋（包含水浸渍的纸巾）中的4天龄大豆幼苗的根上。将受侵染的幼苗在26℃生长室中进行培养，每天16小时光照，持续1个月。

将在每个植物上形成的胞囊的数目进行计数并且与对照进行比较。结果指示563个测试双链体的15个将根上的SCN胞囊的数目减少为比对照少40%。减少SCN胞囊的siRNA的序列列于表8中。使用si-rps23-1siRNA作为阳性对照，因为已经示出此RNA可减少SCN胞囊。参见PCT申请PCT/US11/。

实例3

靶标特异性amiRNA的构建

减少大豆根上的SCN胞囊数目的15个siRNA分子被装配成人工微RNA构建体。使用大豆微RNA前体gma-MIR164作为amiRNA的主链。在此前体上的miR164/miR164*序列被siRNA/siRNA*序列替换，同时通过在siRNA*过客链（passenger strand）上制造突变而将在miR164/miR164*双链体上的错配位置保留在人工siRNA/siRNA*序列中。

用于在宿主植物细胞中表达抗-SCN siRNA的人工微RNA（amiRNA）的设计遵从Schwab（施瓦布）等人的文献，该文献中amiRNA被设计为靶向植物细胞中的单独基因或内源基因的组。参见Schwab（施瓦布）等人（2006）Plant Cell（《植物细胞》）18,1121-1133；Alvarez（阿瓦力兹）等人（2006）Plant Cell（《植物细胞》）18,1134-1151。选择大豆miRNA前体gma-MIR164用于amiRNA的主链。关于靶标特异性人工微RNA的装配的细节描述于在2010年9月12日提交的美国临时申请61/421275，将其通过引用以其全文结合在此。使用aMIR164-rps23-1amiRNA作为在siRNA实验中的阳性对照。

实例4

体内转基因根-SCN分析

将包含靶标特异性人工miRNA的表达载体转化进大豆根中以测试在转基因情况下它们减少SCN胞囊的能力。使用大豆栽培品种Williams82作为用于毛状根转化的种质。将大豆种子在陪替氏培养皿中在含有0.5%蔗糖的1%琼脂上在27℃萌发5天。然后将子叶从幼苗切下，并且用携带二元载体的发根土壤杆菌的培养物对创伤面进行接种。将这些子叶放置在1%琼脂上持续6天并且然后转移到选择培养基上。在大约两周之后，将从这些子叶诱导的独立转基因毛状根事件进行收获并且转移到培养基上，并且在27℃在黑暗中进行培养。Narayanan（纳拉亚南）等人指出，整个植物中的SCN抗性表型在转基因毛状根中得以保持，因此转基因毛状根系统对于评估候选的SCN抗性基因是有用的。Narayanan（纳拉亚南）等人（1999）Crop Science（《作物科学》）39,1680-1686。

在转移到培养平板上两周之后，将这些经转化的毛状根用表面消毒的J2阶段的大豆胞囊线虫（SCN J2）进行接种，并且将这些根在27℃在黑暗中进行培养，这允许这些毛状根事件上的胞囊形成。在线虫接种后一个月后，确定表达靶标特异性人工miRNA的根以及表达空载体的根（作为阴性对照）两者上的胞囊数目。

在此实验中，当amiRNA0097、amiRNA0145、amiRNA0043、amiRNA0483、amiRNA0309、amiRNA0382、amiRNA0243以及amiRNA0514载体构建体在转基因大豆毛状根中过表达时，与对照相比，在这些根上的胞囊形成显著减少。使用aMIR164-rps23-1amiRNA作为阳性对照，因为已经示出此miRNA可减少SCN胞囊形成。虽然与对照相比，其他amiRNA（例如amiRNA0046、amiRNA0569、amiRNA0458、以及amiRNA0531）的表达未显著减少SCN胞囊数目，但结果未指示这些少数amiRNA在靶标SCN RNA上是无效的。例如，导致siRNA更高水平的表达的改进表达策略可以增加这些siRNA的效力。对于减少大豆毛状根中胞囊形成的amiRNA的分析结果列于以下表格中。

实例4.1

amiRNA的双重活性

以上测试的两种amiRNA，包括siRNA0097的amiRNA0097以及包括siRNA0145的amiRNA0145（参见表12）导致转基因大豆细胞中根生长和增生的增加，与表达其他siRNA或空载体（阴性对照）的大豆细胞相比，它们在这些转基因大豆细胞中被表达，提示siRNA0097和siRNA01435除了靶向线虫基因之外还调节一种或多种大豆基因的表达。虽然以上测试的任何siRNA的任一条链在用计算机针对大豆基因组进行筛选时均没有产生对任意大豆基因的任意全长互补，但令人惊讶地，siRNA0097和siRNA0145两条链对具有拟南芥属乙烯应答1基因（ETR1）的两种大豆直系同源物均具有显著的互补性。有趣的是，乙烯受体或应答基因（像ETR1-型基因）已经关系到在某些植物中根的增生以及对一些线虫的增加的耐受性。在一项研究中，例如，与野生型未诱变大豆植物相比，化学诱变的乙烯不敏感的大豆植物（即突变的乙烯应答基因）产生少约41%的雌性（胞囊）（Bent（本特）等人2006.CropScience（《作物科学》）46:893-901）。至今，还没有出现任何研究已经使乙烯应答基因的RNA敲除与线虫抗性相关。

siRNA链互补分析的结果示出于表19中。对于amiRNA0097的两条链而言互补性是最高的，特别是在种子序列中（加下划线的序列）。amiRNA0097正链在种子序列中具有对大豆ETR1基因的7分之7的匹配，而amiRNA0097*链（星号链）在种子序列中具有7分之6的匹配。amiRNA0145正链具有7分之5的匹配，而amiRNA0145*星号链具有7分之6的匹配。相比于与ETR1仅有4/7匹配的amiRNA0043以及与ETR1有5/7匹配但在核苷酸7和8之间具有大缺口的amiRNA0046，这些处理的两者，amiRNA0097和amiRNA0145具有线虫侵染的增强的减少（由胞囊形成测量）。

表19.siRNA与大豆ETR1-型基因的互补

siRNA与ETR1mRNA的互补比对

近年已经发现一些miRNA/miRNA*双链体中的miRNA*链也可以被载入RISC中并且干扰它的互补mRNA靶标的表达（Kulcheski（库尔切斯基）等人，2011.BMC Genomics（《BMC基因组学》）12:307）。因此可能的是，miRNA*可以被载入RNA诱导的沉默复合体（RISC）并且用于沉默靶标mRNA。除了正链，amiRNA0097*和the amiRNA0145*星号链两者可以与gma-ETR1mRNA形成互补结合（参见上表19），因此可能的是，amiRNA0097和amiRNA0145中的两条链均可以下调gma-ETR1基因的表达。

令人惊讶地，在上表12中的结果示出，与表达amiRNA0043、amiRNA0046以及阴性对照的大豆根相比，表达amiRNA0097和amiRNA0145的大豆根已经显著增强了对胞囊形成的抗性（由它们的标准差的非重叠来看是明显的）。胞囊数目的增强的减少可能是由于siRNA0097和siRNA0145，这两者均对线虫具有直接作用（即siRNA0097和siRNA0145靶向线虫基因并且抑制或沉默那个基因，因此减少线虫能够产生的胞囊数目（参见以上实例2）），并且对线虫具有间接作用（即siRNA0097和siRNA0145还借助于它们具有对ETR1mRNA的互补性而抑制内源植物基因（ETR1）的表达，这进而赋予对线虫侵染性（胞囊的产生）的一些抗性）。对胞囊产生的增强的作用进而可能是由于线虫基因和内源植物基因的协同抑制。据信这是单一siRNA分子对线虫侵染性的这种“直接”和“间接”作用的首个报告。

实例5

用siRNA转化植物

将人工前-miRNA，gma-aMIR164-amir0097以及gma-aMIR164-amir0145（对应地包括amiRNA0097/amiRNA0097*双链体以及amiRNA0145/amiRNA0145*双链体）（参见实例3）各自克隆进分开的二元载体中并且对应地命名为20111和20109。将20111和20109载体转化进大豆中。

产生转基因大豆植物的大豆转化是使用变种Williams82的未成熟的种子靶标经由根瘤土壤杆菌介导的转化来完成的。外植体材料和培养基配方基本上描述于Hwang（黄）等人（PCT国际公开号WO08/112044）以及Que（阕）等人（PCT国际公开号WO08/112267）中，其中具有如下所指出的一些变化。使用这种方法，将转化质粒的左边界区和右边界区内的遗传元件高效地转移并整合至植物细胞的基因组中，同时总体上不转移在这些边界区外部的遗传元件。

从温室生长的植物收获正在成熟的大豆荚，将它们用稀释的漂白液消毒并且用无菌水漂洗。随后将不成熟的种子从种荚中切下并用无菌水短暂漂洗。将外植体从消毒的不成熟种子基本上如Hwang（黄）等人（PCT公开号WO08/112044）所述那样制备，并且用携带载体20111亦或20109的根瘤土壤杆菌菌株EHA101感染，并且允许其孵育额外30分钟至240分钟。通过抽吸去除过量的根瘤土壤杆菌悬液，并且将外植体移至含有非选择性共培养培养基的平板。将这些外植体与剩余的根瘤土壤杆菌在黑暗中在约23℃共培养持续约4天，并且然后转移至补充有一种由替卡西林（75mg/L）、头孢噻肟（75mg/L）以及万古霉素（75mg/L）组成的抗生素混合物的再生培养基上，在此处将它们在黑暗中孵育七天。

然后将这些外植体转移至包含潮霉素B（3mg/L至6mg/L）以及一种由替卡西林（75mg/L）、头孢噻肟（75mg/L）以及万古霉素（75mg/L）组成的抗生素混合物的再生培养基上以抑制并杀死根瘤土壤杆菌。在含有2mg/L至4mg/L的潮霉素B的伸长培养基中进行芽伸长与再生。在该转化过程中使用潮霉素磷转移酶（HPT）基因作为可选择性标记。将再生的小植物移栽于基本上如（PCT国际公开号WO08/112267）描述的土壤中，并且使用TaqMan PCR分析来测试HPT和CMP启动子序列的存在（Ingham（英厄姆）等人，2001Biotech（《生物技术》）31,132-140）。这种筛选允许选出携带T-DNA且不含载体DNA的转基因事件。将对于HPT基因以及CMP序列而言呈阳性的植物以及对于壮观霉素（spec）基因而言呈阴性的植物转移至温室中用于miRNA表达以及种子设置的分析。

当根是约2-3英寸时，则将植物移栽至1加仑钵中（该钵使用Fafard#3土壤和30克掺入的新奥绿肥15-9-12（Osmocote Plus15-9-12）），并且将其维持在用于大豆植物的标准温室生长条件下。

将具有20111和21019的转基因大豆事件的叶子进行取样，从而使用领域中认可的定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）定量地确定ETR1基因的表达水平（参见例如VanGuilder（范盖德尔）等人（2008）.Biotechniques（《生物技术》）44(5):619-626；Udvardi（乌德沃尔迪）等人（2008）.Plant Cell（《植物细胞》）20(7):1736-1737）。在转基因事件中与在野生型对照大豆植物中的ETR1基因表达的相对量是通过将ETR1水平与一种不同的内源大豆基因进行比较来确定的。

qRT-PCR分析的结果示出，与野生型对照大豆根相比，产生siRNA0097和siRNA0145的转基因大豆根中的ETR1表达显著更低。ETR1表达水平的相对量是：在野生型大豆根中为约34±5（N=9，其中N是植物的数目），而在siRNA0145和siRNA0097转基因大豆根中对应地为约23±4（N=14，其中N是事件的数目）和约12±1（N=21，其中N是事件的数目）。因此，与野生型大豆根相比，siRNA0145和siRNA0097转基因大豆根对应地具有减少33%和66%的ETR1基因表达。

这些结果与以上所述的对于siRNA0097和siRNA0145获得的其他结果相关。siRNA0097和siRNA0145被设计为靶向线虫基因，并且在接触具有siRNA0097亦或siRNA0145的大豆胞囊线虫时，线虫在大豆根上产生胞囊的能力下降（参见实例2）。在用SCN侵染时，表达siRNA0097或siRNA0145的大豆根已经显著减少了胞囊的数目（实例4），其中siRNA0097比siRNA0145具有更显著低的数目。有趣的是，siRNA0097在两条链上均对大豆ETR1基因具有最高的互补性，并且表达siRNA0097的大豆根具有最低水平的ETR1基因表达。Bent（本特）等人2006（同前）报道了在具有化学突变型ETR1基因的乙烯不敏感大豆植物中胞囊的约41%的减少。在此，表达直接靶向SCN基因并且调节内源ETR1基因表达的siRNA的大豆根具有在胞囊数目上高达68%的减少，这个水平比单独调节线虫基因亦或单独调节ETR1基因所预期的更高。

尽管已经有被设计为靶向植物有害生物基因的dsRNA的“非正常型”（“off-type”）效果的报道，但是至今看起来没有研究已经报道内源植物基因被经设计为靶向线虫植物有害生物基因的siRNA抑制，由此植物基因的抑制还赋予对相同线虫有害生物的抗性。因此，令人惊讶的是被设计为靶向线虫基因的siRNA抑制线虫基因（对线虫的直接作用）和内源植物基因两者的表达，进而干扰线虫侵染性（对线虫的间接作用）。更令人惊讶的是被设计为靶向线虫基因的siRNA对内源植物基因的调节可以是由于siRNA的正链和星号链两者。

将用载体转化的植物用J2阶段的大豆胞囊线虫（SCN J2）进行接种。短暂地，将生长在萌发袋里的转基因T1代大豆的1周龄幼苗以每一植物750个J2的水平用SCN J2悬浮液进行接种。在线虫接种后一个月之后，确定包含amiRNA表达盒的转基因植物以及来自相同T0亲本的空分离体上的胞囊数目。

实例6

玉米根虫siRNA文库设计和构建

制备小干扰RNA文库，该文库具有部分地随机的种子序列以不加选择地靶向昆虫有害生物的mRNA。玉米根虫（CRW）被选作靶标有害生物以用于测试这个siRNA文库。

21个核苷酸的小干扰RNA文库被设计为具有位于从5′-端在位置2-8处的随机种子序列，并且位置1、9-21被固定。由于小RNA被设计为靶向昆虫有害生物基因，所以非种子序列是基于来自相关鞘翅目有害昆虫赤拟谷盗的微RNA。经预测并已知的赤拟谷盗miRNA的生物信息学分析揭示了在miRNA的非种子区（即位置1和11-19）的每个位置处保守的核苷酸。选择这些核苷酸用于siRNA文库的非种子序列。选择尿苷残基用于位置20和21，以便增加用于体外筛选的分子的稳定性。从共有序列赤拟谷盗miRNA产生的模式非种子序列是5′-UNNNNNNNUAUCCGGAUUCUU-3′（SEQ ID NO:50），其中在种子序列中N指示随机核苷酸（即，A、C、G、或U）。此示例性序列的siRNA文库是由47（即，4×4×4×4×4×4×4）个不同的RNA分子、或者16,384个可能的序列组成。

为了减小RNA文库的复杂性（即包含在文库中的序列数目），将序列的亚群从文库中排除。具体地，通过用计算机排除以较低频率存在于赤拟谷盗miRNA种子序列中的具体位置处的核苷酸来减小siRNA文库的复杂性。在此实例中，频率阈值选为20%。因此，任何经使用生物信息学分析被确定为以小于20%存在于赤拟谷盗种子序列中的具体位置处的核苷酸在那个具体位置处被排除。将以20%或更大的频率存在于赤拟谷盗种子序列中的核苷酸包括在文库中。表20示出频繁在每个位置被观察到的核苷酸。

在种子序列内7个位置处的核苷酸的经减少的组合等于4×3×4×2×3×4×4、或4608个可能序列，这是复杂度上的3.6倍的减少。

此外，如果种子序列包含同型核苷酸四联体（例如AAAA），则将这种小RNA序列从计算机文库排除。另外，还排除在位置1-9处（即位置1和种子序列以及位置9）具有比在位置11-19处的GC含量更多的GC含量的序列。在这两个额外参数考虑之后，计算机文库中siRNA序列的数目被减少至3899个序列。siRNA共有基序是5′-UNDNWDNNUAUCCGGAUUCUU-3′（SEQ ID NO:51）。

使用标准的自动化合成将3899个siRNA合成为双链体。为了增强稳定性，可以将3′-残基稳定化对抗核溶解降解，例如，使它们由嘌呤核苷酸组成。可替代地，嘧啶核苷酸由修饰的类似物的置换（例如尿苷由2′-脱氧胸苷的置换）是容许的，并且不影响RNA干扰的效率。还可以这样合成siRNA：其中在3′-端具有呈突出端的dTdT二核苷酸，以增加稳定性并且防止核溶解降解。

Claims (68)

1.一种制备小干扰RNA（siRNA）文库的方法，该方法包括合成多个RNA分子，其中每个RNA分子包括

(a)一个包括随机核苷酸的种子序列，以及一个包括特指核苷酸的非种子序列；或

(b)一个包括一些核苷酸的种子序列，这些核苷酸代表一种靶标有机体或与该靶标有机体相关的有机体的一个或多个微RNA种子序列，以及一个包括特指核苷酸的非种子序列。

2.如权利要求1所述的一种方法，其中该合成包括计算机设计。

3.如权利要求1或权利要求2所述的一种方法，其中该多个RNA分子的每个RNA分子包括至少约17-19个核苷酸，并且其中该种子序列包括6-8个核苷酸。

4.如权利要求3所述的一种方法，其中该多个RNA分子的每个RNA分子包括21个核苷酸，其中该种子序列包括占据该RNA分子的位置2-8的核苷酸，并且其中该非种子序列包括占据该RNA分子的位置1和9-21的核苷酸。

5.如权利要求1-4中任一项所述的一种方法，其中该非种子序列包括：

(a)一个共有微RNA序列；或

(b)来自一种植物有害生物或病原体或来自与一种植物有害生物或病原体相关的一种有机体的一个共有微RNA序列。

6.如权利要求5所述的一种方法，其中该植物有害生物是一种线虫或一种昆虫。

7.如权利要求6所述的一种方法，其中该线虫是大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）或者该昆虫是西方玉米根虫（玉米根萤叶甲）。

8.如权利要求7所述的一种方法，其中该非种子序列

(a)是一个来自秀丽隐杆线虫微RNA序列的共有序列；或

(b)包括占据SEQ ID NO:47的位置1和9-21的核苷酸；或

(c)是一个来自赤拟谷盗微RNA序列的共有序列；或

(d)包括占据SEQ ID NO:50的位置1和9-21的核苷酸。

9.如权利要求1-8中任一项所述的一种方法，其中该非种子序列进一步包括一个或多个核苷酸置换从而改进微RNA稳定性。

10.如权利要求1-9中任一项所述的一种方法，进一步包括以下步骤：

(a)将在该种子序列内包含一个或多个以低频率存在于一种靶标有机体或与一种靶标有机体相关的有机体的微RNA序列的相应位置处的核苷酸的RNA分子排除；

(b)将在该种子序列内包括同型核苷酸四联体的RNA分子排除；和/或

(c)将包括一种在位置1-9处具有比在位置11-19处的GC含量更多的GC含量的种子序列的RNA分子排除。

11.如权利要求1-10中任一项所述的一种方法，进一步包括将与一种宿主植物核酸互补的RNA分子排除的步骤。

12.如权利要求11所述的一种方法，其中该宿主植物是Glycine max（大豆）或玉蜀黍（玉米）。

13.如权利要求1-12中任一项所述的一种方法，其中该多个RNA分子包括具有SEQ ID NO:49的残基2-8或SEQ ID NO:51的残基2-8的种子序列的RNA分子。

14.一种通过权利要求1-13中任一项所述的方法制备的siRNA文库。

15.一种如权利要求14所述文库的siRNA分子。

16.一种siRNA分子，包括

(a)一个包括一些核苷酸的种子序列，这些核苷酸代表一种靶标有机体或与该靶标有机体相关的有机体的一个或多个微RNA种子序列，以及

(b)一个非种子序列。

17.如权利要求16所述的一种siRNA分子，该siRNA分子包括至少约19个核苷酸，并且其中该种子序列包括6-8个核苷酸。

18.如权利要求17所述的一种siRNA分子，该siRNA分子包括21个核苷酸，其中该种子序列包括占据该RNA分子的位置2-8的核苷酸，并且其中该非种子序列包括占据该RNA分子的位置1和9-21的核苷酸。

19.如权利要求16-18中任一项所述的一种siRNA分子，其中该非种子序列包括

(a)一个共有微RNA序列；或

(b)来自一种植物有害生物或病原体或来自与一种植物有害生物或病原体相关的一种有机体的一个共有微RNA序列。

20.如权利要求19所述的一种siRNA分子，其中该植物有害生物是一种线虫或一种昆虫。

21.如权利要求20所述的一种siRNA分子，其中该线虫是大豆胞囊线虫或该昆虫是玉米根萤叶甲。

22.如权利要求16-21中任一项所述的一种siRNA分子，其中该非种子序列

(a)是秀丽隐杆线虫微RNA序列的一个共有序列；或

(b)包括占据SEQ ID NO:47的位置1和9-19的核苷酸；或

(c)是赤拟谷盗微RNA序列的一个共有序列；或

(d)包括占据SEQ ID NO:50的位置1和9-19的核苷酸。

23.如权利要求16-22中任一项所述的一种siRNA分子，该siRNA分子包括具有SEQ ID NO:48的残基2-8、SEQ ID NO:49的残基2-8、或SEQ ID NO:51的残基2-8的一个种子序列。

24.如权利要求23所述的一种siRNA分子，该siRNA分子包括具有SEQ ID NO:1-14中任一个的残基2-8的一个种子序列。

25.如权利要求24所述的一种siRNA分子，该siRNA分子包括SEQID NO:1-14的任一个中的核苷酸序列。

26.一种人工RNA分子，该人工RNA分子包括如权利要求15-25中任一项所述的siRNA分子。

27.如权利要求26所述的人工RNA分子，该人工RNA分子包括SEQ ID NO:16-29的任一个中的核苷酸序列。

28.一种载体，该载体包括如权利要求15-25中任一项的siRNA分子。

29.如权利要求28所述的载体，该载体包括SEQ ID NO:31-44的任一个中的核苷酸序列。

30.一种核酸，该核酸包括如权利要求15-25中任一项所述的siRNA分子。

31.一种转基因植物、或其部分，包含如权利要求15-25中任一项所述的siRNA分子、如权利要求26或27所述的人工RNA分子、如权利要求28或29所述的载体、或如权利要求30所述的核酸。

32.如权利要求31所述的转基因植物，该转基因植物是大豆或玉蜀黍。

33.一种衍生自如权利要求31或32所述的转基因植物的植物产品，其中该植物产品包含该siRNA分子、该人工RNA分子、该载体或该核酸。

34.如权利要求33所述的一种植物产品，其中该植物产品是选自下组，该组由以下各项组成：花、花粉、叶子、藤、茎、果实、蔬菜、瓜类蔬菜、根、块茎、球果、荚、种子、豆类及其部分。

35.一种衍生自如权利要求33或34所述的植物产品或其部分的生物样品。

36.一种商品，该商品包含如权利要求15-25中任一项所述的siRNA。

37.如权利要求36所述的一种商品，其中该商品是选自下组，该组由以下各项组成：整个或经处理的种子、豆类、谷物、核、壳、粉、粗碾去壳谷类、面粉、糖、淀粉、蛋白浓缩物、蛋白分离物、蜡、油、浸出物、汁、浓缩物、液体、糖浆、饲料、青贮饲料、纤维、纸或其他从植物生产的食物或产品。

38.一种衍生自如权利要求36或37所述的商品的生物样品。

39.赋予一种植物的线虫抗性的一种方法，该方法包括在该植物中表达一种核酸，该核酸包括如权利要求24或25所述的siRNA，由此该植物对线虫有抗性。

40.如权利要求39所述的一种方法，该方法包括在该植物中表达包括如权利要求26所述的人工miRNA的一种核酸。

41.如权利要求39或40所述的方法，其中该线虫是大豆胞囊线虫。

42.一种siRNA分子，该siRNA分子靶向一种线虫基因以及与一种抗线虫植物表型相关的一种内源性植物基因两者。

43.如权利要求42所述的一种siRNA分子，其中该siRNA分子能够抑制该线虫基因和该内源性植物基因的表达。

44.如权利要求43所述的一种siRNA分子，其中该siRNA分子在一种转基因植物或其部分中的表达赋予该植物或其部分对线虫侵染抗性的一个水平，该水平比单独从该线虫基因亦或该内源性植物基因的抑制所预期的水平更高。

45.如权利要求42至44中任一项所述的一种siRNA分子，其中该内源性植物基因是一种乙烯应答基因。

46.如权利要求45所述的一种siRNA分子，其中该乙烯应答基因是ETR1。

47.如权利要求46所述的一种siRNA分子，其中该ETR1基因是大豆ETR1。

48.如权利要求47所述的一种siRNA分子，其中该大豆ETR1基因包括SEQ ID NO:52、或其互补序列。

49.如权利要求42至48中任一项所述的一种siRNA分子，其中该线虫是大豆胞囊线虫。

50.如权利要求49所述的一种siRNA分子，其中该siRNA分子包括SEQ ID NO:3（siRNA0097）、SEQ ID NO:4（siRNA00145）、SEQ IDNO:55（siRNA0097*）或SEQ ID NO:56（siRNA0145*）。

51.一种转基因植物或其部分，与相同物种的非转基因植物或其部分相比，具有乙烯应答基因的降低水平的表达，其中该转基因植物或其部分包含一种siRNA，该siRNA抑制一种有害生物线虫基因的表达，并且其中与单独从该乙烯应答基因的降低水平的表达亦或该线虫基因的抑制所预期的相比，该转基因植物或其部分具有对该线虫有害生物的侵染的更强耐受性。

52.如权利要求51所述的一种转基因植物或其部分，其中该转基因植物或其部分是一种大豆植物或其部分。

53.如权利要求52所述的一种转基因植物或其部分，其中该线虫是大豆胞囊线虫。

54.如权利要求51至53中任一项所述的一种转基因植物或其部分，其中该乙烯应答基因是一种大豆ETR1基因。

55.如权利要求54所述的一种转基因植物或其部分，其中该siRNA分子是选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3（siRNA0097）、SEQ ID NO:4（siRNA0145）、SEQ ID NO:55（siRNA0097*）以及SEQ ID NO:56（siRNA0145*）。

56.如权利要求55所述的一种转基因植物或其部分，其中在该转基因植物中的该ETR1基因的表达水平降低了至少约30%。

57.如权利要求56所述的一种转基因植物或其部分，其中对该大豆胞囊线虫的侵染的更强耐受性是通过在大豆根上的胞囊的数目来测量的。

58.如权利要求57所述的一种转基因植物或其部分，其中在这些根上的胞囊的数目减少了至少约52%。

59.增强一种植物或其部分对一种线虫有害生物的侵染的抗性的一种方法，该方法包括将一种核酸导入该植物或其部分，该核酸包括抑制一种线虫基因表达由此降低该线虫侵染该植物或其部分的能力的一种siRNA分子，其中与没有该siRNA分子的相同物种植物或其部分相比，该植物或其部分额外地具有乙烯应答基因的降低水平的表达，由此与单独从该线虫基因的抑制亦或该乙烯应答基因的抑制所预期的相比，包含该siRNA的该植物或其部分对该线虫的侵染具有更强的抗性。

60.如权利要求59所述的方法，其中该植物或其部分是一种大豆植物或其部分。

61.如权利要求60所述的方法，其中该线虫是大豆胞囊线虫。

62.如权利要求59至61中任一项所述的方法，其中该乙烯应答基因是一种大豆ETR1基因。

63.如权利要求62所述的方法，其中该siRNA分子是选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3（siRNA0097）、SEQ ID NO:4（siRNA0145）、SEQ ID NO:55（siRNA0097*）以及SEQ ID NO:56（siRNA0145*）。

64.如权利要求63所述方法，其中在该植物中的该ETR1基因的表达水平降低了至少约30%。

65.如权利要求64所述的方法，其中对该大豆胞囊线虫的侵染的更强抗性是通过在大豆根上的胞囊的数目来测量的。

66.如权利要求65所述的方法，其中在这些根上的胞囊的数目减少了至少约52%。

67.赋予一种植物或其部分线虫抗性的一种方法，该方法包括在该植物或其部分中表达一种核酸，该核酸包括抑制一种线虫基因表达的一种siRNA分子，并且其中该植物或其部分是乙烯不敏感的，由此与单独从该siRNA亦或乙烯不敏感性所预期的相比，该植物或其部分对该线虫具有到一个更高程度的抗性。

68.减轻在一种易受线虫侵染的植物的根上的线虫胞囊发展的一种方法，该方法包括将一种核酸分子导入该植物或其部分的细胞中，该核酸分子包括一种siRNA分子，在与该线虫接触时导致该线虫在该植物的这些根上产生减少数目的胞囊，并且其中该植物或其部分具有降低水平的乙烯应答基因，由此与单独从该siRNA接触该线虫亦或降低水平的该植物乙烯应答基因表达所预期的相比，在该植物的根上的胞囊发展在更大程度上降低。