CN101985660A

CN101985660A - 一种鉴别鹅品种的方法

Info

Publication number: CN101985660A
Application number: CN 201010574011
Authority: CN
Inventors: 陈国宏; 徐琪; 乔娜; 段修军; 赵文明; 张扬
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2010-12-06
Filing date: 2010-12-06
Publication date: 2011-03-16

Abstract

本发明公开了一种鉴别鹅品种分子生物学方法。本发明在已有研究报道的基础上，筛选出多态性丰富的微卫星引物，以ABI 3730XLDNA全自动基因分析仪为平台，结合荧光-多重PCR技术，采用GeneScan-500标准，对不同鹅品种个体进行扫描，获得不同品种特有等位基因，构建鹅STR标准遗传图谱，根据待检测样本的STR图谱与标准图谱比较，鉴定待测样本的品种真实性。本方法具有产量高、成本低、快速简便等优点，为科学评价和鉴定鹅品种遗传特性提供一条可靠的技术途径，为保护鹅育种产权和规范种鹅市场提供技术保障。

Description

一种鉴别鹅品种的方法

技术领域

本发明涉及一种鹅品种鉴别方法，特别涉及通过微卫星荧光标记全自动基因分型技术鉴别鹅品种的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

我国是世界养鹅大国，年出栏量占世界的70％，我国也是世界鹅品种资源最丰富的国家之一，拥有26个地方品种资源，近年来，随着市场经济的不断发展，在鹅的生产与经营、新品种培育和品种权益保护以及流通加工等领域急需快速高效的鹅品种鉴定方法，目前鉴定家禽品种主要有形态鉴定、同工酶鉴定、简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)鉴定等。然而上述方法均存在不同程度的局限性，如形态特征易受环境影响，可靠性差；同工酶、SSR标记分辨率较低，对于亲缘关系较近的品种间往往无法区分，其重复性也差。微卫星荧光标记全自动基因分型技术是新近发展起来的一项检测技术，该技术是利用3种不同颜色的荧光染料标记微卫星引物，可以将多种不同荧光标记和不同扩增片段的产物在同一加样孔中电泳，并且可将待测产物与内在分子量标准同时上样，通过序列凝胶电泳，GeneMapper软件进行图像分析，精确计算出微卫星等位基因片段大小。

发明内容

本发明目的在于提供一种鹅品种鉴别的方法，其主要通过微卫星荧光标记全自动基因分型技术对鹅品种进行鉴定。

本发明以DNA全自动基因分析仪为平台，结合荧光-多重PCR技术，采用GeneScan-500标准，对不同鹅品种个体进行扫描，获得不同品种特有等位基因，构建鹅STR标准遗传图谱，根据待检测样本的STR图谱与标准图谱比较，鉴定待测样本的品种真实性。

本发明的技术方案包括如下步骤：

(1)鹅短串联重复序列(short tandem repeats，STR)标准遗传图谱构建：

提取来自国家级保种场的鹅品种基因组DNA，将下述10对STR引物，采用荧光标记，结合多重PCR技术对基因组DNA进行扩增，通过ABI 3730XLDNA全自动基因分析仪对不同个体进行扫描，以GeneScan-500为标准内参，利用GeneMapper 4.0软件进行图像分析，精确测量出微卫星等位基因片段大小，获得不同品种特有等位基因，并构建不同品种鹅的STR标准遗传图谱；

第1对引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

第2对引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

第3对引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

第4对引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

第5对引物序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；

第6对引物序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；

第7对引物序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示；

第8对引物序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示；

第9对引物序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示；

第10对引物序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示；

(2)待检测样本的STR图谱的获得：

提取待检测样本的鹅品种基因组DNA，采用上述相同引物进行多重PCR扩增和扫描，获得检测样本的鹅品种得STR图谱；

(3)待检测样本的品种鉴定：

将待检测样本的STR图谱与标准图谱相比较，鉴定待测样本的品种真实性。

本发明相比于现有的鉴定方法，其具有快速、准确、可重复性好、成本低等优点。

附图说明

图1是皖西白鹅的STR标准遗传图谱。

图2是浙东白鹅STR标准遗传图谱。

图3是四川白鹅STR标准遗传图谱。

图4是太湖鹅STR标准遗传图谱。

图5是狮头鹅STR标准遗传图谱。

图6是豁眼鹅STR标准遗传图谱。

图7是武冈铜鹅STR标准遗传图谱。

图8是马岗鹅STR标准遗传图谱。

图9乌鬃鹅STR标准遗传图谱。

图中各编号对应的位点为1：I-1；2：II-1；3：III-3；4：II-2；5：III-1；6：III-2；7：II-3；8：IV-3；9：IV-2；10：IV-1。

具体实施方式

1、鹅STR标准遗传图谱构建

(1)不同鹅品种基因组DNA的提取(样本量)

取自国家水禽种质资源基因库现保存的9个地方鹅品种，各品种随机抽取60只，其中公、母各30只。9个鹅品种(皖西白鹅，WX；浙东白鹅，ZD、四川白鹅，SC；太湖鹅，TH；狮头鹅，ST；豁眼鹅，HY；武冈铜鹅，WG；马岗鹅，MG和乌鬃鹅，WZ)。每只鹅翅下静脉采血2～3ml，0.5％肝素钠抗凝，置冰盒带回实验室，低温低速离心5min小心去除上层血浆，-20℃低温保存血细胞。

①取红细胞20ul于1.5mL Eppendorf管中，加入500mL禽血裂解液，5μL RNase A(20μg/μL)，10μL 10％SDS，10μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，55℃水浴过夜；

②加入等体积Tris饱和酚，摇20min后，12000rpm离心10min；

③转移出上清液，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，V/V/V)，摇15min后，12000rpm离心10min；

④重复步骤③一次；

⑤抽提上清液中加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1，V/V)摇15min，12000rpm离心10min；

⑥抽提上清液中加入2倍体积的冰无水乙醇，轻摇、沉淀DNA。

⑦7500rpm离心5min，小心倾倒出乙醇；

⑧70％乙醇洗涤2次。自然干燥，加300μL TE溶解。

待DNA完全溶解后，采用NanoDrop ND-1000浓度测定仪检测样本DNA的浓度和纯度，并将其稀释到100ng/μL分装备用。DNA原液-20℃长期保存。

(2)STR引物的筛选、荧光标记及PCR扩增

在已报道的鹅微卫星引物序列的基础上，筛选出10对多态性丰富、扩增效率好的微卫星引物，对每对STR引物上游引物5’端分别用FAM(蓝色)，HEX(绿色)和TAMRA(黑色)三种荧光染料进行标记，引物避光保存。根据微卫星扩增片段大小的范围和引物荧光标记颜色的差异，对筛选出的引物进行组合试验。其组合依据是每三种颜色荧光为一组，该组内荧光PCR扩增产物片段大小相差50bp以上。根据筛选出的10对STR引物信息，这样的组合共有4个。根据分组情况进行多重PCR的扩增，10对荧光标记微卫星引物其组合情况及PCR反应条件如表1所示。

表1.10对荧光标记微卫星引物其组合情况及PCR反应条件

(3)全自动基因分析仪扫描

荧光PCR产物STR分型上样总体积为13μL，其中上样液Hi-Di Formamide 10uL，GS-500Size Standard 0.5μL，混合PCR扩增产物3μL(依峰图情况而定)。

先把Hi-Di与GS-500size standard混合均匀，加到上样用的96孔板中，再把按电泳组合事先等量混合好的同一个体的混合PCR扩增产物，按编号的顺序依次加样到96孔板中，然后盖好盖子变性后上机进行电泳检测。

(4)数据及图谱的读取、处理与分析

①数据及图谱的读取、处理

电泳结束后，GeneMapper 4.0软件自动生成各自独立的图谱文件，软件会根据每个图谱峰值大小自动选择各位点位置，并读出片段大小，峰值大小的数据，同时判断纯合子(单峰)或杂合子(双峰)，最后生成Excel数据表格。

②数据统计分析

因为微卫星DNA呈共显性遗传，其基因型直接反映表型。因此，等位基因频率可通过简单计算获得。将每个个体的基因型按三位数录入Excel表，然后利用Microsatellite-Toolkit软件计算等位基因频率、观察杂合度与期望杂合度，平均有效等位基因数等遗传参数。

(5)构建不同品种鹅的STR标准遗传图谱。

根据各品种在10个检测位点的等位基因分布、频率及各品种的特有等位基因分布情况，结合全自动检测图谱，构建各个品种所特有的STR标准遗传图谱(见图1-9)。

2、待检测样本的STR图谱的获得

待测群体数量应大于60只。对待测样本进行血样采集、DNA提取、荧光引物多重PCR扩增等一系列处理后，使用全自动基因分析仪进行扫描，获取各样本各位点STR图谱。

3、待检测样本的品种鉴定

将待检测样本的STR图谱与标准图谱相比较，根据峰图分布情况，鉴定待测样本的品种真实性。