BR112013020427B1

BR112013020427B1 - molécula de sirna, molécula de rna artificial, vetor e método de conferir resistência à nematódeo do cisto da soja compreendendo a referida molécula de sirna

Info

Publication number: BR112013020427B1
Application number: BR112013020427-3A
Authority: BR
Inventors: Xiang HUANG; Thomas McNeill; Michael Schweiner
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2011-02-14
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2021-03-09
Also published as: CN103747671A; US9434942B2; WO2012112512A2; CA2825794A1; WO2012112512A3; US10066236B2; US20130333070A1; US20160326538A1; CO6761370A2; BR112013020427A8; WO2012112512A8; CL2013002350A1; AR085359A1; BR112013020427A2; RU2013141957A

Abstract

BIBLIOTECA, SEU MÉTODO DE PREPARAÇÃO, MOLÉCULA DE SIRNA, VETOR, ÁCIDO NUCLEICO E MÉTODOS DE CONFERIR RESISTÊNCIA A NEMATÓDEO, DE INTENSIFICAÇÃO DA RESISTÊNCIA A UMA PLANTA, OU A SUA PARTE E DE REDUÇÃO DO DESENVOLVIMENTO DE CISTOS DE NEMATÓDEOS. A presente invenção refere-se a métodos de desenho e síntese de bibliotecas de siRNA, bibliotecas de siRNA produzidas desse modo, moléculas de siRNA, e seus usos, que são divulgados.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção relaciona-se com métodos de desenho de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) baseados no enriquecimento de sequências de siRNA específicas de alvos, siRNAs produzidos desse modo, e métodos para uso dos mesmos. Mais particularmente, a invenção relaciona-se com pequenos RNAs de interferência tendo atividade contra pragas ou patógenos e o seu uso em plantas.

ANTECEDENTES

Na última década, a interferência de RNA (RNAi) tem sido descrita e caracterizada em organismos tão diversos como plantas, fungos, ne- matódeos, hidras e humanos. Zamore e Haley (2005) Science 309, 1519-24. A interferência de RNA em plantas é comummente referida como silencia- mento gênico ou silenciamento de RNA pós-transcricional e é referida como supressão em fungos. Pensa-se que o processo de silenciamento gênico pós-transcricional é um mecanismo de defesa celular evolutivamente conservado usado para evitar a expressão de genes estranhos e é comummente partilhado por flora e filos diversos. Fire (1999) Trends Genet. 15, 358363.

A interferência de RNA ocorre quando um organismo reconhece moléculas de RNA de fita dupla e as hidrolisa. Os produtos resultantes da hidrólise são pequenos fragmentos de RNA com 19-24 nucleotídeos de comprimento, chamados pequenos RNAs de interferência (siRNAs) ou mi- croRNAs (miRNAs). Os siRNAs difundem-se depois ou são transportados ao longo do organismo, incluindo através das membranas celulares, onde eles hibridam com mRNAs (ou outros RNAs) e causam hidrólise do RNA. Os RNAs de interferência são reconhecidos pelo complexo de silenciamento do RNA de interferência (CSIA) no qual uma fita efetora (ou "fita guia") do RNA é carregada. Esta fita guia atua como um modelo para o reconhecimento e destruição das sequências dúplex. Este processo é repetido de cada vez que o siRNA hibrida com o seu alvo de RNA completamentar, evitando efeti-vamente que esses mRNAs sejam traduzidos, e assim "silenciando" a expressão de genes específicos. A maioria dos miRNAs de plantas mostram emparelhamento de bases extensivo aos, e guiam a clivagem dos seus mRNAs alvo. Jones-Rhoades et al. (2006) Annu. Rev. Plant Biol. 57, 19-53; Llave et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13401-13406. Em outros casos, os RNAs de interferência podem se ligar a moléculas de RNA alvo tendo complementaridade imperfeita, causando repressão translacional sem degradação do mRNA. A maioria dos miRNAs animais estudados até agora parece funcionar desta maneira.

Com base no papel dos miRNAs como reguladores endógenos da expressão gênica, têm sido feitos esforços substanciais quanto ao desenho de miRNAs para regulação direcionada da expressão gênica. Por exemplo, podem ser desenhados pré-miRNAs por substituição da sequência de miRNA madura com 21 nucleotídeos e da sequência complementar (i.e., a fita de miRNA* ou a fita de miRNA asterisco), com sequências com 21 nu- cleotídeos manipuladas ou sintéticas. Tais pré-miRNAs artificiais têm sequências idênticas àquelas dos pré-miRNAs naturais exceto na região codificando o miRNA maduro e a fita asterisco. Por este método, foram desenhados miRNAs artificiais (amiRNA) que se podem direcionar a e silenciar transcritos de mRNA específicos com sequências complementares.

Dentro das sequências de miRNA, regiões altamente conservadas de 6-7 nucleotídeos, que são chamadas sequências semente, são responsáveis pelo emparelhamento de bases com um gene/RNA alvo. As sequências semente estão posicionadas nos nucleotídeos 2-7 ou 2-8 por contagem linear a partir da extremidade 5' da molécula de mRNA, enquanto os nucleotídeos restantes são chamados sequências não semente. miRNAs que são membros de uma mesma família de miRNA (i.e., miRNAs com a mesma sequência nos nucleotídeos 2-8) partilham os mesmos alvos de mRNA previstos. Ver Bartel (2009) Cell 136, 215-233.

Dado o seu papel na regução gênica específica de sequências, prevê-se que os siRNAs tenham muitas aplicações, incluindo estudos de função gênica, desenvolvimento de terapias para condições associadas a expressão ou acúmulo de proteínas aberrante, e métodos para conferição de traços desejáveis, incluindo em plantas. Para ir ao encontro desta necessidade, a invenção proporciona métodos para desenho eficaz de siRNAs específicos de alvos, bibliotecas de siRNA, e moléculas de siRNAs produzidas desse modo, e métodos para uso dos mesmos.

SUMÁRIO

A invenção descrita aqui é um método para preparação de uma biblioteca de pequenos RNAs de interferência (siRNAs), siRNAs produzidos desse modo, e seus usos.

Um aspeto da invenção é um método de preparação de uma biblioteca de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) compreendendo a síntese de uma pluralidade de moléculas de RNA, em que cada molécula de RNA compreende (a) uma sequência semente compreendendo nucleotídeos aleatórios, e (b) uma sequência não semente compreendendo nucleotídeos desenhados.

Outro aspeto da invenção é um método de preparação de uma biblioteca de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) compreendendo a síntese de uma pluralidade de moléculas de RNA, em que cada molécula de RNA compreende (a) uma sequência semente compreendendo nucleotídeos representativos de uma ou mais sequências semente de microRNA de um organismo-alvo ou um organismo relacionado com o organismo-alvo, e (b) uma sequência não semente compreendendo nucleotídeos desenhados.

Outro aspeto da invenção é um método de preparação de uma biblioteca de pequenos RNAs de interferência (siRNAs), compreendendo adicionalmente os passos de: (a) exclusão de moléculas de RNA compreendendo um ou mais nucleotídeos dentro da sequência semente, que ocorram com baixa frequência nas posições correspondentes de sequências de mi- croRNA de um organismo-alvo ou um organismo relacionado com o organismo-alvo; (b) exclusão de moléculas de RNA compreendendo um quadru- pleto de homonucleotídeos dentro da sequência semente; e/ou (c) exclusão de moléculas de RNA compreendendo uma sequência semente tendo con- teúdo de GC maior nas posições 1-9 do que o conteúdo de GC nas posições 11-19.

Outro aspeto da invenção é uma biblioteca de siRNAs compre-endendo uma pluralidade de moléculas de RNA, em que cada molécula de RNA compreende (a) uma sequência semente compreendendo nucleotídeos aleatórios, e (b) uma sequência não semente compreendendo nucleotídeos desenhados. Outro aspeto da invenção é uma biblioteca de siRNA compreendendo uma pluralidade de moléculas de RNA, em que cada molécula de RNA compreende (a) uma sequência semente compreendendo nucleotídeos representativos de uma ou mais sequências semente de microRNA de um organismo-alvo ou um organismo relacionado com o organismo-alvo, e (b) uma sequência não semente. Em um aspeto, a biblioteca de siRNA é uma biblioteca de siRNA in silico.

Outro aspeto da invenção compreende uma biblioteca de siRNA em que a sequência não semente compreende uma sequência de microRNA de consenso de uma praga ou patógeno de planta ou de um organismo relacionado com uma praga ou patoógeno de planta. Um aspeto da invenção é uma biblioteca de siRNA, em que a sequência não semente compreende nucleotídeos ocupando as posições 1, e 9-19 da SEQ ID NO: 47. Outro aspeto da invenção é uma biblioteca de siRNA, em que a sequência não semente compreende nucleotídeos ocupando as posições 1, e 9-19 da SEQ ID NO: 50. Outro aspeto da invenção é uma biblioteca de siRNA, em que a sequência não semente compreende adicionalmente uma ou mais substituições de nucleotídeos para melhorar a estabilidade do microRNA.

Outro aspeto da invenção é uma biblioteca de siRNA, a qual exclui: (a) moléculas de RNA compreendendo um ou mais nucleotídeos dentro da sequência semente, que ocorram com baixa frequência nas posições cor-respondentes de sequências de microRNA de um organismo-alvo ou um organismo relacionado com o organismo-alvo; (b) moléculas de RNA com-preendendo um quadrupleto de homonucleotídeos dentro da sequência semente; e/ou (c) moléculas de RNA compreendendo uma sequência semente tendo conteúdo de GC maior nas posições 1-9 do que nas posições 11-19.

Outro aspeto da invenção é uma biblioteca de siRNA, a qual exclui moléculas de RNA compreendendo uma sequência semente complementar a um ácido nucleico hospedeiro. Um aspeto adicional da invenção é uma biblioteca de siRNA, a qual compreende uma sequência semente dos resíduos 2-8 da SEQ ID NO: 49. Outro aspeto da invenção é uma biblioteca de siRNA, a qual compreende uma sequência semente dos resíduos 2-8 da SEQ ID NO: 51.

Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA compreendendo (a) uma sequência semente compreendendo nucleotídeos representativos de uma ou mais sequências semente de microRNA de um organismo-alvo ou um organismo relacionado com o organismo-alvo, e (b) uma sequência não semente. Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA que compreende pelo menos cerca de 19 nucleotídeos, e em que a sequência semente compreende 6-8 nucleotídeos. Um aspeto da invenção é uma molécula de siRNA, a qual compreende 21 nucleotídeos, em que a sequência semente compreende nucleotídeos ocupando as posições 2-8 da molécula de RNA, e em que a sequência não semente compreende nucleotídeos ocupando as posições 1 e 9-21 da molécula de RNA. Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA, em que a sequência não semente compreende uma sequência de microRNA de consenso.

Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA, em que a sequência não semente compreende uma sequência de microRNA de consenso de uma praga ou patógeno de planta, ou de um organismo relacionado com uma praga ou patógeno de planta. Um aspeto da invenção é uma molécula de siRNA, em que a sequência não semente compreende nucleo- tídeos ocupando as posições 1, e 9-19 da SEQ ID NO: 49.

Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA, em que a sequência não semente compreende nucleotídeos ocupando as posições 1, e 9-19 da SEQ ID NO: 51. Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA, em que a sequência não semente compreende adicionalmente uma ou mais substituições de nucleotídeos para melhorar a estabilidade do mi- croRNA.

Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA, a qual compreende uma sequência semente dos resíduos 2-8 da SEQ ID NO: 49. Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA, a qual compreende uma sequência semente dos resíduos 2-8 da SEQ ID NO: 48. Um aspeto adicional da invenção é uma molécula de siRNA que compreende uma sequência semente dos resíduos 2-8 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-14. Um aspeto adicional da invenção é uma molécula de siRNA, a qual compreende uma sequência semente dos resíduos 2-8 da SEQ ID NO: 51.

Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA, a qual compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-14. Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA, a qual compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 51.

Outro aspeto da invenção é uma molécula de RNA artificial compreendendo a molécula de siRNA, a qual compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 16-29. Um aspeto adicional da invenção é uma molécula de RNA artificial compreendendo a molécula de siRNA, a qual compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 51.

Outro aspeto da invenção é um vetor compreendendo a molécula de siRNA, a qual compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 31-44. Um aspeto adicional da invenção é um vetor compreendendo a molécula de siRNA, a qual compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 51

Outro aspeto da invenção é uma planta transgênica, ou uma sua parte, compreendendo a molécula de siRNA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-51. Em um aspeto, a planta transgênica é Glycine max. Em outro aspeto, a planta transgênica é Zea mays.

Outro aspeto da invenção é um produto de planta compreendendo a molécula de siRNA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-51. Um aspeto adicional da invenção é um produto de base compreendendo o siRNA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-51.

Outro aspeto da invenção é um método de identificação de um siRNA que confere um resultado fenotípico desejável em um organismo-alvo compreendendo: (a) contacto do organismo-alvo com uma molécula de siRNA de uma biblioteca de siRNA; e (b) correlação do tratamento com siRNA de (a) com o resultado fenotípico desejável. Outro aspeto da invenção é um método de identificação de um siRNA que confere resistência ao nematódeo do cisto da soja compreendendo: (a) contacto do nematódeo do cisto da soja com uma molécula de siRNA de uma biblioteca de siRNA; e (b) correlação do tratamento com siRNA de (a) com a resistência da soja à infeção por ne- matódeo do cisto da soja. Um aspeto adicional da invenção é um método de identificação de um siRNA que confere resistência à lagarta da raiz do milho: (a) contacto da lagarta da raiz do milho com uma molécula de siRNA de uma biblioteca de siRNA; e (b) correlação do tratamento com siRNA de (a) com a resistência do milho à infeção por lagarta da raiz do milho.

Outro aspeto da invenção é um método de conferição de resistência ao nematódeo a uma planta compreendendo a expressão na planta de um ácido nucleico compreendendo um siRNA das SEQ ID NOs: 1-14, onde a planta é resistente ao nematódeo. Outro aspeto da invenção é um método de conferição de resistência aos insetos a uma planta compreendendo a expressão na planta de um ácido nucleico compreendendo um siRNA da SEQ ID NO: 51, onde a planta é resistente aos insetos.

Outro aspeto da invenção é um método de redução da infetivi- dade do nematódeo em uma planta compreendendo o contacto do nemató- deo com um ácido nucleico compreendendo um siRNA das SEQ ID NOs: 1 - 14, onde a infetividade do nematódeo é reduzida. Outro aspeto da invenção é um método de redução da infetividade do inseto em uma planta compreendendo o contacto do inseto com um ácido nucleico compreendendo um siRNA da SEQ ID NO: 51, onde a infetividade do inseto é reduzida.

Um aspeto da invenção é um método de redução do risco de infeção por nematódeo em uma planta compreendendo a expressão na planta de um ácido nucleico compreendendo um siRNA das SEQ ID NOs: 1 -14, onde o risco de infeção por nematódeo é reduzido. Outro aspeto da invenção é um método de redução do risco de infeção por nematódeo em uma planta compreendendo a expressão na planta de um ácido nucleico compre- endendo um siRNA da SEQ ID NO: 51, onde o risco de infeção por inseto é reduzido.

Outro aspeto da invenção é um método de proporcionar um cultivador com um meio de controlo de pragas de nematódeos compreendendo o fornecimento de semente a um cultivador, em que a semente compreende um ácido nucleico compreendendo um siRNA daa SEQ ID NOs: 1-14. Um aspeto adicional da invenção é um método de proporcionar um cultivador com um meio de controlo de pragas de insetos compreendendo o fornecimento de semente a um cultivador, em que a semente compreende um ácido nucleico compreendendo um siRNA da SEQ ID NO: 51.

Outro aspeto da invenção é uma molécula de siRNA que se direciona a um gene de nematódeo e a um gene de planta endógeno relacionados com um fenótipo de planta resistente a nematódeos.

Outro aspeto da invenção é uma planta transgênica, ou sua parte, tendo um nível reduzido de expressão de um gene de resposta ao etileno comparado com uma planta não transgênica da mesma espécie, em que a planta transgênica compreende um siRNA que suprime a expressão de um gene de nematódeo da praga, e em que a planta transgênica tem uma maior tolerância à infeção pela praga de nematódeo do que seria expetável a partir do nível de expressão reduzido do gene de resposta de etileno ou a supressão do gene de nematódeo sozinho.

Outro aspeto da invenção é um método de intensificação da re-sistência a uma planta, ou a sua parte, à infeção por um praga de nemató- deos, compreendendo a introdução na planta, ou em sua parte, de um ácido nucleico compreendendo uma molécula de siRNA que suprime a expressão de um gene de nematódeo da praga, reduzindo desse modo a capacidade do nematódeo em infetar a planta, ou sua parte, e em que a planta, ou sua parte, tem adicionalmente um nível de expressão de um gene de resposta ao etileno comparado com uma planta, ou sua parte, da mesma espécie sem a molécula de siRNA sozinha, onde a planta, ou sua parte, compreendendo que o siRNA tem uma maior resistência à infeção pelo nematódeo do que seria expetável a partir da supressão do gene de nematódeo ou a supressão do gene de resposta ao etileno sozinho.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

A Listagem de Sequências proporciona a divulgação de siRNAs e amiRNAs das seguintes sequências que são aspetos específicos da invenção. As SEQ ID NOs: 1-15 são as sequências de ácido nucleico dos siRNAs, as quais estão também listadas na Tabela 8, abaixo. As SEQ ID NOs: 16-30 são as sequências de ácido nucleico dos amiRNAs, as quais estão também listadas na Tabela 9, abaixo. As SEQ ID NOs: 31-45 são as sequências de ácido nucleico dos amiRNAs em vetores de expressão, as quais estão também listadas na Tabela 10, abaixo. A SEQ ID NO: 46 é o controlo do vetor de expressão vazio. A SEQ ID NO: 47, 5‘-UNNNNNNNUGUUGAUCUGGUU-3‘, é a sequência de um siRNA contendo uma sequência semente aleatória e uma sequência não semente que é um consenso dos miRNAs de C. elegans, como descrito no Exemplo 1, abaixo. A SEQ ID NO: 48, 5‘-URDSDKVDUGUUGAUCUGGUU-3‘, engloba as sequências de todos os siRNAs na biblioteca enriquecida, preparadas como descrito no Exemplo 1, abaixo. A SEQ ID NO: 49, 5‘-URDBDKVDUGUUGAUCUGGUU-3‘, engloba as sequências para siRNAs tendo atividade contra o nematódeo do cisto da soja, como descrito no Exemplo 4, abaixo. A SEQ ID NO: 50, 5‘-UNNNNNNNUAUCCGGAUUCUU-3‘, é a sequência de um siRNA contendo uma sequência semente aleatória e uma sequência não semente que é um consenso dos miRNAs de Tribolium cas- taneum, como descrito no Exemplo 6, abaixo. A SEQ ID NO: 51, 5‘-UNDNWDNNUAUCCGGAUUCUU-3‘, engloba as sequências de todos os siRNAs na biblioteca enriquecida, preparadas como descrito no Exemplo 6, abaixo. A SEQ ID NO: 52 é a sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico ETR1 de soja (gma-ETR1), número de acesso do GenBank EF210138. A SEQ ID NO: 53 é a sequência de nucleotídeos compreendendo a porção de mRNA de uma ETR1 de soja que se liga a siRNA0097 e siRNA0145. A SEQ ID NO: 54 é a sequência de nucleotídeos compreendendo a porção de mRNA de uma ETR1 de soja que se liga a siRNA0097* e siRNA0145*. A SEQ ID NO: 55 é a sequência de nucleotídeos de siR- NA0097*. A SEQ ID NO: 56 é a sequência de nucleotídeos de siR- NA0145*. A SEQ ID NO: 57 é a sequência de nucleotídeos descrevendo a sequência de mRNA de uma ETR1 de soja que tem baixa complementarida-de com amiRNA0043*. A SEQ ID NO: 58 é a sequência de nucleotídeos descrevendo a sequência de mRNA de uma ETR1 de soja que tem baixa complementarida-de com amiRNA0046*. A SEQ ID NO: 59 é a sequência de nucleotídeos de siR- NA0043*. A SEQ ID NO: 60 é a sequência de nucleotídeos de siR- NA0046*.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A invenção proporciona métodos para preparação de uma biblioteca de pequenos RNAs de interferência (siRNAs), bibliotecas produzidas pelos métodos, e moléculas de siRNA individuais. Como descrito aqui, o desenho da biblioteca inclui enriquecimento dos siRNAs tendo sequências especificas de alvos. As bibliotecas são úteis para seleção de um ou mais siRNAs que induzem um fenótipo desejado quando em contacto com um organismo-alvo, Também proporcionados são siRNAs produzidos desse modo e métodos de uso dos mesmos.

Moléculas de siRNA A invenção divulgada aqui proporciona uma estratégia para o desenho de siRNAs tendo atividade em um organismo-alvo. Também pro- porcionados são siRNAs produzidos desse modo, os quais têm utilidade para numerosas aplicações, como descrito aqui abaixo. O escopo da invenção não está limitado a ácidos nucleicos ou a bibliotecas compreendendo siRNAs para os quais sequências específicas são divulgadas aqui. Ao invés, podem ser usadas sequências de qualquer organismo, quer conhecidas, quer presentemente conhecidas, para desenhar siRNAs de acordo com os métodos divulgados.

O termo "RNA" inclui qualquer molécula compreendendo pelo menos um resíduo de ribonucleótido, incluindo aquelas possuindo um ou mais ribonucleotídeos naturais das seguintes bases: adenina, citosina, gua- nina, e uracila; abreviadamente A, C, G, e U, respetivamente, ribonucleotí- deos modificados, e não ribonucleotídeos. "Ribonucleótido" significa um nu- cleótido com um grupo hidroxila na posição 2' da fração de D-ribofuranose.

Como usado aqui, os termos e frases "RNA", "molécula(s) de RNA", e "sequência(s) de RNA" são usados indistintamente para se referirem a RNA que medeia a interferência de RNA. Estes termos e frases incluem RNA de fita única, RNA de fita dupla, RNA isolado, RNA parcialmente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA recombinante, RNA intracelular, e RNA que difere de RNA que ocorre naturalmente pela adição, deleção, substituição, e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. "mRNA" refere-se a RNA mensageiro, o qual é RNA produzido pela transcrição.

Um "RNA de interferência" (e.g., siRNA e miRNA) é uma molécula de RNA capaz de silenciamento ou supressão gênica pós-transcricional, silenciamento de RNA, e/ou expressão gênica decrescente. Os RNAs de interferência afetam o silenciamento gênico pós-transcricional específico de sequências em animais e plantas por emparelhamento de bases com a sequência de mRNA de um ácido nucleico alvo. Assim, o siRNA é pelo menos parcialmente complementar com o gene silenciado. O siRNA parcialmente complementar pode incluir uma ou mais não correspondências, protuberâncias, laços internos, e/ou pares de bases não de Watson-Crick (i..e, pares de bases de G-U oscilantes).

Os termos "silenciamento" e "supressão" são usados indistintamente para descrever geralmente reduções substanciais e mensuráveis da quantidade de mRNA disponível na célula para ligação e descodificação por ribossomas. O RNA transcrito pode estar na orientação senso para efetivar o que é referido como cosupressão, na orientação antissenso para efetivar o que é referido como supressão antissenso, ou em ambas as orientações produzindo um RNA de fita dupla para efetivar o que é referido como interferência de RNA. O gene "silenciado" refere-se a um gene que está sujeito a silenciamento ou supressão do mRNA codificado pelo gene.

As descrições "pequeno RNA de interferência" e "siRNA" são usadas indistintamente aqui para descrever um RNA de interferência sintético ou não natural. Os termos "miRNA" ou "microRNA" referem-se geralmente a RNAs de interferência natural ou endógenos. Como usado aqui, "miR- NA" refere-se a RNAs de interferência que foram ou serão processados in vitro ou in vivo a partir de um precursor de pré-microRNA para formar o RNA de interferência ativo. Quer os siRNAs e os miRNAs são moléculas de RNA de cerca de 19-24 nucleotídeos, embora possam ser também úteis siR- NAs/miRNAs mais curtos ou mais longos, e.g., entre 18 e 26 nucleotídeos de comprimento. Os siRNAs e os miRNAs podem ser de fita única ou de fita dupla.

Os microRNAs são codificados por genes que são transcritos mas não traduzidos em proteínas (ADN não codificante), embora alguns miRNAs sejam codificados por sequências que se sobrepõem a genes codificando proteínas. Os miRNAs são processados a partir de transcritos primários conhecidos por pri-miRNAs para encurtar estruturas em ansa chamados pré-miRNAs que são adicionalmente processados criando siRNAs/miRNAs funcionais. Tipicamente, uma porção do miRNA precursor é clivada para produzir a molécula de miRNA final. As estruturas em ansa podem variar de, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 80 nucleotídeos, ou cerca de 60 nu- cleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos (incluindo os resíduos de miRNA, aqueles emparelhando com o miRNA, e quaisquer segmentos intervenientes). A estrutura secundária da estrutura em ansa não está completamente emparelhada com bases; não correspondências, protuberâncias, laços internos, bases de pares não de Watson-Crick (i.e., bases de pares de G-U oscilantes), e outras características são frequentemente observadas em pré- miRNAs e pensa-se que tais características sejam importantes para o processamento. As moléculas de miRNA maduras são parcialmente complementares com uma ou duas moléculas de RNA mensageiro, e funcionam como reguladores da expressão gênica. Os siRNAs da invenção têm propriedades estruturais e funcionais de miRNAs endógenos (e.g., funções de si- lenciamento e de supressão gênico). Assim, em vários aspetos da invenção, os siRNAs da invenção podem ser processados a partir de uma porção de um transcrito precursor que, opcionalmente, se dobra em uma estrutura em grampo (i.e., um duplex) ou em ansa estável.

As frases "pequenos RNAs de interferência específicos de alvos", "siRNAs específicos de alvos", "microRNAs específicos de alvos", "miRNAs específicos de alvos", "amiRNAs específicos de alvos", e " sequência de nucleotídeos específica de alvos" referem-se a RNAs de interferência que foram desenhados para hibridar seletivamente com ácidos nucleicos em um organismo-alvo mas não em um organismo não alvo, tal como um organismo hospedeiro (o organismo expressando ou produzindo o miRNA) ou um consumidor do organismo-alvo. Consequentemente, "siRNAs ou amiR- NAs específicos de alvos" produzem somente fenótipos em organismos-alvo e não produzem fenótipos em organismos não alvo.

Em um aspeto da invenção, uma molécula de siRNA compreende (a) uma sequência semente compreendendo nucleotídeos representativos de uma ou mais sequências semente de microRNA de um organismo- alvo ou um organismo relacionado com o organismo-alvo, ou uma sua sequência de consenso, e (b) uma sequência não semente. Tais moléculas de siRNA compreendem pelo menos cerca de 19 nucleotídeos, em que a sequência semente compreende 6-7 nucleotídeos.

A descrição "sequência semente", como usada aqui, refere-se a uma região de uma molécula de siRNA que é pelo menos parcialmente complementar com um gene ou RNA alvo. Como usado aqui, a sequência semente consiste em 6-7 nucleotídeos começando no segundo resíduo a partir da extremidade 5' de um siRNA (e.g., nucleotídeos 2-7 ou 2-8, como numerados linearmente a partir da extremidade 5' de um siRNA). As sequências semente são as regiões mais altamente conservadas entre os miRNAs de metazoano, e os miRNAs com a mesma sequência nos nucleo- tídeos 2-8 partilham os mesmos alvos de mRNA previstos. Ver Bartel (2009) Cell 136, 215-233.

Em um aspeto da invenção, nucleotídeos dentro da sequência semente são baseados na frequência à qual nucleotídeos particulares são observados em sequências semente de miRNA de um "organismo-alvo", i.e., um organismo no qual um siRNA da invenção se destina a ser funcional no silenciamento gênico. Similarmente, nucleotídeos dentro da sequência semente podem ser baseados na frequência à qual nucleotídeos particulares são observados em sequências semente de miRNA de um "organismo relacionado com um organismo-alvo". Neste contexto, "relacionado" significa proximidade filogênica relativa entre e no meio de organismos, quer as relações evolutivas sejam determinadas por traços fenotípicos, marcadores moleculares, e/ou variação em taxas de especiação e/ou extinção, ou identidade ou similaridade de sequências. O grau de relação pode estar em alguns aspetos intimamente relacionado através da filogenia, tal como partilha do mesmo gênero ou família. Em outros aspetos, o grau de relação filogênica pode ser distante, tal como partilha de somente o mesmo filo ou classe. Em outros aspetos, pode não existir relação filogénica para haver direcionamento a um organismo mas a sequência semente pode estar "relacionada" com o organismo-alvo através de homologia, similaridade, ou identidade de sequências. A sequência não semente de consenso pode ser também preparada a partir de sequências não semente do organismo-alvo e/ou de um ou mais organismos relacionados com o organismo-alvo. Como usado aqui, qualquer organismo que contenha ácidos nucleicos capazes de interatuar com sequências semente da invenção divulgada aqui é um organismo- "alvo".

Os nucleotídeos da sequência semente podem ser adicional- mente selecionados com base nas frequências observadas a cada posição em miRNAs que ocorrem naturalmente, por exemplo, por exclusão daqueles nucleotídeos que são observados a uma baixa frequência. Uma baixa frequência pode compreender uma incidência observada de menos do que cerca de 50% entre uma população de miRNAs que ocorrem naturalmente, ou menos do que cerca de 45%, ou menos do que cerca de 40%, ou menos do que cerca de 35%, ou menos do que cerca de 30%, ou menos do que cerca de 25%, ou menos do que cerca de 20%, ou menos do que cerca de 15%, ou menos do que cerca de 10%, ou menos do que cerca de 5%.

A sequência semente pode alternativamente compreender um consenso de uma ou mais sequências semente de miRNA de um organismo-alvo e/ou um organismo relacionado com um organismo-alvo. Ver também Exemplo 1. A frase "sequência de consenso", como usada aqui, refere- se a uma sequência de nucleotídeos em que cada nucleótido representa o nucleótido mais frequentemente observado a uma posição particular na sequência quando sequências similares ou relacionadas são comparadas uma com a outra como descrito aqui para determinação da similaridade ou identidade (ver abaixo). Como usada aqui, a sequência de consenso de um siRNA, ou sua parte, refere-se ou a um grupo selecionado de siRNAs ou a todos os siRNAs que estão conservados dentro de um organismo, espécie, gênero, família, ordem, classe, filo, reino, ou domínio. O termo "consenso" engloba também elementos estruturais conhecidos ou previstos a partir da sequência, ou a partir de sequências análogas ou homólogas, tais como dú- plexes, não correspondências, protuberâncias, pares de bases de G-U oscilantes, laços, grampos, tetralaços, inter alia, os quais são observados em sequências de pri-mRNA, pré-miRNA, miRNA ou siRNA que se pensa serem importantes para o processamento de miRNA. Ver, e.g., Saxena et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 44312-44319.

Sequências semente de siRNA representativas da invenção incluem os resíduos 2-8 da SEQ ID NO: 48, a qual é uma sequência de consenso degenerada, a degeneração baseada na frequência de nucleotídeos observados nas mesmas posições em miRNAs que ocorrem naturalmente de C. elegans. Sequências semente representativas adicionais incluem os resíduos 2-8 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-14, e os resíduos 2-8 da SEQ ID NO: 49, a qual é um consenso das sequências semente das SEQ ID NOs: 1-14. Adicionalmente, a SEQ ID NO: 51 é uma sequência de consenso degenerada, a degeneração baseada na frequência de nucleotídeos observados nas mesmas posições em miRNAs que ocorrem naturalmente de Tri- bolium castaneum.

A descrição "sequência não semente", como usada aqui, refere- se a todas as sequências de um siRNA ou miRNA que não sejam a sequência semente. Para um siRNA de 21 nucleotídeos, a sequência não semente compreende os nucleotídeos lineares 1 e 8-21 ou 1 e 9-21, dependendo se a sequência semente consiste em 6 nucleotídeos (e.g., posições 2-7) ou 7 nu- cleotídeos (e.g., posições 2-8). Em um aspeto da invenção, a sequência não semente compreende uma sequência não semente de miRNA que ocorre naturalmente. Em outro aspeto da invenção, a sequência não semente com-preende uma sequência não semente de microRNA de consenso, i.e., um consenso de sequências não semente de miRNA. Um tal consenso pode ser preparado a partir de duas ou mais sequências não semente de miRNA, por exemplo, três sequências de miRNA, ou quatro sequências de miRNA, ou cinco sequências de miRNA, ou seis sequências de miRNA, ou sete sequências de miRNA, ou oito sequências de miRNA, ou nove sequências de miRNA, ou dez sequências de miRNA, ou vinte sequências de miRNA, ou trinta sequências de miRNA, ou quarenta sequências de miRNA, ou cinquenta sequências de miRNA, ou mais. Um perito na técnica compreende técnicas e ferramentas computacionais para fabrico de tais alinhamentos e pode prontamente preparar sequências de consenso usando qualquer número de sequências de miRNA.

Em um aspeto da invenção, a sequência não semente de miR- NA ou os consensos das sequências não semente de miRNA compreendem um consenso de sequências não semente de um "organismo-alvo", i.e., um organismo no qual um siRNA da invenção se destina a ser funcional no si- lenciamento gênico. Similarmente, o consenso das sequências não semente de miRNA pode compreender um consenso de sequências não semente relacionadas com o organismo-alvo. Neste contexto, "relacionado" significa proximidade filogênica relativa entre ou no meio de organismos, como descrito aqui acima no que dizia respeito ao desenho de sequências semente.

Em outro aspeto da invenção, a sequência não semente é parci-almente ou completamente sintética, i.e., uma sequência que não ocorre naturalmente que mostra propriedades funcionais desejadas como determinado por modulação ou empiricamente. Por exemplo, a sequência não semente pode compreender uma ou mais substituições relativas a uma sequência de miRNA, uma sequência de siRNA, ou uma sequência de consenso de miRNA/siRNA que ocorre naturalmente para melhorar a estabilidade do siRNA, tal como uridinas ou deozitimidina 3'-terminais. Ver Exemplo 1.

Por exemplo, onde o organismo-alvo é um nematódeo parasítico de plantas, uma sequência não semente útil pode compreender um consenso de sequências não semente de miRNA do nematódeo modelo Cae- norhabditis elegans. Uma sequência não semente representativa tendo estas propriedades está estabelecida como os nucleotídeos 1 e 9-19 da SEQ ID NO: 47. Ver Exemplo 1. Como outro exemplo, onde o organismo-alvo é um nematódeo parasítico de plantas, outras sequências semente úteis incluem sequências de consenso de sequências não semente de miRNA de um ou mais nematódeos identificados na Tabela 6. Como um exemplo adicional, onde o organismo-alvo é uma praga de insetos, uma sequência não semente útil pode compreender um consenso de sequências não semente de miR- NA do organismo Tribolium castaneum. Uma sequência não semente representativa tendo estas propriedades está estabelecida como os nucleotídeos 1 e 9-19 da SEQ ID NO: 50. Ver Exemplo 6. siRNAs representativos da invenção incluem as SEQ ID NOs: 114, as quais foram obtidas da biblioteca de siRNA descrita no Exemplo 1. Moléculas de siRNA adicionais da invenção incluem moléculas de bibliotecas de siRNA produzidas pelos métodos descritos aqui abaixo.

A invenção também proporciona "microRNAs artificiais" ou "amiRNAs", os quais são sequências de ácido nucleico que não ocorrem naturalmente que são capazes de expressar moléculas de siRNA. Em um aspeto da invenção, a sequência do precursor de miRNA de Glycine max gma-MIR164 foi usada como a sequência de início ou suporte para o desenho de um microRNA artificial direcionando-se a nematódeos que serão expressos em um hospedeiro de planta. O desenho deste microRNA artificial para uso na soja é descrito na Aplicação Provisória dos E.U.A. 61/421275 e uma abordagem similar para uso de amiRNAs em Arabidopsis thaliana é descrita por Schwab et al. (2006) Plant Cell 18, 1121-1133, ambos os quais são incorporados aqui por referência na sua totalidade. amiRNAs representativos da invenção incluem amiRNAS compreendendo um siRNA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-14, por exemplo, os amiRNAs estabelecidos como as SEQ ID NOs: 16-29.

Os siRNAs descritos acima, ou sequências semente ou não semente deles, ou seus precursores (e.g., pri-miRNA e pré-miRNA), podem ser adicionalmente alterados pela adição, deleção, substituição, e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos para introduzir variação; para modificar a especificidade; para alterar a complementaridade; para introduzir ou remover elementos estruturais secundários tais como não correspondências, protuberâncias, laços, regiões de fita única, regiões de fita dupla, saliências, ou outros motivos; para intensificar ou manter a capacidade do RNA de ser processado em um complexo CSIA in vitro ou in vivo; para melhorar a estabilidade da molécula de RNA in vitro ou in vivo (i.e., a capacidade da molécula de RNA em ser mantida sem ser degradada por nucleases e/ou a sua capacidade de se dobrar em estruturas secundárias ou terciárias estáveis); e/ou para intensificar a capacidade de hibridação com um gene/RNA alvo.

Ácidos nucleicos que partilham um grau substancial de comple-mentaridade formarão interações estáveis uns com ou outros, por exemplo, por correspondência de pares de bases. Os termos "complementar" ou "complementaridade" referem-se a emparelhamento de bases de bases de nucleotídeos em ácidos nucleicos. A frase "complementaridade perfeita", como usada aqui, refere-se a emparelhamento de bases completo (100%) dentro de uma região contígua de ácido nucleico, tal como entre uma se quência semente em um siRNA e a sua sequência complementar em um gene/RNA alvo, como decrito aqui. "Complementaridade parcial" ou "parcialmente complementar" indica que duas sequências podem emparelhar as bases um com a outra, embora a complementaridade não seja 100%. Como usada aqui, a frase "sequência complementar com uma sequência" é usada para descrever uma sequência de nucleotídeos capaz de emparelhar as bases com outra sequência, embora a complementaridade possa não ser 100%.

Alternativamente indicado, a frase "sequência complementar com uma sequência" no que diz respeito a duas sequências de nucleotídeos indica que as duas sequências de nucleotídeos têm suficiente complementaridade e têm a tendência natural de interatuarem uma com a outra para formar uma molécula de fita dupla. Duas sequências de nucleotídeos podem formar interações estáveis uma com a outra dentro de uma ampla gama de complementaridades de sequências. Sequências de nucleotídeos com altos graus de complementaridade são geralmente mais fortes e/ou mais estáveis do que aquelas com baixos graus de complementaridade. Podem ser requeridas diferentes forças de interação para diferentes processos. Por exemplo, a força da interação para o propósito de formação de um dúplex de sequências de nucleotídeos estável in vitro pode ser diferente daquela para o propósito de formação de uma interação estável entre um siRNA e uma sequência de ligação in vivo. A força da interação pode ser prontamente experimentalmente determinada ou prevista com software apropriado por uma pessoa perita na técnica.

Os termos "hibrida" ou "hibridação", como usados aqui, referem- se à capacidade de uma sequência ou molécula de ácido nucleico em emparelhar as bases com uma sequência complementar e formar uma estrutura de ácido nucleico em dúplex. A hibridação pode ser usada para testar se dois polinucleotídeos são substancialmente complementares um com o outro e para medir quão estável a interação é. Polinucleotídeos que partilham um grau suficiente de complementaridade hibridarão um com o outro sob várias condições de hibridação. Consequentemente, polinucleotídeos que partilham um elevado grau de complementaridade formam assim interações estáveis fortes e hibridarão um com o outro sob várias condições de hibridação es- tringentes. "Condições de hibridação estringentes" são bem conhecidas na técnica, como descritas em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I. Uma condição de hibridação estringente exemplar compreende hibridação em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguida de uma ou mais lavagens em 0,2x SSC e SDS a 0,1% a 5065°C.

"Homólogo", "homologia", "idêntico", e "identidade", tal como usados aqui, referem-se a comparações entre sequências de ácidos nuclei- cos. Quando referentes a moléculas de ácido nucleico, "homologia", "similaridade", "identidade", ou "percentagem de identidade", refere-se à percentagem dos nucleotídeos de uma sequência de ácido nucleico particular que foram correspondidos com sequências de nucleotídeos similares ou idênticas por um programa de análise de sequências. "Identidade" ou "similaridade" de sequências, como conhecido na técnica, é a relação entre duas ou mais sequências de polinucleotídeos, como determinado por comparação das sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de parentesco de sequências entre sequências de polinucleotídeos, como determinado pela correspondência entre tais sequências. Para determinar a percentagem de identidade ou similaridade de duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ótima (i.e., podem ser introduzidas falhas na sequência de uma primeira sequência de ácido nucleico para alinhamento ótimo com uma segunda sequência de ácido nu- cleico). Os nucleotídeos em posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo ou similar nucleótido como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas ou similares em essa posição, respectivamente. A percentagem de identidade ou similaridade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas ou similares partilhadas pelas sequências (i.e., a percentagem (%) de identidade é o número de posições idênticas dividido pelo número total de posições (e.g., posições sobrepostas) x 100). Duas sequências que partilham 100% de identidade de sequências são idênticas. Duas sequências que partilham menos do que 100% de identidade, mas mais do que 50% de identidade, são similares. Sequências com menos do que 50% de identidade são dissimila- res.

Ambas a identidade e a similaridade podem ser prontamente calculadas. Métodos comummente empregues para determinar a identidade ou a similaridade entre sequências incluem, mas não estão limitados àqueles divulgados em Carillo et al. (1988) SIAM J. Applied Math. 48, 1073. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268, modificado como em Karlin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877. Um tal algoritmo está incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990) J Mol. Biol. 215, 403-410. Para obter alinhamentos com falhas para propósitos de comparação, pode ser utilizado Gapped BLAST como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402. Alternativamente, pode ser usado PSI-Blast para realizar uma procura iterada que deteta relações distantes entre moléculas. Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast, podem ser usados os parâmetros padrão dos respetivos programas (e.g., XBLAST e NBLAST). Adicionalmente, pode ser também usado o método FASTA. Ver Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Outro exemplo de um algoritmo matemático útil para a comparação de se-quências é o algoritmo de Myers et al. (1988) CABIOS 4, 11-17. A percentagem de identidade entre duas sequências pode ser também determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48, 443453. Outro algoritmo para cálculo da percentagem de identidade entre duas sequências é determinado usando o método da homologia local. Smith e Waterman (1981) J. Mol. Biol., 147, 195-197. Podem ser produzidos alinhamentos ótimos por inserção de falhas para maximizar o número de correspondências.

A invenção proporciona métodos para atenuação ou inibição da expressão gênica em uma célula usando pequeno RNA de interferência (siRNA). O siRNA contém uma sequência de nucleotídeos que hibrida sob condições fisiológicas da célula com a sequência de nucleotídeos de pelo menos uma porção do mRNA alvo do gene a ser inibido (i.e., o gene alvo). Os métodos descritos aqui não requerem 100% de identidade ou complementaridade de sequências entre o siRNA e o gene alvo. Pela utilização de ferramentas bioinformáticas, a sequência pode conter pares não correspondentes de nucleotídeos. Assim, os métodos da invenção têm a vantagem de serem capazes de tolerar algumas variações de sequência que podem ser expetáveis devido a mutação genética, polimorfismo de estirpe, ou divergência evolutiva.

Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que plantas transformadas de acordo com a invenção transcrevem uma molécula(s) de RNA com uma região homóloga e uma região complementar do gene alvo da praga, e em que o(s) transcrito(s) forma(m) uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA). A planta reconhece o dsRNA como uma potencial substância estranha (e.g., uma substância de origem viral). A enzima dicer da planta corta o RNA de fita dupla em pedaços de RNA de fita única com cerca de 23 nu- cleotídeos em comprimento, chamados pequenos RNAs de interferência (siRNAs). Estes siRNAs são consumidos por pragas invasoras que entraram na planta através da digestão de células da planta (e.g., cutina). Uma vez absorvidos, os siRNAs podem ser incorporados nos complexos de silencia- mento induzidos por RNA da praga. O complexo CSIA pode depois digerir o mRNA do gene homólogo da praga, limitando a capacidade da praga em lesar a planta.

Bibliotecas de siRNA Pode ser usada uma pluralidade das moléculas de siRNA acima descritas, i.e., dois ou mais siRNAs, para preparar uma biblioteca de siRNA. Com base no desenho específico do alvo das moléculas de siRNA, tais bibliotecas proporcionam um meio eficaz de rastreio de fenótipos desejáveis em um organismo-alvo.

Assim, em um aspeto da invenção, um método de preparação de uma biblioteca de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) compreende a síntese de uma pluralidade de moléculas de RNA, em que cada molécula de RNA compreende (a) uma sequência semente compreendendo nucleotí- deos aleatórios, e (b) uma sequência não semente compreendendo nucleo- tídeos desenhados. Em outro aspeto da invenção, um método de preparação de uma biblioteca de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) compreende a síntese de uma pluralidade de moléculas de RNA, em que cada molécula de RNA compreende (a) uma sequência semente compreendendo nucleotídeos representativos de uma ou mais sequências semente de mi- croRNA de um organismo-alvo ou um organismo relacionado com o organismo-alvo, e (b) uma sequência não semente compreendendo nucleotídeos desenhados.

De acordo com os métodos divulgados, podem ser preparadas bibliotecas por síntese real de cada uma das pluralidades de moléculas de siRNA, o que pode ser alcançado usando técnicas como conhecido na técnica, incluindo síntese química automatizada, opcionalmente usando uma mistura de nucleotídeos para criar uma sequência randomizada. A invenção também engloba a preparação in silico de uma biblioteca, i.e., o uso de técnicas computacionais para gerar sequências de cada uma das pluralidades de moléculas de siRNA. Em muitos casos, a preparação in silico será útil para os passos iniciais na preparação da biblioteca, incluindo os passos de exclusão de moléculas de siRNA para desse modo enriquecer em sequências específicas de alvos, como descrito mais abaixo.

Em um aspeto da invenção, uma biblioteca de siRNA compreende moléculas de siRNA, em que cada molécula contém um sequência semente randomizada, i..e, cada possível combinação dos quatro ribonucleo- sídeos padrão (i..e, adenosina, citidina, guanosina, e uridina) é estocastica- mente representada em cada posição dentro da sequência semente rando- mizada. Em outros aspetos da invenção, a preparação de uma biblioteca de siRNA envolve um ou mais passos para excluir moléculas de siRNA com baixa complexidade e/ou baixa especificidade.

Por exemplo, em alguns aspetos da invenção, o método de pre-paração de uma biblioteca pode compreender adicionalmente (a) exclusão de moléculas de RNA compreendendo um ou mais nucleotídeos dentro da sequência semente, que ocorram com baixa frequência nas posições cor-respondentes de sequências de microRNA de um organismo-alvo ou um organismo relacionado com o organismo-alvo; (b) exclusão de moléculas de RNA compreendendo um quadrupleto de homonucleotídeos dentro da sequência semente; e/ou (c) exclusão de moléculas de RNA compreendendo uma sequência semente tendo conteúdo de GC maior nas posições 1-9 do que o conteúdo de GC da sequência não semente nas posições 11-19.

A descrição de nucleotídeos que ocorrem a baixa frequência em miRNAs de um organismo-alvo refere-se a uma incidência observada de menos do que cerca de 50% entre uma população de miRNAs que ocorrem naturalmente, ou menos do que cerca de 45%, ou menos do que cerca de 40%, ou menos do que cerca de 35%, ou menos do que cerca de 30%, ou menos do que cerca de 25%, ou menos do que cerca de 20%, ou menos do que cerca de 15%, ou menos do que cerca de 10%, ou menos do que cerca de 5%.

Alternativamente indicado, os siRNAs da biblioteca podem ser mantidos se o siRNA conter nucleotídeos dentro da sequência que sejam observados a um nível limiar entre miRNAs que ocorrem naturalmente. Tal nível limiar pode se variado como desejado, com um limiar mais alto estando geralmente correlacionado com especificidade do alvo aumentada. Por exemplo, um nível de limiar pode ser pelo menos cerca de 1% de frequência, ou maior, à qual um nucleótido é observado entre miRNAs que ocorrem naturalmente, ou cerca de 5%, ou maior, ou cerca de 10%, ou maior, ou cerca de 20%, ou maior, ou cerca de 30%, ou maior, ou cerca de 40%, ou maior, ou cerca de 50%, ou maior, ou cerca de 60%, ou maior, ou cerca de 70%, ou maior, ou cerca de 80%, ou maior, ou cerca de 90%, ou maior, ou cerca de 95%, ou maior. Em um aspeto particular da invenção, o limiar de frequência refere-se a um nucleótido que ocorre a uma posição correspondente em uma sequência semente maior do que cerca de 20% comparada com um consenso de sequências semente pesquisadas do genoma de C. elegans. Ver Exemplo 1. Em outro aspeto da invenção, o limiar de frequência refere- se a um nucleótido que ocorre a uma posição correspondente em uma sequência semente maior do que cerca de 20% comparada com um consenso de sequências semente pesquisadas do genoma de Tribolium castaneum. Ver Exemplo 6.

Um "quadropleto de homonucleotídeos" refere-se ao mesmo nu- cleótido sendo repetido quatro vezes em sucessão, tal como AAAA dentro de uma sequência semente.

O "conteúdo-GC" (ou conteúdo de guanosina-citidina) de uma sequência refere-se à percentagem de bases em uma molécula ou sequência de ácido nucleico ou região específica de uma sequência que sejam ou guanosina ou citidina. Por exemplo, quando uma sequência tem pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 10%, ou pelo menos cerca de 5%, ou pelo menos cerca de 1% de conteúdo-GC e, do mesmo modo, a sequência não semente tem no máximo cerca de 40%, no máximo cerca de 50%, ou no máximo cerca de 60%, ou no máximo cerca de 70%, ou no máximo cerca de 80%, ou no máximo cerca de 90%, ou no máximo cerca de 95%, ou no máximo cerca de 99% de conteú- do-GC, respetivamente.

Alternativamente ou adicionalmente, um método de preparação de uma biblioteca pode compreender adicionalmente um passo de exclusão de moléculas de RNA complementares a um ácido nucleico hospedeiro. Deste modo, as moléculas de siRNA da biblioteca não incluirão siRNAs suscetíveis de serem funcionais quanto ao silenciamento gênico em um organismo hospedeiro.

Um "hospedeiro" é um organismo que se destina a expressão ou produção de um siRNA. Em um aspeto da invenção, um organismo hospedeiro é o mesmo do que um organismo-alvo, i.e., o siRNA é expresso ou produzido no mesmo organismo no qual ele se destina a ser funcional. Em outro aspeto da invenção, o organismo serve como um transportador do siRNA ao organismo-alvo. Como um exemplo, um organismo hospedeiro pode compreender uma planta, em que o organismo-alvo é uma praga ou patógeno da planta. Em aspetos particulares da invenção, o organismo hospedeiro é Glycine max. Em outros aspetos da invenção, o organismo hospedeiro é Zea mays.

As bibliotecas de siRNA da invenção incluem moléculas de siRNA como descritas aqui. Conformemente, as sequências semente e não semente de moléculas de siRNA na biblioteca podem compreender as sequências semente e não semente específicas de alvos, incluindo sequências de consenso, como descrito aqui acima. O escopo da invenção não está limitado a uma biblioteca compreendendo siRNAs para os quais sequências específicas são divulgadas aqui. Ao invés, podem ser usadas sequências de qualquer organismo, quer conhecidas, quer presentemente conhecidas, para preparar siRNAs específicos de alvos de acordo com os métodos divulgados, como descrito aqui mais abaixo.

Composições Adicionais Compreendendo siRNAs A invenção também proporciona ácidos nucleicos compreendendo os siRNAs, miRNAs artificiais, e bibliotecas de siRNA divulgados. Tais ácidos nucleicos são geralmente úteis para produção ou expressão dos siRNAs de uma maneira que eles possam contactar e se direcionar a ácidos nucleicos, i.e., ácidos nucleicos a serem regulados pelo siRNA.

No contexto da invenção, a frase "ácido nucleico" ou o termo "nucleotídeos" refere-se a oligonucleotídeos e polinucleotídeos tais como ácido ribonucleico (RNA) e ácido deoxiribonucleico (ADN). A frase ácido nu- cleico dever ser também entendida como incluindo, como aplicável, polinu- cleotídeos de fita simples (tal como senso ou antissenso) ou de fita dupla. Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ser parcialmente ou completamente sintéticos, e podem ser isolados e/ou purificados (i.e., a partir do seu ambiente natural), em forma substancialmente pura ou homogênea, ou estarem isentos ou substancialmente isentos de outros ácidos nu- cleicos.

Ácidos nucleicos representativos compreendendo siRNAs da in-venção incluem construtos e vetores de expressão. O termo "construto de expressão" refere-se a um ácido nucleico adequado para expressão ou produção em uma célula. O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico (plasmídeo, vírus, bacteriófago, artificial, heterólogo, ou ADN cortado) que possa ser usado para distribuir um polinucleótido heterólogo ou natural da invenção em uma célula hospedeira. Os vetores são capazes de serem replicados e contêm locais de clonagem para introdução de um poli- nucleótido estranho.

Aqueles peritos na técnica são prontamente capazes de preparar construtos e vetores de expressão da invenção divulgados aqui e expressar recombinantemente os mesmos. Para detalhes adicionais ver, e.g., Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I. Tais técnicas e protocolos aplicáveis para manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construtos de ácido nucleico, mutagênese, sequenciação, introdução de ADN em células e expressão gênica, e análise de proteínas, são descritos em detalhe em Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

Técnicas e vetores de expressão específicos previamente usados com amplo sucesso em plantas são descritos por Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721, e Guerineau e Mullineaux, (1993) “Plant transformation and expression vectors,” Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD, ed.) Oxford, BIOS Scientific Publishers, 121-148.

Os construtos de expressão incluem um promotor operacionalmente ligado a um ácido nucleico compreendendo um siRNA, por exemplo, um microRNA artificial, como descrito aqui acima. Promotores úteis incluem promotores constitutivos, promotores direcionam espacialmente e temporalmente a expressão regulada (e.g., promotores específicos de tecidos e específicos de fases de desenvolvimento), e promotores induzíveis. Os cons- trutos de expressão podem também conter intensificadores da expressão gênica como conhecido na técnica.

Podem ser utilizados promotores preferenciais de tecidos para se direcionarem à expressão intensificada de uma sequência de interesse dentro de um tecido de planta particular. Promotores preferenciais de tecido incluem Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12, 255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38, 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen. Genet. 254, 337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6, 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112, 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112, 525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112, 513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35, 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20, 181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23, 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90, 9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4, 495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.

Promotores preferenciais de folhas são conhecidos na técnica. Ver, e.g., Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12, 255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105, 357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35, 773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3, 509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23, 1129-1138; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9586-9590. Adicionalmente, os promotores de cab e rubisco podem ser também usados. Ver, e.g., Simpson et al. (1958) EMBO J. 4, 2723-2729 e Timko et al. (1988) Nature 318, 57-58.

Promotores preferenciais de raízes são conhecidos e podem ser selecionados dos muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo a partir de várias espécies compatíveis. Ver, e.g., Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20, 207-218 (gene da glutamina sintetase específico da raiz da soja); Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3, 1051-1061 (elemento de controle específico da raiz no gene GRP 1.8 do feijão francês); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14, 433-443 (promotor específico da raiz do gene da mano- pina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); e Miao et al. (1991) Plant Cell 3, 11-22 (i.e., um clone de cADN de comprimento total codificando a glutamina sintetase (GS) citosólica, a qual é expressa em raízes e nódulos da raiz da soja). Ver também Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2, 633-641, on- de dois promotores específicos da raiz isolados de genes de hemoblobina da não leguminosa fixadora de nitrogênio Parasponia andersonii e a não leguminosa não fixadora de nitrogênio relacionada Trema tomentosa são descritos. Os promotores destes genes foram ligados a um gene repórter de 13- glucuronidase e introduzidos em ambas a não leguminosa Nicotiana taba- cum e a leguminosa Lotus corniculatus, e em ambos os casos a atividade do promotor específico da raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem a sua análise dos promotores dos genes indutores da raiz roIC e roID altamente expressos de Agrobacterium rhizogenes. Ver Plant Science (Limerick) 79, 69-76. Eles concluíram que o intensificador e os determinantes de ADN preferenciais de tecidos estão dissociados nesses promotores. Teen et al. (1989) usaram fusão gênica com lacZ para mostrar que o gene de T-ADN de Agrobacterium codificando a octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta da raiz e que o gene TR2‘ é específico da raiz na planta intacta e estimulado por lesão no tecido da folha, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene inseticida ou larvicida. Ver EMBO J. 8 343-350. O gene TR1', fundido com nptll (neomici- na fosfotransferase II), mostrou características similares. Promotores preferenciais da raiz adicionais incluem o promotor do gene VfENOD-GRP3 e o promotor roIB. Ver também Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29, 759-772; Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25, 681-691. Ver também Patentes dos E.U.A. Números 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732; e 5,023,179. O gene da faseolina é descrito por Murai et al. (1983) Science 23, 476-482, e Sengopta-Gopalen et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3320-3324.

Em alguns aspetos, será benéfico expressar siRNAs da invenção usando um promotor induzível, tal como de um promotor induzível por praga ou patógeno. Tais promotores incluem aqueles de proteínas relacionadas com patogênese (proteínas PR), as quais são induzidas após infeção por um paógeno; e.g., proteínas PR, proteínas SAR, β-1,3-glucanase, chitinase, etc. Ver, e.g., Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4, 645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4, 111-116. Ver também Publicação Internacional da PCT No. WO 99/43819.

Os promotores que são expressos localmente no ou próximo do local de infeção pela praga são particularmente de interesse. Ver, e.g., Mari- neau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9,335-342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2427- 2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2, 93-98; e Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14972-14977. Ver também, Chen et al. (1996) Plant J. 10, 955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2507-2511; WRNAer et al. (1993) Plant J. 3, 191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1, 961-968; Patente dos E.U.A. No. 5,750,386 (induzíveis por nematódeo); Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant. Path. 41, 189-200, e as referências citadas aí.

Adicionalmente, como as pragas ou os patógenos entram nas plantas hospedeiras através de lesões ou danos por insetos, pode ser usado um promotor induzível por lesões nos construtos da invenção. Tais promotores induzíveis por lesões incluem o gene inibidor da proteinase da batata (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28, 425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotech. 14, 494-498); wun1 e wun2, Patente dos E.U.A. No. 5,428,148; winl e wing (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215, 200208); sistemina (McGurl et al. (1992) Science 225, 1570- 1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22, 783- 792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Lett. 323, 73-76); e o gene MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6, 141-150). O acúmulo da proteína inibidora da metalocarboxipeptidase foi registado em folhas de plantas da batata lesadas (Graham et al. (1981) Biochem. Biophys. Res. Comm. 101, 1164-1170). Outros estudos focaram-se em genes induzivelmente regulados em resposta a stress ou estímulos ambientais tais como salinidade, seca, e lesões pelo patógeno crescentes (Graham et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6555-6560; Graham et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6561-6564; Smith et al. (1986) Planta 168, 94-100). Outros genes da planta podem ser induzidos por jasmonato de metila, indutores, choque térmico, stress anaeróbico, ou agentes de proteção herbicidas.

As Patentes dos E.U.A. Números 5,589,622 e 5,824,876 descre- vem a identificação de genes de planta expressos especificamente no ou adjacentes ao local de alimentação da planta após anexação por um nema- tódeo. Os promotores destes genes alvo de plantas podem ser então usados para direcionar a expressão específica de amiRNA prejudicial para o gene alvo da praga.

Adicionalmente aos promotores identificados acima, as Publicações de Aplicação de Patentes dos E.U.A. Números 2004/0016025, 2007/0056055, 2008/0120750, 2009/0183283, e as Patentes dos E.U.A. Números 7,550,578 e 7,615,624 descrevem uma variedade de promotores de Oryza sativa e Arabidopsis thaliana, os quais podem ser também usados para expressão de siRNAs como descrito aqui. As sequências de promotor particulares dos documentos de patente ainda agora nomeados, e a divulgação no que concerne o uso de tais promotores, são incorporadas por referência aqui.

Promotores regulados por químicos podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível por químicos, onde a aplicação do químico induz a expressão gênica, ou um promotor repressível por químicos, onde a aplicação do químico reprime a expressão gênica. Promotores induzíveis por químicos são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados ao promotor In2-2 do milho, o qual é ativado por agentes de proteção herbicidas de benzenossulfonamida, o promotor GST do milho, o qual é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré- emergentes, e o promotor PR-1 do tabaco, o qual é ativado pelo ácido salicí- lico. Outros promotores regulados por químicos de interesse incluem promotores suscetíveis a esteroides (ver, e.g., o promotor induzível por glucocorti- coide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14, 247-257) e promotores induzíveis pela te- traciclina e repressíveis pela tetraciclina (ver, e.g., Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 229-237, e as Patentes dos E.U.A. Números 5,814,618 e 5,789,156.

Alguns promotores adequados iniciam a transcrição somente, ou predominantemente, em certos tipos de células. Assim, como usado aqui, um promotor preferencial de tipo de célula ou de tecido é um que dirige a expressão preferencialmente no tecido alvo, mas pode também levar a alguma expressão em outros tipos de célula ou tecidos igualmente. Entende- se que alguns promotores que mostram direcionamento particular da expressão em tecidos alvo podem também inibir a expressão "vazante" em tecidos alvo não preferenciais. Um exemplo pode ser um promotor cujo perfil de expressão mostra expressão preferencial em sementes de milho, no entanto também exibe expressão forte em tecido de folhas maduras. Métodos para identificação e caracterização de regiões promotoras em ADN genômi- co de planta incluem, no entanto, aqueles descritos nas seguintes referências: Jordano et al. (1989) Plant Cell 1, 855-866; Bustos et al. (1989) Plant Cell 1, 839-854; Green et al. (1988) EMBO J. 7, 4035-4044; Meier et al. (1991) Plant Cell 3, 309-316; e Zhang et al. (1996) Plant Physiol. 110, 10691079.

Promotores ativos em tecido fotossintético de modo a dirigir a transcrição em tecidos verdes tais como folhas e hastes são de interesse particular para a presente invenção. Os mais adequados são promotores que dirigem a expressão somente ou predominantemente em tais tecidos. O promotor pode conferir expressão constitutivamente ao longo da planta, ou diferencialmente no que diz respeito aos tecidos verdes, ou diferencialmente no que diz respeito à fase de desenvolvimento do tecido verde no qual a expressão ocorre, ou em resposta a estímulos externos. Exemplos de tais promotores incluem os promotores da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (RbcS) tais como o promotor RbcS do lariço de leste (Larix laricina), o promotor cab6 do pinheiro (Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35, 773778), o promotor do gene Cab-1 do trigo (Fejes et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15, 921-932), o promotor Cab-1 do espinafre (Lubberstedt et al. (1994) Plant Physiol. 104, 997-1006), o promotor cab1R do arroz (Luan et al. (1992) Plant Cell 4, 971-981), o promotor da piruvato ortofosfato dicinase (PPDK) do mi-lho (Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9586-9590), o

promotor Lhcb1*2 do tabaco (Cerdan et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33, 245255), o promotor do simporte sacarose-H+ SUC2 de Arabidopsis thaliana (Truernit et al. (1995) Planta 196, 564-570), e promotores das proteínas da membrana tilacoide do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS. Outros promotores que dirigem a transcrição em hastes, folhas, e tecido verde são descritos na Publicação de Patente dos E.U.A. No. 2007/0006346.

Qualquer um dos promotores acima descritos, ou outros promotores conhecidos, pode ser usado para expressar os siRNAs da invenção. Um perito na técnica é prontamente capaz de selecionar um promotor apropriado para uma aplicação particular.

Os construtos e vetores de expressão da invenção podem ser usados para preparar composições para conferição de traços a um organismo-alvo ou hospedeiro, como descrito aqui abaixo. Em um aspeto da invenção, uma tal composição é uma composição nematicida compreendendo um siRNA compreendendo os nucleotídeos 2-8 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-14, por exemplo, uma siRNA compreendendo a sequência estabelecida nas SEQ ID NOs: 1-14. As composições para conferição de traços podem também incluir um ou mais siRNAs.

Organismos-Alvo Um organismo-alvo é um organismo no qual os siRNAs da invenção se destinam a ser funcionais, i.e., a mediarem o silenciamento ou supressão gênica. Em um aspeto da invenção, o organismo-alvo é também um organismo hospedeiro, como descrito aqui abaixo. Em outros aspetos da invenção, um organismo-alvo está separado e é distinto de um organismo hospedeiro que serve como uma fonte do siRNA a ser funcional no organismo-alvo.

Os termos "direcionamento" ou "alvo(s)", como usados aqui, referem-se à capacidade das moléculas de siRNA em formarem pares de bases com uma molécula de mRNA complementar em um organismo particular para resultar desse modo silenciamento ou supressão gênica. Um tal organismo é referido como o organismo-alvo. Um "ácido nucleico alvo" ou "se quência alvo" é uma sequência ou molécula de ácido nucleico de ou em um organismo-alvo. Sequência alvo também implica uma sequência de ácido nucleico que é selecionada para supressão e não está limitada a polipépti- dos codificando polinucleotídeos. A sequência alvo compreende tipicamente uma sequência que é substancialmente ou completamente complementar com o siRNA. A sequência alvo inclui, mas não está limitada a, RNA, ADN, ou outro polinucleótido compreendendo a sequência alvo.

Em um aspeto da invenção, "organismos-alvo" são pragas ou patógenos de plantas cujos danos à planta podem ser reduzidos ou eliminados de acordo com a invenção. Pragas e patógenos de plantas representativos incluem insetos, nematódeos, fungos, bactérias, vírus, e plantas parasí- ticas tais como estriga, cuscuta e visco. Pragas de insetos que podem ser direcionadas de acordo com a invenção incluem sem limitação insetos mas- tigadores, sugadores, e broqueadores que pertencem, por exemplos às Ordens não limitantes Coleoptera, Diptera, Hemiptera, Heteroptera, Homopte- ra, Hymenoptera, Lepidoptera, e Orthoptera. Exemplos não limitantes de tais pragas de insetos são mostrados na Tabela 1. Exemplos não limitantes de nematódeos que podem ser direcionados de acordo com a invenção incluem aqueles estabelecidos na Tabela 2. Exemplos não limitantes de fungos, míldios, e bolores que podem ser direcionados de acordo com a invenção incluem aqueles estabelecidos na Tabela 3. Exemplos não limitantes de bactérias são mostrados na Tabela 4. Exemplos não limitantes de vírus de plantas que podem ser direcionados são mostrados na Tabela 5.

Um "organismo(s) não alvo", como usado aqui, é/são qual- quer(quaisquer) organismo(s) sem ser o(s) organismo(s)-alvo. Onde o orga-nismo-alvo e o organismo hospedeiro diferem, um organismo não alvo pode compreender um organismo hospedeiro e organismos que consomem o or- 5 ganismo hospedeiro ou de outro modo contactam com os siRNAs expressos em um organismo hospedeiro. O desenho específico dos alvos dos siRNAs, como descrito aqui, proporciona que tais siRNAs tenham pouca ou nenhuma atividade de silenciamento gênico em organismos não alvo.

Organismos Hospedeiros 10 Um "hospedeiro" ou "organismo hospedeiro" como usado aqui refere-se a um organismo que expressa ou produz siRNA. O organismo hospedeiro pode expressar o siRNA transientemente ou estavelmente. O organismo hospedeiro pode ser um organismo transgênico. Em um aspeto da invenção, um organismo hospedeiro é o mesmo do que um organismo- 15 alvo, i.e., o siRNA é expresso no mesmo organismo no qual ele se destina a ser funcional. Em outro aspeto da invenção, o organismo serve como um transportador do siRNA ao organismo-alvo. Como um exemplo não limitante, um organismo hospedeiro é uma planta, em que o organismo-alvo é uma praga ou patógeno da planta. Em outro exemplo, o organismo hospedeiro pode ser uma fonte de alimentos para um organismo-alvo.

Um "ácido nucleico hospedeiro" é um ácido nucleico de ou em um organismo hospedeiro, por exemplo, um ácido nucleico de ou em uma planta ou parte da planta.

O termo "expressão", como usado aqui no que diz respeito ao siRNA ou ao miRNA, refere-se à transcrição de uma sequência de nucleotí- deos de siRNA/miRNA dirigida pelo seu promotor. Expressão como usada aqui também inclui a produção de siRNAs ou miRNAs a partir de transcritos de RNA maiores. Como tal, um organismo hospedeiro pode expressar um RNA que seja processado para produzir ou expressar um ou mais siRNAs ou miRNAs.

Plantas úteis como organismos hospedeiros incluem qualquer um dos vários organismos multicelulares, eucarióticos, fotossintéticos do reino Plantae, incluindo ambas as monocots e as dicots. O termo "planta" inclui referência a plantas inteiras, partes de plantas, órgãos de plantas, teci-dos de plantas, células de plantas, sementes, e descendência dos mesmos. Células de plantas incluem, sem limitação, células de sementes, culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, e micrósporos. Planta também se refere a plantas ou a partes de plantas que expressam estavelmente ou transientemente um produto gênico, incluindo um siRNA.

Uma "parte da planta" é qualquer porção independentemente se está isolada ou anexada a uma planta intacta. A frase "parte da planta" inclui tecidos diferenciados e não diferenciados incluindo, mas não se limitando às seguintes: raízes, caules, brotos, folhas, pólen, sementes, tecido de tumor, e várias formas de células e culturas (e.g., células únicas, protoplastos, embri-ões, e tecido caloso). O tecido de planta pode estar em uma planta ou em um órgão, tecido, ou cultura celular da planta. Partes da planta também in- cluem produtos da planta, tais como grãos, sementes, frutos, e nozes ou produtos de base.

Um "produto da planta" refere-se a um produto agrícola ou co-mercial criado a partir de uma planta, parte da planta, ou semente. Exemplos não limitantes de produtos de planta incluem flores, folhas, vinhas, talos, fru-tos, legumes, cucurbitáceas, raízes, tubérculos, cones, vagens, sementes, feijões, grãos, miolos, e cascos.

Alguns produtos da planta são processados e tornam-se assim "produtos de base". Como usado aqui, "produtos de base" incluem, mas não estão limitados a, sementes inteiras ou processadas, feijões, grãos, miolos, cascos, papas, areias, farinhas, açúcares, amidos, concentrados de proteína, proteína, lípidos, carboidratos, ácidos nucleicos, metabolitos, clorofilas, ceras, óleos, extratos, sucos, concentrados, líquidos, xaropes, ração, forragem, fibra, madeira, polpa, papel, pigmentos, produtos naturais, toxinas, e outros alimentos ou produtos produzidos das plantas.

Produtos de base contendo uma ou mais das sequências de nu- cleotídeos da invenção, ou produzidos a partir de uma planta transformada, planta recombinante, ou semente contendo uma ou mais das sequências de nucleotídeos da invenção estão especificamente contemplados como aspe-tos da invenção como um meio de identificação ou deteção da fonte do pro-duto da planta ou de base. Tais aspetos são referidos aqui como "amostras biológicas". A identificação ou deteção de uma ou mais das sequências de nucleotídeos da invenção em um ou mais amostras biológicas é evidência de facto de que o produto de planta ou produto de base compreende uma planta ou parte de uma planta da invenção descrita aqui.

Como usado aqui, "uma sequência de nucleotídeos da invenção" compreende os siRNAs, miRNAs, ou seus construtos como divulgado aqui. Tais sequências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas para identificar plantas, produtos de planta, ou produtos de base contendo uma ou mais das sequências de nucleotídeos da invenção usando qualquer número de técnicas conhecidas daqueles peritos na técnica tal como através de métodos baseados em RCP, transferência de southern, transferência de nor thern, ou análises de micromatrizes. Em este aspeto particular, a funcionali-dade da sequência de nucleotídeos da invenção (i.e., siRNA ou miRNA) é imaterial e a presença da sequência de nucleotídeos na planta ou do produto de planta serve para identificar ou detetar especificamente a fonte da parte da planta, produto da planta, ou produto de base.

Plantas hospedeiras representativas incluem soja (Glycine max), milho (Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), alfalfa (Me- dicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girassol (Helianthus annuus), trigo (Tri- ticum aestivum), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatas), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea ssp.), coco (Cocos nucifera), ananás (Ananas comosus), árvores de citronos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus carica), goiaba (Psidium gua- java), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidental), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterrabas açucareiras (Beta vulgaris), aveias, cevada, legumes, plantas ornamentais, e coníferas.

Plantas hospedeiras adicionais da invenção são culturas de plantas, por exemplo, cereais e leguminosas, milho, trigo, batatas, tapioca, arroz, sorgo, painço, mandioca, cevada, ervilha, e outras culturas de raízes, tubérculos, ou sementes. Culturas de sementes importantes para a invenção são colza oleaginosa, beterraba açucareira, milho, girassol, soja, e sorgo. Plantas hortícolas às quais a invenção pode ser aplicada podem incluir alfa-ce, endívia, e brassica vegetal incluindo couve, brócolo, e couve-flor, e cra-vos, gerânios, petúnias, e begônias. A invenção pode ser aplicada a tabaco, cucurbitáceas, cenoura, morango, girassol, tomate, pimenta, crisântemo, álamo, eucalipto, e pinheiro. Opcionalmente, as plantas da invenção incluem sementes de grão, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. Opcionalmente, as plantas da invenção incluem plantas oleaginosas. Plantas oleaginosas incluem canola, algodão, soja, cártamo, girassol, brassica, mi- lho, alfalfa, palma, coco, etc. Opcionalmente, as plantas da invenção incluem plantas leguminosas. As plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, alfarroba, feno-grego, soja, feijão jardim, feijão-frade, feijão-mungo, feijão-fava, lentilhas, grão-de-bico, etc. Plantas hospedeiras úteis na invenção são culturas em fileira e culturas de disseminação. Exem-plos não limitantes de culturas em fileira são milho, soja, algodão, amaranto, legumes, arroz, sorgo, trigo, milo, cevada, girassol, trigo-duro, e aveias. Exemplos não limitantes de culturas de disseminação são girassol, painço, arroz, sorgo, trigo, milo, cevada, trigo-duro, e aveias. Plantas hospedeiras úteis na invenção são monocots e dicots. Exemplos não limitantes de mono-cots úteis são arroz, milho, trigo, palmeiras, gramas, cevada, e aveias. Exemplos não limitantes de dicots úteis são soja, algodão, alfalfa, canola, linho, tomate, beterraba açucareira, girassol, batata, tabaco, milho, trigo, arroz, alface, aipo, pepino, cenoura, e couve-flor, uva, e gramas. Plantas hos-pedeiras úteis na invenção incluem plantas cultivadas para benefícios estéti-cos ou olfativos. Exemplos não limitantes incluem plantas com flores, árvo-res, ervas, plantas de sombra, e plantas ornamentais com flores e sem flores. Plantas hospedeiras úteis na invenção incluem plantas cultivadas para valor nutricional, fibras, madeira, e produtos industriais.

Um perito na técnica reconhecerá a ampla variedade de células hospedeiras que podem ser transformadas com os vetores de acordo com a invenção descrita aqui. Exemplos não limitantes de tais células são aquelas no tecido embriogênico, tecido caloso dos tipos I, II, e III, hipocótilo, meris- tema, tecido da raiz, tecidos para expressão no floema, e similares.

Quase todos os tecidos de planta podem ser transformados du-rante a desdiferenciação usando técnicas apropriadas descritas aqui. Alvos celulares recipientes incluem, mas são estão limitados a, células do meris- tema, calo do Tipo I, Tipo II, e Tipo III, embriões imaturos, e células gaméti- cas tais como micrósporos, pólen, esperma, e células do ovo. Está contemplado que qualquer célula da qual uma planta fértil possa ser regenerada é útil como uma célula recipiente. O calo de Tipo I, Tipo II, e Tipo III pode ser iniciado a partir de fontes de tecido incluindo, mas não se limitando a, embri- ões imaturos, inflorescências imaturas, meristemas apicais da plântula, mi- crósporos, e similares.

Aquelas células que são capazes de proliferação como o calo são também células recipientes para transformação genética. Técnicas para transformação de embriões imaturos e subsequente regeneração de plantas transgênicas férteis são bem conhecidas na técnica. A transformação direta de embriões imaturos obvia a necessidade do desenvolvimento a longo termo de culturas celulares recipientes. O pólen, bem como as suas células precursoras, micrósporos, podem ser capazes de funcionar como células recipientes para a transformação genética, ou como vetores para transportar ADN estranho para incorporação durante a fertilização. A transformação di-reta do pólen obvia a necessidade de cultura celular.

As células meristemáticas (i.e., células da planta capazes de di-visão celular contínua e caracterizadas por uma aparência citológica indife-renciada, encontradas normalmente em pontos ou locais de crescimento em plantas tais como pontas de raízes, ápices do caule, rebentos laterais, etc.) podem representar outro tipo de célula de planta recipiente. Devido ao seu crescimento indiferenciado e capacidade para diferenciação dos órgãos e totipotência, uma única célula meristemática transformada poderia ser recu-perada como uma planta completamente transformada. De fato, é proposto que as culturas de suspensão embriogênicas possam ser um sistema celular meristemático, retendo a capacidade de divisão celular contínua em um es-tado indiferenciado, controlado pelo ambiente do meio.

Amplas variedades de técnicas estão disponíveis para introdução de siRNAs da invenção em um organismo sob condições que permitam manutenção e expressão do siRNA estáveis. A escolha particular de uma tecnologia de transformação será determinada pela sua eficácia em trans-formar certas espécies de plantas bem como a experiência e preferência da pessoa praticando a invenção com uma metodologia particular de escolha. Será aparente à pessoa perita que a escolha particular de um sistema de transformação para introduzir ácido nucleico em células da planta não é es-sencial à ou uma limitação da invenção, nem o é a escolha da técnica para regeneração da planta.

Os protocolos de transformação bem como protocolos para in-trodução de ácidos nucleicos heterólogos em plantas podem variar depen-dendo do tipo de planta ou de célula de planta, i.e., monocot ou dicot, direci-onadas para transformação. Métodos adequados de introdução do construto de ADN incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4, 320-334; e Patente dos E.U.A. No. 6,300,543); cruzamento sexual, eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5602-5606); transformação mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Patentes dos E.U.A. Números 5,563,055 e 5,981,840); transferência gênica direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3,2717-2722); e aceleração balística de partículas (ver, e.g., Sanford et al., Patente dos E.U.A. No. 4,945,050; Tomes et al., Patente dos E.U.A. No. 5,879,918; Tomes et al., Patente dos E.U.A. No. 5,886,244; Bid- ney et al., Patente dos E.U.A. No. 5,932,782; Tomes et al. (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,” em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlim); e McCabe et al. (1988) Biotechnology 6, 923-926). Ver também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22, 421477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5, 27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87, 671-674 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P, 175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96, 319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8, 736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6, 559-563 (milho); Tomes, Patente dos E.U.A. No. 5,240,855; Buising et al., Patentes dos E.U.A. Números 5,322,783 e 5,324,646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91, 440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8, 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slog- teren et al. (1984) Nature 311, 763-764; Bowen et al., Patente dos E.U.A. No. 5,736,369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nova Iorque), pp. 197209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9, 415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84, 560-566 (transformação mediada por cristais capilares); D’Halluin et al. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505 (eletropor- ação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12, 250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75, 407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Bio-technology 14, 745-750 (milho através de Agrobacterium tumefaciens); Pa-tente dos E.U.A. No. 5,736,369 (transformação do meristema); e Patentes dos E.U.A. Nos. 5,302,523 e 5,464,765 (tecnologia de cristais cristalinos).

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser introduzidos nas plantas por contacto das plantas com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem a incorporação de um construto de ex-pressão da invenção dentro de uma molécula de ADN ou RNA viral. Adicio-nalmente, é reconhecido que os promotores úteis englobam promotores utili-zados para transcrição por polimerases de RNA virais. Métodos para intro-dução de construtos de expressão em plantas e expressão de uma proteína expressa aí, envolvendo moléculas de ADN ou RNA virais, são conhecidos na técnica. Ver, e.g., Patentes dos E.U.A. Números 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367; e 5,316,931.

Construtos de ADN contendo siRNAs podem ser integrados no genoma da célula hospedeira de acordo com métodos convencionais, e.g., por recombinação homóloga ou outros métodos de integração, incluindo in-tegração direcionada a um local cromossômico do hospedeiro particular.

Em outros aspetos da invenção, a expressão transiente pode ser desejada. Em esses casos, podem ser usadas técnicas de transformação transiente padrão, tais como métodos de transformação viral, e microinjeção de ADN ou RNA, bem como outros métodos bem conhecidos na técnica.

As células das plantas que incorporaram estavelmente a se-quência de nucleotídeos podem ser cultivadas até serem plantas de acordo com técnicas convencionais. Ver, e.g., McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84. Estas plantas podem ser então cultivadas, e polinizadas com a mesma estirpe transformada ou com estirpes diferentes, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada transmitida pela sequência de nucleotídeos de interesse e/ou os marcadores genéticos contidos no local alvo ou na cassete de transferência. Podem ser cultivadas duas ou mais gerações para assegurar que a expressão da carac-terística fenotípica desejada é estavelmente mantida e herdada, e depois as sementes são colhidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. A identificação e seleção iniciais de células e/ou plantas com-preendendo construtos de expressão de siRNA podem ser facilitadas pelo uso de genes marcadores. O direcionamento gênico pode ser realizado sem seleção se existir um método sensível para identificação de recombinantes, por exemplo se a modificação gênica direcionada puder ser facilmente dete-tada por análise de RCP, ou se resultar em um certo fenótipo. No entanto, na maioria dos casos, a identificação de eventos de direcionamento gênico será facilitada pelo uso de marcadores. Marcadores úteis incluem marcadores selecionáveis positivos e negativos bem como marcadores que facilitam o rastreio, tal como marcadores visuais. Os marcadores selecionáveis incluem genes carregando resistência a um antibiótico tal como espectomicina, (e.g., o gene aada, Svab et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14, 197); estreptomici- na, (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210, 86); canamicina (e.g., nptll, Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4803); higromicina (e.g., HPT, Vanden Elzen et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5, 299); gentamicina (Hayford et al. (1988) Plant Physiol. 86, 1216); fleomicina, zeocina, ou bleomicina (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7, 171); ou resistência a um herbicida tal como fosfinotricina (gene bar); ou sulfonilureia (acetolactato sintase (ALS)) (Charest et al. (1990) Plant Cell Rep. 8, 643); genes que preenchem um re-quisito de crescimento em um meio incompleto tal como os genes HIS3, LEU2, URA3, LYS2, e TRP1 em levedura; e outros tais genes conhecidos na técnica. Marcadores selecionáveis negativos incluem a citosina deaminase (codA) (Stougaard (1993) Plant J. 3, 755-761); tms2 (DePicker et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, 63-66); nitrato reductase (Nussame et al. (1991) Plant J. 1, 267-274), SU1 (O’Keefe et al. (1994) Plant Physiol. 105, 473-482); aux-2 do plasmídeo Ti de Agrobacterium; e timidina cinase. Marcadores rastreáveis incluem proteínas fluorescentes tais como a proteína verde fluorescente (GFP) (Chalfie et al. (1994) Science 263, 802; Patente dos E.U.A. No. 6,146,826; Patente dos E.U.A. No. 5,491,084; e Publicação Internacional da PCT No. WO 97/41228); enzimas repórter tais como 13-glucuronidase (GUS) (Jefferson R. A. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387, Patente dos E.U.A. No. 5,599,670, e Patente dos E.U.A. No. 5,432,081), 13- galactosidase (lacZ); fosfatase alcalina (AP); glutationa S-transferase (GST) e luciferase (Patente dos E.U.A. No. 5,674,713; e Ow et al. (1986) Science 234: 856-859), marcadores visuais como antocianinas tais como CRC (Ludwig et al. (1990) Science 247: 449-450) família de genes R (e.g., Lc, P, S); A, C, R-nj, genes do corpo e/ou da cor dos olhos em Drosophila, genes da cor do revestimento em sistemas mamíferos, e outros conhecidos na técnica.

Podem ser usados um ou mais marcadores de modo a selecionar e rastrear o direcionamento de um siRNA a um lócus genômico particular, o que é também referido como integração sítio-específica. Uma estratégia comum para a integração sítio-específica envolve o uso de um marcador selecionável sem promotor. Uma vez que ao marcador selecionável falta um promotor, eventos de integração aleatória não levam geralmente à transcrição do gene. Eventos de direcionamento gênico irão pôr o marcador seleci- onável sob controle de um promotor no local alvo. Eventos de direcionamento gênico são identificados por seleção da expressão do marcador selecio- nável. Outra estratégia comum utiliza um esquema de seleção positiva- negativa. Este esquema utiliza dois marcadores selecionáveis, um que con-fere resistência (R+) acoplado a um que confere sensibilidade (S+), cada um com um promotor. Quando um ácido nucleico heterólogo contendo os dois marcadores é aleatoriamente inserido, o fenótipo resultante é R+/S+. Quando um evento de direcionamento gênico é gerado, os dois marcadores não estão acoplados e o fenótipo resultante é R+/S-. Exemplos do uso de seleção positiva-negativa são encontrados em Thykjer et al. (1997) Plant Mol. Biol. 35, 523-530; e Publicação Internacional da PCT No. WO 01/66717.

Embora vários métodos de transformação sejam ensinados aqui como métodos separados, a pessoa perita irá prontamente reconhecer que certos métodos podem ser usados em combinação para intensificar a eficácia do processo de transformação. Exemplos não limitantes de tais métodos incluem o bombardeamento com micropartículas revestidas com Agrobacte-rium (EP486234) ou bombardeamento com microprojéteis para induzir a le-são seguido de cocultivo com Agrobacterium (EP486233).

Pode ser também usada distribuição direta para transformar hospedeiros de acordo com a invenção divulgada aqui. A título de exemplo não limitante, tais métodos de distribuição direta incluem tratamento com polietileno glicol, eletroporação, captação de ADN mediada por lipossomas ou o método do vórtex. Ver, e.g., Freeman et al. (1984) Plant Cell Physiol. 29, 1353 e Kindle, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1228. Uma forma de distribuição direta do ADN é a transferência gênica direta em protoplastos de culturas de suspensão de células embriogénicas. Ver Lazzeri e Lorz (1988) Advances in Cell Culture, Vol. 6, Academic Press, p. 291; OziasAkins e Lorz (1984) Trends in Biotechnology 2, 119.

A pessoa perita está ciente de certos desafios da transformação dependente do genótipo se originando do baixo potencial de regeneração dos cereais. Conformemente, em uma forma de realização da invenção, a transformação é alcançada por uma abordagem de transformação indepen-dente do genótipo baseada na via da polinização. Ohta (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 715-719. No milho, pode ser alcançada transformação genética com alta eficiência por uma mistura de pólen e ADN exógeno. Luo e Wu (1989) Plant Mol. Biol. Rep. 7, 69-77. O milho pode ser produzido por técnicas quer de polinização, quer de polinização cruzada. O milho tem flores masculinas e femininas separadas na mesma planta, localizadas no pendão e na espiga, respetivamente. A polinização natural ocorre no milho quando o vento sopra o pólen dos pendões para as sedas que se projetam dos topos das espigas.

A transformação do tomate e do melão com polinucleotídeos he- terólogos de acordo com a invenção pode ser alcançada em plantas intactas através da via da polinização. Ver Chesnokov, et al. (1999) Patente da URSS No. 1708849; Boletim das Patentes da URSS, No. 4; Chesnokov e

Korol (1993); Genetika USSR, 29, 1345-1355. Os procedimentos da trans-formação genética baseados na via da polinização-fecundação incluem: (i) emprego de uma mistura (pasta) do pólen e do ADN transformante; (ii) dis-tribuição do ADN estranho ao tubo de pólen, após polinização; e (iii) bom-bardeamento de micropartículas dos micrósporos ou grãos de pólen.

Em um aspeto da invenção, os hospedeiros da planta são trans-formados usando tecnologia de Agrobacterium (e.g., A. tumefaciens e A. rhizogenes). A transferência mediada por Agrobacterium é um sistema am-plamente aplicável para introdução de genes nas células das plantas porque o ADN pode ser introduzido em tecidos inteiros da planta, contornando desse modo a necessidade de regeneração de uma planta intacta a partir de um protoplasto. O uso de vetores de integração de plantas mediados por Agrobacterium é bem conhecido na técnica. Ver, e.g., os métodos descritos por Lloyd et al. (1986) Science 234, 464-466; Horsch et al. (1987) “Agrobac-terium-mediated transformation of plants,” Plant Biology Alan R. Liss, NI pp 317-329; e Wang (2006) Agrobacterium protocols, Vol. 2, Humana Press, Totowa NJ e Patente dos E.U.A. No. 5,563,055.

A transformação mediada por Agrobacterium pode ser eficaz-mente usada com plantas hospedeiras dicotiledóneas da invenção incluindo, a título de exemplo não limitante, Arabidopsis, milho, soja, algodão, canola, tabaco, tomate, e batata.

A transformação mediada por Agrobacterium é também aplicável a quase todas as plantas monocotiledóneas da invenção. Como exemplo não limitante, tais tecnologias de planta monocotiledónea são adaptáveis a arroz, trigo, e cevada. Ver, e.g., Hiei et al. (1994) Plant J. 6, 271-282; Zhang et al. (1997) Mol. Biotechnol. 8, 223-231; Ishida et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14, 745-750; McCormac et al. (1998) Euphytica 99, 17-25, Tingay S. et al. (1997) Plant J. 11, 1369-1376; e Patente dos E.U.A. No. 5,591,616.

A transformação mediada por Agrobacterium pode ser alcançada com protoplastos cultivados isolados ou por transformação de células ou tecido intactos. A transformação mediada por Agrobacterium em dicotiledó- neas facilita a distribuição de maiores pedaços de ácido nucleico heterólogo em comparação com outros métodos de transformação tais como bombar-deamento de partículas, eletroporação, métodos de transformação mediados por polietileno glicol, e similares. Adicionalmente, a transformação mediada por Agrobacterium parece resultar em relativamente menos rearranjos gêni- cos e mais tipicamente resulta na integração de pequenos números de có-pias de genes no cromossoma da planta.

Vetores de transformação com Agrobacterium modernos são capazes de replicação em E. Coli bem como em Agrobacterium, permitindo manipulações convenientes como descrito. Klee et al. (1987) Ann. Rev. Plant Physiology 38, 467-486. Além do mais, recentes avanços tecnológicos em vetores para transferência gênica mediada por Agrobacterium melhoraram o arranjo dos genes e dos locais de restrição nos vetores para facilitar a cons-trução de vetores capazes de expressar vários genes codificando polipépti- dos. Os vetores descritos por Horsch et al. têm regiões multiligantes conve-nientes flanqueadas por um promotor e um local de poliadenilação para ex-pressão direta de genes codificando polipéptidos inseridos e são adequados para os propósitos presentes. Horsch et al. (1987) “Agrobacterium-mediated transformation of plants,” Plant Biology Alan R. Liss, NI pp 317-329. Adicio-nalmente, pode ser usada Agrobacterium contendo genes Ti armados e de-sarmados para as transformações. Nessas estirpes de planta onde a trans-formação mediada por Agrobacterium é eficaz, é o método de escolha devido à natureza fácil e definida da transferência gênica.

Quando são usadas Agrobacteria para transformar células de planta de acordo com a invenção, os ácidos nucleicos a ser inseridos podem ser clonados em plasmídeos especiais, nomeadamente quer em um vetor intermediário, quer em um vetor binário. Os vetores intermediários podem ser integrados no plasmídeo Ti ou Ri por recombinação homóloga devido a sequências que são homólogas a sequências no T-ADN. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T- ADN. Os vetores intermediários não conseguem se replicar em Agrobacteria. O vetor intermediário pode ser transferido em Agrobacterium tumefaciens por meio de um plasmídeo ajudante (conjugação).

Os vetores binários conseguem se replicar quer em E. Coli, quer em Agrobacteria. Tais vetores podem compreender um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante, os quais são enquadrados por regiões bordejantes de T-ADN à esquerda e à direita. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobacteria. Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163, 181-187. A Agrobacterium usada como célula hospedeira pode compreender um plasmídeo carregando uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do T-ADN para a célula da planta. Pode estar contido T-ADN adicional. A bacterium assim transformada é usada para a transformação de células da planta. Explantes de plantas podem ser vantajosamente cultivados com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes para a transferência do ADN para a célula da planta. Plantas inteiras podem ser depois regeneradas a partir do material de planta infectado (por exemplo, pedaços da folha, segmentos do talo, raízes, mas também protoplastos ou células cultivadas em suspensão) em um meio adequado, o qual pode conter antibióticos oi biocidas para a seleção. As plantas assim obtidas podem ser depois testadas quanto à presença dos ácidos nucleicos inseridos.

Métodos de Conferição de Traços Desejáveis A invenção proporciona adicionalmente métodos de identificação de um siRNA que confere um resultado fenotípico desejável em um orga-nismo-alvo. Em um aspeto da invenção, o método compreende (a) contacto de um organismo-alvo com uma molécula de siRNA de uma biblioteca de siRNA como descrito aqui; e (b) correlação do tratamento com siRNA de (a) com um resultado fenotípico desejável. Por exemplo, siRNAs que confiram resistência ao nematódeo do cisto da soja foram identificados por (a) contacto do nematódeo do cisto da soja com uma molécula de siRNA de uma bibli-oteca de siRNA da invenção; e (b) correlação do tratamento com siRNA de (a) com a resistência da soja à infeção por nematódeo do cisto da soja. Ver Exemplos 2 e 4.

A frase "correlação do tratamento com siRNA" como usada aqui refere-se ao processo de medição dos efeitos do contacto de um organismo- alvo com uma molécula de siRNA e determinação se um resultado fenotípico desejável foi alcançado no organismo-alvo por meio de tal tratamento com siRNA. Em geral, a correlação de um tratamento com siRNA é medida relati-vamente a um tratamento de controle.

Por exemplo, raízes de cabeleira de soja transgênica expres-sando siRNAs foram contatadas com nematódeos do cisto da soja (NCS). O número de cistos de NCS formados em experiências biologicamente replica-das, múltiplas e independentes foi determinado e comparado com controles que não expressam os siRNAs. Foram observadas reduções estatisticamente significativas no número de cistos formados durante as experiências em comparação com controles. Consequentemente, a expressão do siRNA se correlacionou com infetividade reduzida de NCS, i.e., resistência da soja à infeção por NCS. Ver Exemplos 2 e 4.

Como usados aqui, os termos "contacto" e "administração", ou a frase "contacto com", são usados indistintamente, e referem-se a um pro-cesso pelo qual os siRNAs ou os miRNAs da invenção são distribuídos ou administrados aos organismos-alvo, de modo a inibirem a expressão de um gene nos organismos-alvo. O contacto descreve a proximidade física dos siRNAs ou dos miRNAs e do organismo-alvo tal que eles interatuem. Os siRNAs ou os miRNAs podem ser administrados ou distribuídos de qualquer número de maneiras, incluindo, mas não se limitando a, introdução direta em uma célula (i.e., intracelularmente); ou introdução extracelular em uma cavi-dade, espaço intersticial, ou na circulação do organismo-alvo, introdução oral, o siRNA ou o miRNA pode ser introduzido por banho do organismo-alvo em uma solução contendo siRNA ou miRNA, ou o siRNA ou o miRNA pode estar presente em uma fonte de alimentação. Métodos para introdução oral incluem a mistura direta do siRNA ou do miRNA com uma fonte de alimenta-ção do organismo-alvo, bem como abordagens manipuladas nas quais uma espécie que é usada como alimento é manipulada para expressar um siRNA ou um miRNA, e depois esta espécie é alimentada ao organismo-alvo a ser afetado. Por exemplo, os construtos de siRNA ou de miRNA podem ser pul-verizados sobre uma planta, ou o siRNA pode ser aplicado no solo na proxi-midade das raízes, absorvido pela planta e/ou pelo organismo-alvo, ou uma planta pode ser geneticamente manipulada para expressar o siRNA ou o miRNA em uma quantidade suficiente para matar ou afetar adversamente alguns ou todos os organismos-alvo aos quais a planta está exposta. Assim, "contacto" refere-se a qualquer processo pelo qual um siRNA ou miRNA é administrado ou distribuído a um organismo-alvo para desse modo inibir a expressão de um gene no organismo-alvo.

Como usado aqui, "contacto" refere-se também à colocação de uma praga, patógeno, ou organismo-alvo em ou próximo de uma planta hos-pedeira, ou sua parte, tal que a praga, patógeno, ou organismo-alvo tenha uma oportunidade de interatuar com, atacar, ou infetar a planta ou a parte da planta, o que efetivamente resulta em proximidade entre os siRNAs expres-sos na planta hospedeira e o organismo-alvo.

O siRNA pode ser "contatado" ou "administrado" ao alvo de qualquer maneira que resulte em proximidade física de um siRNA e um ácido nucleico alvo permitindo a interação. Em um aspeto da invenção, o siRNA pode ser expresso dentro de um organismo hospedeiro e depois se difundir passivamente ou ser ativamente transportado para um organismo-alvo. A expressão dentro do hospedeiro pode ser transiente, ou estável, e/ou induzí- vel. O siRNA pode ser expresso como um precursor ou forma inativa que se torna ativa dentro do organismo-alvo. A expressão em um hospedeiro pode ser alcançada usando qualquer um dos construtos e vetores de expressão descritos aqui.

Outros exemplos de contacto incluem, mas não se limitam a, in-trodução direta em uma célula (i.e., intracelularmente); introdução extracelu- lar em uma cavidade, espaço intersticial, ou na circulação do organismo- alvo; introdução ora; o siRNA pode ser introduzido por banho ou imersão do organismo-alvo em uma solução contendo siRNA. Métodos para introdução oral incluem a mistura direta do siRNA com alimentos de um organismo-alvo, bem como abordagens manipuladas nas quais uma espécie que é usada como alimento é manipulada para expressar um siRNA, e depois alimentado ao organismo a ser afetado.

Onde o organismo-alvo ou organismo hospedeiro é uma planta, uma composição compreendendo um siRNA pode ser pulverizada sobre a planta, ou o siRNA pode ser aplicado no solo na proximidade das raízes, absorvido pela planta e/ou pela praga ou patógeno alvo, ou uma planta pode ser modificada para expressar o siRNA.

Um organismo hospedeiro expressando um siRNA heterólogo é "transgênico". Como usado aqui, o termo "transgênico" refere-se a um orga-nismo hospedeiro, ou sua parte ou célula, que compreende dentro do seu genoma um polinucleótido heterólogo. Um organismo hospedeiro transgêni- co pode ser estavelmente transformado ou transientemente transformado. Se o siRNA heterólogo está estavelmente integrado dentro do genoma, ele é passado a, ou é herdado por, diferentes gerações. O siRNA heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de um construto de expres-são. Transgênico é usado aqui para incluir qualquer célula, linha celular, ca-lo, tecido, parte da planta ou planta, o genótipo do qual foi alterado pela pre-sença de um ácido nucleico heterólogo incluindo aqueles transgênicos inici-almente assim alterados bem como aqueles criados por melhoramento, cru-zamentos sexuais, ou propagação assexual a partir da célula transgênica inicial.

A frase "fenótipo desejável", como usada aqui, refere-se a um efeito pretendido que tenha sido induzido em um organismo-alvo e/ou orga-nismo hospedeiro como resultado do silenciamento ou supressão gênica pelo siRNA. A invenção proporciona métodos para identificação de siRNAs que conferem fenótipos desejáveis. Em um aspeto da invenção, o método compreende o desenho de siRNAs complementares aos genes alvo cuja regulação é conhecida como tendo um efeito desejável. Por exemplo, onde o organismo-alvo é uma praga ou patógeno de planta, o método pode com-preender o desenho de siRNAs complementares aos genes alvo envolvidos no desenvolvimento, sobrevivência, ou patogenicidade da praga ou patóge- no da planta. Em outro aspeto da invenção, o método compreende a identifi-cação empírica de siRNAs capazes de induzir um fenótipo desejado por ras- treio de bibliotecas de siRNA como descrito aqui. Ver Exemplos 2 e 4. Adici-onalmente, estas duas abordagens gerais podem ser combinadas.

Onde o organismo hospedeiro ou alvo é uma planta, fenótipos desejáveis incluem resistência a uma praga ou patógeno, resistência a stress abiótico, e crescimento ou rendimento melhorado. Onde o organismo hospedeiro alvo é uma praga ou patógeno de planta, fenótipos desejáveis incluem infetividade reduzida, persistência diminuída, capacidade de causar doença reduzida, ou morte da praga. "Resistência a um organismo-alvo", como usado aqui, refere-se à capacidade de um organismo-alvo em resistir à ou reduzir a gravidade do destresse, infeções, ou doença da praga ou do patógeno. A resistência pode ser medida pela capacidade do hospedeiro em sobreviver a infeção da praga, suscetibilidade da praga reduzida, carga da praga reduzida, rendimentos aumentados, desgaste ou morte diminuída, ou outros indicadores agronômi-cos adequados.

Como usadas aqui, as frases "estresse abiótico", "estresse", ou "condição de estresse" referem-se à exposição de uma planta, parte da plan-ta, célula da planta, ou similares, a um stress físico não vivo, i.e., abiótico, agentes químicos, ou condições ambientais que possam produzir efeitos adversos no metabolismo, crescimento, desenvolvimento, propagação, e/ou sobrevivência da planta (coletivamente "crescimento"). O estresse abiótico pode ser imposto a uma planta, por exemplo, devido a fatores ambientais tais como água (e.g., inundação, seca, e desidratação), condições anaeróbi- cas (e.g., um baixo nível de oxigênio), condições osmóticas, salinidade ou temperatura anormais (e.g., quente/aquecimento, frio, congelação, geada), uma deficiência de nutrientes, exposição a poluentes, ou por uma exposição a hormônio, segundo mensageiro ou outra molécula. O estresse anaeróbico, por exemplo, é devido a uma redução nos níveis de oxigênio (hipoxia ou anoxia) suficiente para produzir uma resposta de estresse. Um estresse por inundação pode ser devido a imersão prolongada ou transiente de uma plan-ta, parte da planta, tecido, ou célula isolada em um meio líquido tal como ocorrer durante uma monção, estação molhada, inundação flash, ou irrigação excessiva de plantas, ou similares. Um estresse por frio ou estresse por calor pode ocorrer devido a uma diminuição ou aumento, respetivamente, na temperatura da gama ótima de temperaturas de crescimento para uma es-pécie de planta particular. Tais gamas de temperaturas de crescimento ótimas são prontamente determinadas ou conhecidas daqueles peritos na técnica. O estresse por desidratação pode ser induzido pela perda de água, turgor reduzido, ou conteúdo de água reduzido de uma célula, tecido, órgão, parte da planta, ou planta inteira. O estresse por seca pode ser induzido pela ou associado à privação de água ou fornecimento reduzido de água a uma célula, tecido, órgão, ou organismo. O estresse induzido pela salinidade (i.e., estresse por sal) pode estar associado a ou induzido por uma perturbação no potencial osmótico do ambiente intracelular ou extracelular de uma célula.

Como usado aqui, “resistência ao estresse abiótico”, ou “tolerân-cia ao estresse abiótico” inclui, mas não está limitada a, maior otimização da água; maior tolerância à desidratação, condições de défice de água, ou seca; melhor recuperação da desidratação, condições de défice de água, ou seca; crescimento das raízes aumentado; formação de raízes laterais aumentada; ramificação de raízes aumentada; área superficial das raízes aumentada; massa das raízes aumentada; mais pelos das raízes; captação de nutrientes aumentada; captação de micronutrientes aumentada; eficiência metabólica aumentada; maior capacidade fotossintética; taxa de crescimento mais rápida; maior rendimento de flores ou sementes; arquitetura da planta modificada; resistência a herbicidas intensificada; altura reduzida ou aumen-tada; ramificação reduzida ou aumentada; tolerância ao frio e à geada inten-sificada; vigor melhorado; cor intensificada; saúde e características nutricio-nais intensificadas; armazenamento melhorado; rendimento intensificado; tolerância ao sal intensificada; resistência intensificada da madeira ou tecido de planta ao decaimento; tolerância a metais pesados intensificada; doçura intensificada; textura melhorada; conteúdo de fosfatos diminuído; germina-ção aumentada; composição em amido melhorada; longevidade da flor me-lhorada; produção de resinas novas; produção de proteínas ou péptidos no-vos; traços agronômicos intensificados, ou quaisquer outros traços ou carac-terísticas agronomicamente desejáveis ou comercialmente vantajosos.

A pessoa perita pode prontamente identificar genes da praga ou do patógeno para direcionar usando a invenção divulgada aqui. Um tal gene alvo poderia ser qualquer gene da praga que tenha um papel direto ou indireto em tais efeitos deletérios da praga em uma planta hospedeira. A título de exemplo somente, um tal gene pode ser um que tenha um papel no crescimento, desenvolvimento, replicação e reprodução, e invasão ou infeção da praga.

Genes alvo para uso na invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham papeis importantes na viabilidade, crescimento, desenvolvimento, reprodução e infetividade de uma praga particular. Estes genes alvo podem ser um ou mais de quaisquer genes constitutivos, fatores de transcrição, ou genes específicos da praga ou patógeno que proporcio-nam uma fenótipo observável, em particular um fenótipo que resulta na su-pressão da resposta a estímulos, movimento, alimentação, crescimento, de-senvolvimento, reprodução, e infetividade ou eventualmente resulta na morte da praga ou patógeno.

Os genes alvos da supressão podem também incluir aqueles re-queridos para funções essenciais tais como replicação do ADN, transcrição do RNA, síntese de proteínas, biossíntese de aminoácidos, degradação de aminoácidos, síntese de nucleotídeos, degradação de nucleotídeos, forma-ção de músculo, formação do hormônio juvenil, regulação do hormônio juve-nil, regulação e transporte de íons, síntese de enzimas digestivas, manuten-ção do potencial de membrana da célula, formação de esperma, síntese de feromônios, sensoriamento de feromônios, formação de antenas, formação de asas, formação de pernas, formação de ovos, maturação larval, formação de enzimas digestivas, síntese de hemolinfas, manutenção de hemolinfas, neurotransmissão, divisão celular, metabolismo energético, desenvolvimento e diferenciação, respiração, e apoptose.

Por exemplo, os genes alvo que se presumem ser eficazes na produção de tais fenótipos são similares àqueles que se mostrou como afe-tando a viabilidade, crescimento, desenvolvimento, mobilidade, estimulação neurológica, função muscular, e reprodução em C. elegans, incluindo mas não se limitando aos seguintes fenótipos: (Adl) adulto letal, (Age), (Bli) com bolhas, (Bmd) defeito na morfologia corporal, (Ced) Anormalidade da morte celular, (Clr) límpido, (Daf) Formação de DAuer, (Dpy) atarracado, (Egl) de-feito na postura de ovos, (Emb) embriônico letal, (Evl) vulva evertida, (Fem) feminização dos animais XX e XO, (Fgc) Menos Células Germinativas, (Fog) feminização da linha germinativa, (Gon) Desenvolvimento anormal dos GÔNadas, (Gro) crescimento lento, (Him) elevada incidência de descendên-cia masculina, (Hya) HIperAtivo, (Let) larval letal, (Lin) linhagem anormal, (Lon) corpo longo, (Lpd), (Lva) impedimento larval, (Lvl) larval letal, (Mab) Masculino anormal , (Mei) Meiose Defeituosa, (Mig) MIGração de células anormal, (Mlt) defeito de muda, (Morphology), (Mut) Mutante, (Muv) MUlti-Vulva, (Oma) Maturação de oócitos defeituosa, (Pat) Paralisado, Elongação impedida em Duas vezes, (Pch) Coloração irregular, (Pnm) Alteração da mi-gração pronuclear no embrião precoce, (Prl) paralisado, (Prz) PaRaLisado, (Pvl) vulva saliente, (Pvu) vulva saliente, (Rde), (Reprodutivo), (Rol) rolo, (Rot) par do centrossoma e rotação pronuclear associada anormal, (Rup) explodida, (Sck) doente, (Sle) Desenvolvimento embriônico lento, (Slu) lento, (Sma) pequeno, (Spd) Fuso, embriônico anormal, (Spo) Posição e orientação do fuso embriônico anormal, (Step) estéril, (Stp) descendência estéril, (Unc) descoordenado, (Unclassified), (Vul) sem vulva, (WT), (defeito) defeitos morfológicos ou comportamentais.

Como exemplos adicionais, genes alvo potenciais de Coleoptera incluem: canais de cloreto dependentes de inchaço; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; glucose-6-fosfato 1-desidrogenase; chitinase; subunidade 1 da ATPase vacuolar D; fator da ADP-ribosilação; esterase do hormônio ju-venil; fator de transcrição IIB; proteína citosólica de ligação ao hormônio ju-venil; ortólogos da actina; chitinase; α-tubulina; subunidade 2 da ATPase vacuolar A; ATPase vacuolar E; cadeia A da ATP sintase; endoglucanase; ADP/ATP translocase; fator de transcrição ativante; enzima de encapsulação do mRNA; ATPase2 da maçã; proteína ribossomal L9; proteína ribossomal L19; subunidade reguladora p28 do proteossoma 26S; proteína de ligação helicase-ADN do cromodomínio; e β-tubulina. Ver Patente dos E.U.A. No. 7,812,219 e Baum et al. (2007) Nat. Biotech. 25, 1322-1326, incluindo a Ta- bela 1 na informação suplementar, todos os quais são incorporados por refe-rência aqui na sua totalidade.

Genes alvo adicionais codificam vários produtos gênicos que, quando interrompidos, exercem um efeito negativo ou fenótipo observável 5 em Drosophila ou em C. elegans. Genes alvo adicionais em vários organismos estão listados na

A invenção proporciona adicionalmente uma molécula de siRNA que se direciona a um gene de nematódeo, tal como um gene do nematódeo do cisto da soja, e a um gene da planta endógeno relacionado com um fenó- tipo da planta resistente ao nematódeo. Em uma forma de realização, a mo-lécula de siRNA é capaz de suprimir a expressão do gene do nematódeo e do gene da planta endógeno. Em outra forma de realização, o siRNA quando expresso em uma planta transgênica, ou sua parte, confere à planta, ou à sua parte, um nível de tolerância à infeção por nematódeo que é maior do que seria expetável da supressão do gene de nematódeo ou do gene da planta endógeno sozinho. Ainda em outra forma de realização, o gene da planta endógeno é um gene de resposta ao etileno. Em particular, os siRNAs desenhados para se direcionarem aos genes de nematódeo que são também capazes de modular o silenciamento gênico dos ácidos nucleicos da resposta ao etileno (ETR), tais como ETR1, EIN1, QITR, Q8, TETR, TGETR1, TGETR2 e similares estão englobados pela invenção.

Um número de genes de resposta ao etileno foi caracterizado. O gene ETR1 de Arabidopsis, bem como outros homólogos de planta de ETR1 e ETR2, são considerados como sendo recetores do etileno. (ver, e.g., Gamble et al. (1998) PNAS USA 95, 7825-7829). A proteína ETR1 de Arabi- dopsis contém uma metade amino-terminal com um domínio hidrofóbico responsável pela ligação ao etileno e a localização da membrana (Gamble et al. supra). A metade carboxil-terminal da ETR1 de Arabidopsis contém um domínio com homologia a histidina cinases e reguladores da resposta (Gamble et al., supra).

A produção de etileno em plantas está envolvida na resposta de uma planta a múltiplos estresses bióticos e abióticos. Plantas carregando mutações nos genes ETR foram estudadas. Por exemplo, descobriu-se que plantas de soja insensíveis ao etileno com mutações no gene ETR1 têm re-sistência aumentada a alguns patógenos mas resistência reduzida a outros patógenos (Hoffman et al., (1999) Plant Physiology 119, 935-949). Adicio- nalmente, a alteração na sensibilidade ao etileno na soja tem sido implicada na tolerância ao nematódeo do cisto da soja (Bent et al. 2006. Crop Science 46:893-901).

Em outra forma de realização, o gene ETR1 da invenção é um ETR1 de soja. Em outra forma de realização, o gene ETR1 da soja compre-ende a SEQ ID NO: 52, ou um seu complemento.

Em outra forma de realização, a molécula de siRNA que se dire-ciona a um gene do nematódeo do cisto da soja e a um gene ETR1 da soja compreende a SEQ ID NO: 3 (siRNA0097) ou a SEQ ID NO: 4 (siR- NA00145). Em ainda outra forma de realização, a fita asterisco do siRNA direciona-se ao ETR1 e compreende a SEQ ID NO: 55 (siRNA0097*) ou a SEQ ID NO: 56 (siRNA0145*). Em ainda outra forma de realização, a porção de mRNA do gene ETR1 da soja que se liga ao siRNA0097 (SEQ ID NO: 3) e ao siRNA0145 (SEQ ID NO: 4) compreende a SEQ ID NO: 53. Em ainda outra forma de realização, a porção de mRNA do gene ETR1 da soja que se liga ao siRNA0097* (SEQ ID NO: 55) e ao siRNA0145* (SEQ ID NO: 56) compreende a SEQ ID NO: 54.

Em outra forma de realização, a invenção engloba uma molécula de siRNA desenhada para se direcionar a um gene de uma praga de planta do nematódeo que quando contatada com a praga de nematódeo, a praga de nematódeo tem capacidade diminuída para infetar uma planta suscetível à infeção pelo nematódeo, e em que o siRNA, quando expresso na planta, suprime a expressão de um gene da planta endógeno, em que a supressão do gene da planta confere à planta resistência à praga de planta do nemató- deo. Em outra forma de realização, o gene da planta endógeno é um gene de resposta ao etileno. Ainda em outra forma de realização, o gene de resposta ao etileno é um gene ETR1 de soja. Em outra forma de realização, o gene ETR1 da soja compreende a SEQ ID NO: 52. Em outra forma de realização, o nematódeo da praga é o nematódeo do cisto da soja. Ainda em outra forma de realização, o siRNA é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NO: 3 (siRNA0097), na SEQ ID NO: 4 (siRNA0145), na SEQ ID NO: 55 (siRNA0097*) e na SEQ ID NO: 56 (siRNA0145*). Ainda em outra forma de realização, o nível de expressão do gene ETR1 na planta transgênica é suprimido em pelo menos cerca de 30% em comparação com uma planta de tipo selvagem da mesma espécie.

Em outra forma de realização, a invenção engloba uma molécula de siRNA desenhada para se direcionar a um gene de uma praga de planta do nematódeo, em que a molécula de siRNA é capaz de suprimir a expressão do gene de nematódeo e um gene da planta endógeno, onde a supressão do gene do nematódeo e do gene da da planta endógeno confere a uma planta transgênica ou à sua parte expressando a molécula de siRNA resistência ao nematódeo. Em outra forma de realização, o gene da planta endógeno é um gene de resposta ao etileno. Em ainda outra forma de realização, a planta transgênica ou sua parte é uma planta de soja ou sua parte. Ainda em outra forma de realização, o gene de resposta ao etileno é um gene ETR1 de soja. Em outra forma de realização, o gene ETR1 da soja compreende a SEQ ID NO: 52. Em outra forma de realização, o nematódeo é o ne- matódeo do cisto da soja. Ainda em outra forma de realização, o siRNA é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NO: 3 (siRNA0097), na SEQ ID NO: 4 (siRNA0145), na SEQ ID NO: 55 (siRNA0097*) e na SEQ ID NO: 56 (siRNA0145*). Ainda em outra forma de realização, o nível de expressão do gene ETR1 na planta transgênica ou sua parte é suprimido em pelo menos cerca de 30% em comparação com uma planta não transgênica ou sua parte da mesma espécie.

Em uma forma de realização, a invenção proporciona uma planta transgênica, ou sua parte, tendo um nível reduzido de expressão de um gene de resposta ao etileno comparado com uma planta não transgênica, ou sua parte, da mesma espécie, em que a planta transgênica ou sua parte compreende um siRNA que suprime a expressão de um gene da praga de nematódeo de praga, e em que a planta transgênica tem uma maior tolerância à infeção pela praga de nematódeo do que seria expetável a partir do nível de expressão reduzido do gene de resposta ao etileno ou a supressão do gene de nematódeo sozinho. Em outra forma de realização, a planta transgênica é uma planta de soja. Em outra forma de realização, o gene de resposta ao etileno é um gene ETR1 de soja. Em outra forma de realização, o gene ETR1 compreende a SEQ ID NO: 52. Em outra forma de realização, o nematódeo da praga é o nematódeo do cisto da soja. Ainda em outra forma de realização, o siRNA é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NO: 3 (siRNA0097), na SEQ ID NO: 4 (siRNA0145), na SEQ ID NO: 55 (siRNA0097*) e na SEQ ID NO: 56 (siRNA0145*). Ainda em outra forma de realização, o nível de expressão do gene ETR1 na planta transgênica é reduzido em pelo menos cerca de 30%. Em ainda outra forma de realização, a maior tolerância à infeção pelo nematódeo do cisto da soja é medida pelo número de cistos nas raízes da soja. Em outra forma de realização, o número de cistos nas raízes é reduzido em pelo menos cerca de 52%.

Em uma forma de realização, a invenção engloba um método de conferição de resistência a praga de nematódeo a uma planta, ou sua parte, compreendendo a expressão na planta ou sua parte de uma molécula de ácido nucleico compreendendo um siRNA que suprime a expressão de um gene da praga de nematódeo, e em que a planta ou sua parte é insensível ao etileno, onde a planta ou sua parte é resistente à praga de nematódeo em um maior grau do que seria expetável a partir do siRNA ou da insensibilidade ao etileno sozinho. Em outra forma de realização, a planta ou sua parte é uma planta de soja. Em outra forma de realização, a insensibilidade ao etile- no é devida à supressão de um gene ETR1 (gene de resposta ao etileno). Em outra forma de realização, o gene ETR1 compreende a SEQ ID NO: 52. Em outra forma de realização, a praga de nematódeo é o nematódeo do cisto da soja. Ainda em outra forma de realização, o siRNA é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NO: 3 (siRNA0097), na SEQ ID NO: 4 (siR- NA0145), na SEQ ID NO: 55 (siRNA0097*) e na SEQ ID NO: 56 (siR- NA0145*). Ainda em outra forma de realização, o nível de expressão do gene ETR1 na planta ou sua parte é reduzido em pelo menos cerca de 30%. Em ainda outra forma de realização, a resistência à infeção pelo nematódeo do cisto da soja é medida pelo número de cistos nas raízes da soja. Em outra forma de realização, o número de cistos nas raízes é reduzido em pelo menos cerca de 52%.

Em outra forma de realização, a invenção engloba um método de intensificação da resistência a uma planta, ou a sua parte, à infeção por um praga de nematódeos, compreendendo a introdução na planta, ou em sua parte, de um ácido nucleico compreendendo um siRNA que suprime a expressão de um gene de nematódeo de praga, reduzindo desse modo a capacidade do nematódeo em infetar a planta, ou sua parte, e em que a planta, ou sua parte, tem adicionalmente um nível de expressão de um gene de resposta ao etileno comparado com uma planta, ou sua parte, da mesma espécie sem o siRNA sozinho, onde a planta ou sua parte compreendendo o siRNA tem uma maior resistência à infeção pelo nematódeo do que seria expetável a partir da supressão do gene de nematódeo ou a supressão do gene de resposta ao etileno sozinho. Em outra forma de realização, a planta ou sua parte é uma planta de soja. Em outra forma de realização, o gene de resposta ao etileno é um gene ETR1. Em outra forma de realização, o gene ETR1 compreende a SEQ ID NO: 52. Em outra forma de realização, a praga de nematódeo é o nematódeo do cisto da soja. Ainda em outra forma de rea-lização, o siRNA é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NO: 3 (siR- NA0097), na SEQ ID NO: 4 (siRNA0145), na SEQ ID NO: 55 (siRNA0097*) e na SEQ ID NO: 56 (siRNA0145*). Ainda em outra forma de realização, o nível de expressão do gene ETR1 na planta ou sua parte é reduzido em pelo menos cerca de 30%. Em ainda outra forma de realização, a maior resistência à infeção pelo nematódeo do cisto da soja é medida pelo número de cistos nas raízes da soja. Em outra forma de realização, o número de cistos nas raízes é reduzido em pelo menos cerca de 52%.

Ainda em outra forma de realização, a invenção engloba um mé-todo de redução do desenvolvimento de cistos em raízes de soja suscetíveis a infeção pelo nematódeo do cisto da soja, compreendendo a introdução nas células de uma planta ou sua parte de uma molécula de ácido nucleico com-preendendo um siRNA que quando contatado com o nematódeo do cisto da soja faz com que o nematódeo do cisto da soja produza um número reduzido de cistos nas raízes da soja e em que a a planta de soja ou sua parte tem um nível reduzido de um gene ETR1, onde o desenvolvimento de cistos nas raízes da soja é reduzido em um maior grau do que seria expetável a partir do siRNA contactando o nematódeo do cisto da soja ou o nível reduzido de expressão do gene ETR1 sozinho. Em outra forma de realização, o gene ETR1 compreende a SEQ ID NO: 52. Ainda em outra forma de realização, o siRNA é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NO: 3 (siRNA0097), na SEQ ID NO: 4 (siRNA0145), na SEQ ID NO: 55 (siRNA0097*) e na SEQ ID NO: 56 (siRNA0145*). Ainda em outra forma de realização, o nível de expressão do gene ETR1 na planta ou sua parte é reduzido em pelo menos cerca de 30%. Em outra forma de realização, o número de cistos nas raízes é reduzido em pelo menos cerca de 52%.

EXEMPLOS

A descrição acima mencionada dos aspetos, incluindo aspetos preferenciais, da invenção foi apresentada somente com o propósito de ilus-tração e descrição e não se destina a ser exaustiva ou a limitar a invenção às formas precisas divulgadas. Numerosas modificações e suas adaptações serão aparentes àqueles peritos na técnica sem se desviando do espírito e escopo da invenção. Exemplo 1

Desenho e Construção da Biblioteca de siRNA do Nematódeo do Cisto da Soja

Foi preparada uma pequena biblioteca de pequenos RNA de in-terferência tendo uma sequência semente parcialmente randomizada para se direcionar a mRNAs de uma praga ou patógeno. O nematódeo do cisto da soja (NCS) foi escolhido como a praga alvo para teste desta biblioteca de siRNA.

Uma biblioteca de pequenos RNA de interferência com 21 nu- cleotídeos foi desenhada com uma sequência semente randomizada locali-zada nas posições 2-8 a partir da extremidade 5', e as posições 1, 9-21 foram fixadas. Uma vez que o pequeno RNA foi desenhado para se direcionar a genes do nematódeo, a sequência não semente foi baseada em microR- NAs de Caenorhabditis elegans. Análises bioinformáticas dos miRNAs de C. elegans previstos e conhecidos revelou nucleotídeos conservados em cada posição da região não semente dos miRNAs (i.e., posições 1 e 11-19). Estes nucleotídeos foram selecionados para a sequência não semente para a bi-blioteca de siRNA. Foram escolhidos resíduos de uridina para as posições 20 e 21 de modo a aumentar a estabilidade da molécula para rastreio in vitro. A sequência não semente modelo gerada a partir do miRNA de consenso de C. elegans é 5‘-UNNNNNNNUGUUGAUCUGGUU-3‘, (SEQ ID NO: 47) onde N indica um nucleótido aleatório (i.e., A, C, G, ou U) na sequência semente. Uma biblioteca de siRNA desta sequência exemplar consiste em 47 (i.e., 4 x 4 x 4 x 4 x 4 x 4 x 4) diferentes moléculas de RNA, ou 16.384 possíveis sequências.

De modo a reduzir a complexidade de uma biblioteca de RNA (i.e., o número de sequências contidas na biblioteca), um subconjunto de sequências foi excluído da biblioteca. Em particular, a complexidade da bi-blioteca de siRNA foi reduzida por exclusão computacional de nucleotídeos que ocorriam a uma posição particular em sequências semente de miRNA de C. elegans a frequências mais baixas. Neste exemplo, o limiar de frequência foi escolhido como sendo 20%. Conformemente, qualquer nucleóti- do que se determinou como ocorrendo menos do que 20% a uma posição particular em uma sequência semente de C. elegans usando análises bioin- formáticas foi excluído dessa posição particular. Os nucleotídeos que ocorriam com uma frequência de 20% ou mais em sequências semente de C. ele- gans foram incluídos na biblioteca. A Tabela 7 mostra os nucleotídeos que são frequentemente observados em cada posição.

A combinação reduzida de nucleotídeos nas posições 7 dentro da sequência semente foi igual a: 2 x 3 x 2 x 3 x 2 x 3 x 3, ou 648 possíveis sequências, o que foi uma redução de 25 vezes na complexidade.

Adicionalmente, foram excluídas sequências de RNA da biblioteca se a sequência de pequeno RNA resultante contivesse quadrupletos de homonucleotídeos, tais como AAAA. Adicionalmente, foram também excluídas sequências de pequeno RNA tendo um conteúdo-GC nas posições 1-9 (i..e, posição 1 e a sequência semente) maior do que o conteúdo-GC das posições 11-19. Após estes dois parâmetros adicionais terem sido considerados, o número de sequências de siRNA na biblioteca foi reduzido para 563 sequências. O motivo de consenso de siRNA é 5- URDSDKVDUGUUGAUCUGGUU-3’ (SEQ ID NO: 48).

Os 563 siRNAs foram sintetizados como dúplexes usando síntese automatizada padrão. De modo a intensificar a estabilidade, os resíduos 3' podem ser estabilizados contra a degradação nucleolítica, e.g., eles consistem em nucleotídeos puros. Alternativamente, a substituição dos nucleotí- deos de pirimidina por análogos modificados, e.g., a substituição da uridina por 2'-deoxitimidina é tolerada e não afeta a eficácia da interferência de RNA. Foram sintetizados siRNAs com um dinucleótido de dTdT na extremidade 3' como uma parte saliente para aumentar a estabilidade e evitar a degradação nucleolítica. Exemplo 2 Rastreio in vitro

Juvenis de segunda fase (J2s) de nematódeos do cisto da soja foram esterilizados à superfície em HgCl2 a 0,01% e depois enxaguados em água estéril 3 vezes antes de serem ressuspensos em meio NGM (bacto- agar a 1,7%, peptona a 0,25%, NaCl a 0,3%, MgSO4 a 1 mM, CaCl2 a 1 mM, KH2PO4 a 25 mM, pH 6,0) contendo octopamina a 50 mM e um dúplex de siRNA único a uma concentração de 0,5 mg/mL (ca. 0,4 mM de dúplex de RNA).

Uma alíquota de 100 μL da solução de imersão contendo 500 J2s foi dispensada em um poço único em uma placa com 48 poços, e incubada a 26°C durante 5 dias. Os J2s foram observados diariamente. Um dú- plex de siRNA se direcionando ao gene hg-rps23 de H. glycines foi usado como um controle positivo. Como um controle negativo, foi usada solução de imersão sem dúplex de siRNA.

Após 5 dias de incubação, os J2s foram observados quanto à sua atividade em comparação com os controles e depois inoculados nas raí- 5 zes de plântulas de soja com 4 dias de idade cultivadas em bolsas de germinação contendo toalhas de papel embebidas em água. As plântulas infetadas foram cultivadas em uma câmara de crescimento a 26 °C com 16 horas por dia de luz durante um mês. O número de cistos formados em cada planta foi contado e 10 comparado com os controles. Os resultados indicaram que 15 dos 563 dú- plexes testados reduziram o número de cistos do NCS nas raízes para menos do que 40% dos controles. As sequências dos siRNAs que reduziram os cistos do NCS estão listadas na Tabela 8. O siRNA de si-rps23-1 foi usado como um controle positivo porque foi mostrado que este RNA reduz os cistos 15 do NCS. Ver Aplicação da PCT PCT/US11/. .

Exemplo 3 Construção de amiRNAs específicos do Alvo As 15 moléculas de siRNA que reduziram o número de cistos do NCS nas raízes da soja foram montados em construtos de microRNA artificial. O precursor de microRNA de soja, gma-MIR164, foi usado como o esqueleto do amiRNA. A sequência miR164/miR164* neste precursor foi substituí da pela sequência siRNA/siRNA*, enquanto as posições sem correspondência no dúplex miR164/miR164* foram mantidas na sequência siRNA/siRNA* artificial fazendo mutações na fita passageira do siRNA*. O desenho do microRNA artificial (amiRNA) para expressão de siRNA anti-NCS na célula da planta hospedeira segue a literatura de 10 Schwab et al., onde amiRNAs foram desenhados para se direcionarem a genes individuais ou a grupos de genes endógenos em uma célula da plan-ta. Ver Schwab et al. (2006) Plant Cell 18, 1121-1133; Alvarez et al. (2006) Plant Cell 18, 1134-1151. O precursor de miRNA de soja gma-MIR164 foi escolhido como o esqueleto dos amiRNAs. Os detalhes sobre a montagem 15 do microRNA artificial específico do alvo são descritos na Aplicação Provisória dos E.U.A. 61/421275 depositada em 12-9-2010, a qual é incorporada por referência aqui na sua totalidade. O amiRNA de aMIR164-rps23-1 foi usado como um controle positivo como nas experiências com siRNA.

Exemplo 4 Ensaios de NCS-Raiz Transgênica In vivo Vetores de expressão contendo miRNAs artificiais específicos do alvo foram transformados em raízes de soja para testar a sua capacidade de reduzir cistos do NCS como transgenes. O cultivar de soja Williams 82 foi usado como o germoplasma para a transformação de raízes em cabeleira. Sementes de soja foram germinadas em ágar a 1% contendo sacarose a 0,5% em placas de Petri a 27°C durante 5 dias. Os cotilédones foram depois cortados das plântulas, e a superfície lesada foi inoculada com culturas de Agrobacterium rhizogenes carregando o vetor binário. Os cotilédones foram colocados em ágar a 1% durante 6 dias e depois transferidos para meio de seleção. Em cerca de duas semanas, eventos de raízes em cabeleira trans- gênicas independentes induzidos pelos cotilédones foram recolhidos e trans-feridos para meio de cultura, e cultivados na escuridão a 27 °C. Narayanan et al. indicaram que os fenótipos de resistência ao NCS na planta inteira foram preservados em raízes em cabeleira, portanto, o sistema da raiz em cabeleira transgênica é útil para avaliação de genes de resistência ao NCS candidatos. Narayanan et al. (1999) Crop Science 39, 1680-1686.

Duas semanas após a transferência para as placas de cultura, as raízes em cabeleira transformadas foram inoculadas com nematódeos do cisto da soja de fase J2 esterilizados à superfície (NCS J2) e as raízes foram cultivadas na escuridão a 27°C, o que permitiu a formação de cistos nos eventos de raízes em cabeleira. Um mês após inoculação do nematódeo, o número de cistos foi determinado para as raízes expressando os miRNAs artificiais específicos do alvo e as raízes expressando o vetor vazio (como o controle negativo).

Nesta experiência, quando os construtos dos vetores amiR- NA0097, amiRNA0145, amiRNA0043, amiRNA0483, amiRNA0309, amiR- NA0382, amiRNA0243 e amiRNA0514 foram sobre-expressos na raiz em cabeleira de soja transgênica, as formações de cistos nestas raízes foram significativamente reduzidas em comparação com os controles. O amiRNA de aMIR164-rps23-1 foi usado como um controle positivo porque foi mostrado que este miRNA reduz a formação de cistos do NCS. Embora a expressão dos outros amiRNAs tais como amiRNA0046, amiRNA0569, amiR- NA0458, e amiRNA0531 não tenha reduzido significativamente o número de cistos do NCS em comparação com os controles, os resultados não indicam que estes poucos amiRNAs sejam ineficazes no direcionamento a RNAs do NCS. Por exemplo, uma estratégia de expressão melhorada que resulte em um maior nível de expressão do siRNA poderia aumentar a eficácia destes siRNAs. Os resultados do ensaio para redução da formação de cistos pelos amiRNAs em raízes em cabeleria da soja estão listados nas seguintes tabelas.

Exemplo 4.1 5 Atividade Dual de amiRNAs Dois dos amiRNAs testados acima, amiRNA0097 compreenden-do siRNA0097, e amiRNA0145 compreendendo siRNA0145 (Ver Tabela 12) causaram um aumento no crescimento e proliferação das raízes nas células de soja transgênicas nas quais eles foram expressos em comparação com 10 células da soja expressando os outros siRNAs ou um vetor vazio (controle negativo), sugerindo que siRNA0097 e siRNA01435 estão a modular a ex-pressão de um ou mais genes da soja adicionalmente a se direcionarem a um gene de nematódeo. Embora nenhuma das fitas de qualquer um dos siRNAs testados acima tenha produzido qualquer complementação de com- 15 primento total com quaisquer genes da soja quando rastreados in silico contra o genoma de uma soja, surpreendentemente ambas as fitas de siR-

NA0097 e siRNA0145 têm complementaridade significativa com dois ortólo- gos de soja de um gene de resposta ao etileno 1 (ETR1) de Arabidopsis. Interessantemente, genes recetores ou de resposta ao etileno como genes tipo ETR1 têm sido implicados na proliferação das raízes e tolerância au-mentada a alguns nematódeos em certas plantas. Em um estudo, por exemplo, plantas de soja quimicamente mutagenizadas que eram insensíveis ao etileno (i.e. gene(s) de resposta ao etileno mutado(s)) produziram cerca de 41% menos fêmeas (cistos) do que plantas de soja não mutageni- zadas de tipo selvagem (Bent et al. 2006. Crop Science 46:893-901). Até à data, não parece que quaisquer estudos tenham correlacionado o nocaute de RNA de um gene de resposta ao etileno com a resistência a nematódeos.

Os resultados da análise de complementação da fita de siRNA são mostrados na Tabela 19. A complementação foi mais elevada para ambas as fitas de amiRNA0097, particularmente na sequência semente (sequência sublinhada). A sequência positiva de amiRNA0097 tem 7 de 7 cor-respondências na sequência semente com o gene ETR1 de soja e a fita de amiRNA0097* (fita asterisco) tem 6 de 7 correspondências na sequência semente. A cadeia mais de amiRNA0145 tem 5 de 7 correspondências e a fita asterisco de amiRNA0145* tem 6 de 7 correspondências. Em ambos estes tratamentos, o amiRNA0097 e o amiRNA0145 intensificaram a redução da infeção por nematódeo (medida pela formação de cistos) em comparação com o amiRNA0043 que teve somente 4/7 correspondências ao ETR1 e o amiRNA0046 que teve 5/7 correspondências ao ETR1 mas que teve uma grande falha entre os nucleotídeos 7 e 8.

Tabela 19. Complementação de siRNAs com Genes tipo ETR1 da Soja Alinhamento de complementação de siRNAs com mRNA de ETR1

Em anos recentes, foi descoberto que a fita de miRNA* de alguns dos dúplexes de miRNA/miRNA* pode ser também carregada no CSIA e interferir com a expressão do seu alvo de mRNA complementar (Kulcheski et al, 2011. BMC Genomics 12:307). É portanto possível que o miRNA* pos- 5 sa ser carregado no complexo de silenciamento induzido por RNA (CSIA) e usado para silenciar o mRNA alvo. Adicionalmente à fita positiva, ambas as fitas de amiRNA0097* e de amiRNA0145* asterisco podem formar ligação de complementaridade com o mRNA de gma-ETR1 (ver Tabela 19 acima), é portanto possível que ambas as fitas de amiRNA0097 e de amiRNA0145 10 possam regular por baixo a expressão do gene gma-ETR1.

Surpreendentemente, os resultados da Tabela 12 acima mostram que as raízes da soja expressando o amiRNA0097 e o amiRNA0145 tiveram resistência significativamente intensificada à formação de cistos em comparação com as raízes de soja expressando o amiRNA0043, o amiR- 15 NA0046 e o controle negativo (evidente pela não sobreposição dos seus er ros padrão). A redução intensificada no número de cistos é provavelmente devido aos siRNA0097 e siRNA0145 terem ambos um efeito direto nos ne- matódeos, i.e. o siRNA0097 e siRNA0145 direcionam-se a um gene de ne- matódeo e suprimem ou silenciam esse gene reduzindo desse modo o nú-mero de cistos que o nematódeo é capaz de produzir (Ver Exemplo 2 cima), e um efeito indireto nos nematódeos, i.e. o siRNA0097 e o siRNA0145 também suprimem a expressão de um gene da planta endógeno (ETR1) em virtude da sua complementaridade ao mRNA de ETR1, o que por seu turno confere alguma resistência à infetividade do nematódeo (produção de cistos). O efeito intensificado na produção de cistos é então provavelmente devido à supressão sinergística de um gene de nematódeo e um gene de planta endógeno. Acredita-se que este é o primeiro relato de tal efeito "direto" ou "indireto" na infetividade do nematódeo de uma única molécula de siRNA.

Exemplo 5 Transformação de Plantas com siRNAs Os pré-miRNAs artificiais, gma-aMIR164-amir0097 e gma- aMIR164-amir0145, compreendendo o dúplex amiRNA0097/amiRNA0097* e o dúplex amiRNA0145/amiRNA0145*, respetivamente (Ver Exemplo 3), foram cada um clonados em vetores binários separados e chamados 20111 e 20109, respetivamente. Os vetores 20111 e 20109 foram transformados para a soja.

A transformação de soja para produzir plantas de soja transgêni- ca foi alcançada usando alvos de sementes imaturas da variedade Williams 82 através de transformação mediada por A. tumefaciens. Os materiais dos explantes e as receitas dos meios foram essencialmente como descrito em Hwang et al. (Publicação Internacional da PCT No. WO 08/112044) e Que et al. (Publicação Internacional da PCT No. WO 08/112267), como algumas variações como notado abaixo. Usando este método, os elementos genéticos dentro das regiões bordejantes à esquerda e à direita do plasmídeo de transformação são eficazmente transferidos e integrados no genoma da cé-lula de planta, enquanto os elementos genéticos fora destas regiões borde- jantes não são geralmente transferidos.

Vagens de soja em maturação foram recolhidas de plantas culti-vadas em estufa, esterilizadas com solução de branqueamento diluída, e enxaguadas com água esterilizada. As sementes imaturas foram depois ex- cisadas das vagens de sementes e enxaguadas brevemente com água este-rilizada. Foram preparados explantes a partir de sementes imaturas esterili-zadas essencialmente como descrito em Hwang et al. (Publicação Internaci-onal da PCT No. WO 08/112044) e infetados com a estirpe EHA101 de A. tumefaciens carregando o vetor 20111 ou 20109 e permitiu-se que incubas-sem durante 30 a 240 minutos adicionais. O excesso da suspensão de A. tumefaciens foi removido por aspiração e os explantes foram mudados para placas contendo um meio de cocultura não seletivo. Os explantes foram co- cultivados com a A. tumefaciens restante a cerca de 23 °C durante cerca de 4 dias na escuridão e depois transferidos para meio de recuperação e rege-neração suplementado com uma mistura de antibióticos consistindo em ti- carcilina (75 mg/L), cefotaxima (75 mg/L) e vancomicina (75 mg/L) onde eles foram incubados no escuridão durante sete dias.

Os explantes foram depois transferidos para meio de regenera-ção contendo higromicina B (3 a 6 mg/L) e uma mistura de antibióticos con-sistindo em ticarcillina (75 mg/L), cefotaxima (75 mg/L) e vancomicina (75 mg/l) para inibir e matar a A. tumefaciens. A regeneração e elongação dos brotos foram levadas a cabo em meio de elongação contendo 2 a 4 mg/L de higromicina B. O gene da higromicina fosfor-transferase (HPT) foi usado co-mo um marcador selecionável durante o processo de transformação. As plantinhas regeneradas foram transplantadas para o solo essencialmente como descrito (Publicação Internacional da PCT No. WO 08/112267) e tes-tadas quanto à presença de sequências do promotor de HPT e CMP usando análises de RCP TaqMan® (Ingham et al. (2001) Biotech 31, 132-140). Este rastreio permite a seleção de eventos transgênicos que carregam o T-ADN e estão isentos de ADN do vetor. As plantas positivas para o gene da HPT e sequências de CMP e negativas para o gene da espectinomicina (spec) fo-ram transferidas para a estufa de plantas para análise da expressão de miRNA e estabelecimento de sementes.

Quando as raízes tinham cerca de 2-3 polegadas, as plantas fo-ram então transplantadas para vasos de 1 galão usando solo Fafard #3 e 30 gramas de Osmocote Plus 15-9-12 incorporado e mantidas sob condições de crescimento na estufa padrão para plantas de soja.

As folhas dos eventos de soja transgênia 20111 e 21019 foram amostradas para determinar quantitativamente o nível de expressão do gene ETR1 usando uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real reconhecida na técnica (qTR-RCP) (Ver por exemplo, VanGuilder et al. (2008). Biotechniques 44 (5): 619-626; Udvardi et al. (2008). Plant Cell 20 (7): 1736-1737). A quantidade relativa da expressão do gene ETR1 nos eventos transgênicos e em plantas de soja de tipo selvagem de controle foi determinada por comparação do nível de ETR1 com um diferente gene da soja endógeno.

Os resultados do ensaio de qTR-RCP mostraram que a expres-são de ETR1 nas raízes de soja transgênica produzindo siRNA0097 e siR- NA0145 foi significativamente menor comparada com as raízes de soja de tipo selvagem de controle. A quantidade relativa do nível de expressão de ETR1 foi cerca de 34±5 (N=9, onde N é o número de plantas) em raízes de soja de tipo selvagem e cerca de 23±4 (N=14, onde N é o número de eventos) e cerca de 12±1 (N=21, onde N é o número de eventos) nas raízes de soja transgênica com siRNA0145 e siRNA0097, respetivamente. Portanto, as raízes de soja transgênica com siRNA0145 e siRNA0097 tiveram uma redução de 33% e de 66% na expressão do gene ETR1, respetivamente, em comparação com as raízes de soja de tipo selvagem.

Estes resultados se correlacionam com os outros resultados ob-tidos para siRNA0097 e siRNA0145 descritos acima. O siRNA0097 e o siR- NA0145 foram desenhados para se direcionarem a um gene de nematódeo e após contacto do nematódeo do cisto da soja com ou siRNA0097 ou siR- NA0145 a capacidade do nematódeo em produzir cistos nas raízes da soja foi reduzida (Ver Exemplo 2). As raízes de soja expressando siRNA0097 ou siRNA0145 tiveram um número significativamente reduzido de cistos quando infetadas com NCS (Exemplo 4) com o siRNA0097 tendo um número signifi-cativamente menor do que o siRNA0145. Interessantemente, o siRNA0097 teve a mais elevada complementaridade em ambas as fitas com um gene ETR1 de soja e as raízes de soja expressando siRNA0097 tiveram o nível mais baixo da expressão do gene ETR1. Bent et al. 2006 (supra) relataram uma redução de cerca de 41% em cistos em plantas de soja insensíveis ao etileno com um gene ETR1 quimicamente mutado. Aqui, as raízes de soja expressando um siRNA que se direciona diretamente a um gene do NCS e modula a expressão de um gene ETR1 endógeno tiveram uma redução tão elevada como 68% no número de cistos, um nível que é maior do que expe- tável quer da modulação do gene de nematódeo, quer da modulação do gene ETR1 sozinho.

Embora tenham havido relatos de efeitos "fora de tipo" de dsR- NA desenhado para se direcionar a um gene de praga da planta, até à data, parece que nenhuns estudos relataram a supressão de um gene de planta endógeno por um siRNA desenhado para se direcionar a um gene de uma praga de planta de nematódeo onde a supressão do gene da planta também confere resistência à mesma praga de nematódeo. Assim, é surpreendente que um siRNA desenhado para se direcionar a um gene de nematódeo su-prima a expressão quer de um gene de nematódeo (efeito direto no nemató- deo), quer de um gene da planta endógeno que por seu turno interfere com a infetividade do nematódeo (efeito indireto no nematódeo). É adicionalmente surpreendente que a modulação de um gene da planta endógeno por um siRNA desenhado para se direcionar a um gene de nematódeo possa ser devida a ambas as fitas positiva e asterisco do siRNA.

As plantas transformadas com os vetores são inoculadas com nematódeos do cisto da soja em fase J2 (NCS J2). Brevemente, plântulas com 1 semana de idade obtidas da soja de geração T1 transgênica cultivada em bolsas de germinação são inoculadas com suspensão de NCS J2 ao ní-vel de 750 J2 por planta. Um mês após a inoculação com nematódeos, o número de cistos é determinado para as plantas transgênicas compreen-dendo cassetes de expressão de amiRNA e para os segregantes nulos dos mesmos progenitores T0.

Exemplo 6 Desenho e Construção da Biblioteca de siRNA da Lagarta da Raiz do Milho Foi preparada uma biblioteca de pequenos RNA de interferência tendo uma sequência semente parcialmente randomizada para se direcionar indiscriminadamente a mRNAs de uma praga de inseto. A lagarta da raiz do milho (LRM) foi escolhida como a praga alvo para teste desta biblioteca de siRNA.

Uma biblioteca de pequenos RNA de interferência com 21 nu- cleotídeos foi desenhada com uma sequência semente randomizada locali-zada nas posições 2-8 a partir da extremidade 5', e as posições 1, 9-21 foram fixadas. Uma vez que o pequeno RNA foi desenhado para se direcionar a genes da praga de insetos, a sequência não semente foi baseada em mi- croRNAs de um inseto praga colepterano relacionado, Tribolium castaneum. Análises bioinformáticas dos miRNAs de T. castaneum previstos e conheci-dos revelou nucleotídeos conservados em cada posição da região não se-mente dos miRNAs (i.e., posições 1 e 11-19). Estes nucleotídeos foram se-lecionados para a sequência não semente para a biblioteca de siRNA. Foram escolhidos resíduos de uridina para as posições 20 e 21 de modo a aumentar a estabilidade da molécula para rastreio in vitro. A sequência não semente modelo gerada a partir do miRNA de consenso de T. castaneum é 5‘-UNNNNNNNUAUCCGGAUUCUU-3‘, (SEQ ID NO: 50) onde N indica um nucleótido aleatório (i.e., A, C, G ou U) na sequência semente. Uma bibliote-ca de siRNA desta sequência exemplar consiste em 47 (i.e., 4 * 4 * 4 * 4 * 4 x 4 * 4) diferentes moléculas de RNA, ou 16.384 possíveis sequências.

De modo a reduzir a complexidade de uma biblioteca de RNA (i.e., o número de sequências contidas na biblioteca), um subconjunto de sequências foi excluído da biblioteca. Em particular, a complexidade da bi-blioteca de siRNA foi reduzida por exclusão computacional de nucleotídeos que ocorriam a uma posição particular em sequências semente de miRNA de T. castaneum a frequências mais baixas. Neste exemplo, o limiar de fre-quência foi escolhido como sendo 20%. Conformemente, qualquer nucleóti- do que se determinou como ocorrendo menos do que 20% a uma posição particular em uma sequência semente de T. castaneum usando análises bioinformáticas foi excluído dessa posição particular. Os nucleotídeos que ocorriam com uma frequência de 20% ou mais em sequências semente de T. castaneum foram incluídos na biblioteca. A Tabela 20 mostra os nucleotí- deos que são frequentemente observados em cada posição.

A combinação reduzida de nucleotídeos nas posições 7 dentro da sequência semente foi igual a: 4 x 3 x 4 x 2 x 3 x 4 x 4, ou 4608 possíveis sequências, o que foi uma redução de 3,6 vezes na complexidade.

Adicionalmente, foram excluídas sequências de pequeno RNA da biblioteca in silico se a sequência semente contivesse quadrupletos de homonucleotídeos, tais como AAAA. Adicionalmente, foram também excluí-das sequências tendo um conteúdo-GC nas posições 1-9 (i..e, posição 1 e a sequência semente e a posição 9) maior do que o conteúdo-GC das posições 11-19. Após estes dois parâmetros adicionais terem sido considerados, o número de sequências de siRNA na biblioteca in silico foi reduzido para 3899 sequências. O motivo de consenso de siRNA é 5‘- UNDNWDNNUAUCCGGAUUCUU-3’ (SEQ ID NO: 51).

Os 3899 siRNAs são sintetizados como dúplexes usando síntese automatizada padrão. De modo a intensificar a estabilidade, os resíduos 3' podem ser estabilizados contra a degradação nucleolítica, e.g., eles consis-tem em nucleotídeos purinas. Alternativamente, a substituição dos nucleotí- deos de pirimidina por análogos modificados, e.g., a substituição da uridina por 2'-deoxitimidina é tolerada e não afeta a eficácia da interferência de RNA. Podem ser também sintetizados siRNAs com um dinucleótido de dTdT na extremidade 3' como uma parte saliente para aumentar a estabilidade e evitar a degradação nucleolítica.

Claims

1. Molécula de siRNA artificial caracterizada por compreender a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-14 e em que a molécula de siRNA reduz o número de cistos de nematódeos no cisto da soja em raízes da soja.

2. Molécula de RNA artificial caracterizada por consistir na mo-lécula de siRNA, como definida na reivindicação 1, em que a molécula de RNA artificial é codificada pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 16-29.

3. Vetor caracterizado por compreender a molécula de siRNA, como definida na reivindicação 1, em que o vetor é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 31-44.

4. Método de conferir resistência à nematódeo do cisto da soja em uma planta de soja ou semente de soja caracterizado por compreender o contato da planta de soja ou semente de soja com uma molécula de siRNA compreendendo a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-14 e em que a molécula de siRNA reduz o número de nematódeos do cisto da soja em raízes da soja.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o contato é realizado aplicando um tratamento na semente antes de plantar a semente de soja, em que o tratamento na semente compreende a molécula de siRNA compreendendo a sequência de nucleotídeos de qual-quer uma das SEQ ID Nos: 1-14.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o tratamento da semente compreende pelo menos um composto adicional selecionado a partir do grupo consistindo em um herbicida, um fungicida, um inseticida, um promotor de crescimento, um protetor e um composto nutritivo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o contato é realizado aplicando um banho de raiz a pelo menos uma raiz da planta de soja, em que o banho de raiz compreende uma molé-cula de siRNA compreendendo a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-14.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o siRNA está compreendido dentro de uma solução aquosa.

9. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo 5 fato de que o contato é realizado aplicando o siRNA ao solo durante, antes, e/ou depois da germinação da raiz ter ocorrido na planta de soja.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pe lo fato de que o siRNA está compreendido dentro de uma solução aquosa.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pe- 10 lo fato de que o siRNA está compreendido dentro de um material granular seco.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os materiais granulares secos são peletes.