CN108315436A - 一种应用于鹅亲子鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及的是一种应用于鹅亲子鉴定的方法，该方法联合使用20个多态信息含量较高且等位基因数为5个以上的微卫星标记，鉴定材料为基因组DNA。鉴定方法简要如下：使用PCR技术对20个微卫星标记进行扩增；采用Sanger测序方法对PCR扩增产物进行基因型判定；使用排除法，当累积非父排除概率大于99％或存在2个及以上基因型不遵循孟德尔遗传规律时，即可排除子代与假设亲本间的亲子关系；若使用排除法后子代存在2个及以上的候选亲本，则分别计算各个候选亲本似然函数比值的自然对数值(LOD)，通过比较LOD值的大小来认定候选亲本是后代真实亲本的可能性。本发明可解决鹅大群繁殖过程中后代个体识别困难、系谱信息混乱甚至发生错误等问题。

Description

一种应用于鹅亲子鉴定的方法
技术领域
本发明涉及的是动物遗传育种技术领域，具体涉及的是一种鹅亲子鉴定的方法。
背景技术
早期的亲子鉴定将血型、血清型以及酶型等作为遗传标记。当前，DNA分子标记己经取代了传统的遗传标记，成为亲子鉴定使用的主要标记。有性生殖将双亲的DNA随机地结合在一起，将个体的DNA序列与另一个个体的DNA序列进行比较，可以表明其是否具有亲子关系。微卫星标记是常用的DNA分子标记，其多态性丰富，序列两端是相对保守的单拷贝序列，等位基因数目高度可变，杂合度高，遗传稳定性较好，突变率低，呈共显性遗传，因此被广泛应用于构建基因图谱、监测遗传操作效应、品种或品系遗传纯度的测定及遗传关系确定、个体及群体亲缘关系的鉴定当中。
鹅一般在水中或陆地成群饲养，自然交配，在繁殖阶段母鹅可与不同的公鹅交配，往往多个母鹅所产种蛋集中在一个或几个窝内。无法查证产生种蛋的父本和母本，造成后代个体识别困难，系谱信息混乱甚至发生错误，进而无法有效评价种鹅的育种价值，阻碍鹅育种工作的顺利进行。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题提供一种应用于鹅亲子鉴定的方法，用于解决鹅育种过程中，因大群交配、不同亲本种蛋混合而导致的个体识别困难、系谱不清等难题。
本发明通过以下技术方案来实现：获取鹅基因组DNA(来源可以为血液基因组DNA及其他组织细胞DNA)；以基因组DNA为模板，根据设计的20对微卫星标记引物的不同反应程序分别进行PCR扩增；采用Sanger测序法对PCR扩增产物进行基因型判定；根据基因型判定结果联合使用排除法与似然法进行亲子关系鉴定。
具体实施方式
为了更清楚的说明本发明的技术方案，下面结合试验，进一步阐述本发明的内容。具体试验方法及试验结果如下：
一、用于鹅亲子鉴定的微卫星标记的筛选
1、微卫星标记引物序列信息
表1微卫星标记扩增序列信息
2、血液采集
试验1鹅群大小为400只，分别进行翅下静脉采血1mL，使用柠檬酸钠作为抗凝剂抗凝，于1.5mL Ep管中，冷藏带回实验室，-80℃保存，待提取DNA。
3、基因组DNA提取
按照TIANamp Blood DNA Kit说明书操作步骤进行血液基因组DNA的提取，并进行DNA质量及纯度检测。
4、PCR反应
采用25μl反应体系，具体见表2，反应程序见表3。PCR反应结束后进行PCR反应产物检测。
表2PCR扩增体系
表3PCR反应程序
5、基因型判定
送至生物技术公司进行测序以达到判定基因型的目的。
6、数据分析
6.1等位基因频率
根据如下公式进行等位基因频率计算：
Pi＝(2nii+nij)/2N
Pi为第i个基因的等位基因频率，nii为第i个等位基因纯合子个体数，nij为含第i等位基因的杂合子个体数，N为群体总数。
6.2群体杂合度计算
根据如下公式进行群体杂合度计算：
式中Pi为第i个等位基因的频率；n为第i个位点的等位基因数。
6.3多态信息含量计算
根据如下公式计算多态信息含量：
式中Pi，Pj为第i和j个等位基因的频率；n为某个位点的等位基因数。
6.4排除概率计算
当父本、母本遗传信息均未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率计算公式为：
已知父本、母本一方遗传信息时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率计算公式为：
当父本、母本遗传信息均已知时，排除子代与无关假设父母对是亲子关系的排除概率计算公式为：
上述式中，n为等位基因数，Pi为第i个等位基因的频率。
k个标记的累积排除概率计算公式为：
CP＝1-(1-P1)(1-P2)(1-P3)...(1-PK)
6.5似然函数计算
LOD＝ln[L(H1)/L(H2)]
式中，H1为假设父亲为真实父亲，H2为假设父亲为无关个体。L(H1)、L(H2)为在假设条件H下的似然函数。
6.6统计分析软件
Cervus 3.0、Gene Marker V1.91。
7、结果
7.1微卫星标记的等位基因频率统计结果见表4，等位基因频率为0.001～0.726。
表4 20个微卫星标记等位基因频率
7.2微卫星标记遗传信息统计结果见表5，20个微卫星标记等位基因数为5～13个，平均等位基因数为7.05个。观测杂合度为0.325～0.806，平均观测杂合度为0.51。期望杂合度为0.437～0.803，平均期望杂合度为0.612。多态信息含量为0.378～0.778，平均多态信息含量为0.565。
表5等位基因数、杂合度、多态信息含量及H-W平衡检验
注：NS代表差异不显著；**代表差异显著；***代表差异极显著。
7.3 20个微卫星标记三种情况下单独排除概率及累积排除概率统计结果见表6。当父本、母本遗传信息均未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的单独排除概率1(EP1)为0.097～0.447；已知父本、母本一方遗传信息时，排除子代与假设亲本是亲子关系的单独排除概率2(EP2)为0.195～0.625；当父本、母本遗传信息均已知时，排除子代与无关假设父母对是亲子关系的单独排除概率3(EP3)为0.295～0.812。累积排除概率CEP1、CEP2、CEP3分别为0.9958、0.9999、0.9999。
表6微卫星标记排除概率
8、结论
一般认为，微卫星标记的等位基因数至少为4个时才能较好的用于物种的遗传分析及亲子鉴定当中。本发明中，20个微卫星标记共检测到141个等位基因，等位基因数为5～13个，平均等位基因数为7.05个；平均观测杂合度为0.518，平均期望杂合度为0.612，二者差值为0.094，差值较小说明这20个微卫星标记具有较好的基因杂合度，能够准确的反应出群体的遗传结构。当使用微卫星标记进行亲子鉴定时，累积排除概率大于0.8时才能进行亲子鉴定，否则将需要重新选择微卫星标记。本发明中，20个微卫星标记的累积排除概率CEP1、CEP2、CEP3分别为0.9958、0.9999、0.9999。综上所述，此20个微卫星标记在鹅亲子鉴定研究中具有较高的使用价值。
二、应用微卫星标记进行鹅亲子鉴定的应用举例
应用上述20个微卫星标记联合使用排除法与似然法对21只鹅(父本4只，子代17只)进行亲子关系鉴定，并将亲子鉴定的结果与鹅场系谱记录比对，验证该方法的准确性。使用CERVUS3.0软件计算LOD值在95％时置信度为2.51，在80％时置信度为0.28。当鉴定置信度为95％时，为全部17只后代找到了他们的亲生父亲。将亲子鉴定结果与系谱记录对比发现鉴定准确率为100％，结果详见表7。
表7亲子鉴定与系谱记录对比(95％置信度)
综合以上试验结果可进一步证明联合使用本发明中的20个微卫星标记进行鹅亲子关系鉴定，可以解决鹅大群繁殖或家系繁殖过程中后代个体识别困难、系谱建立困难、系谱信息混乱甚至发生错误等问题，可提高鹅选种的准确性。

Claims (1)

1.一种应用于鹅亲子鉴定的方法，其特征在于：该方法联合使用20个微卫星标记进行鹅亲子关系鉴定，分别是Ans2、Ckw11、Ckw12、Ckw21、Ckw49、Zaas001、Zaas006、Zaas033、Zaas036、Zaas054、Zaas060、Zaas061、Zaas071、Zaas144、Zaas154、Zaas169、Zaas175、Zaas177、Zaas178、Zaas181。
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