CN108998549B - 用于牦牛亲权鉴定的ssr分子标记、引物组及其应用 - Google Patents
用于牦牛亲权鉴定的ssr分子标记、引物组及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记、引物组及其应用，涉及亲权鉴定术领域。该用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记包含scaffold2072、scaffold341和scaffold1139三个位点，在给定候选双亲基因型，排除候选双亲的条件下，累计非父排除概率可达到99％，缓解了现有技术中存在的缺乏牦牛亲权鉴定分子标记的技术问题。该引物组用于扩增上述SSR分子标记，可特异性的扩增出SSR分子标记中的各位点，具有良好的特异性。
Description
技术领域
本发明涉亲权鉴定术领域，尤其是涉及一种用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记、引物组及其应用。
背景技术
素有“高原之舟”美誉的牦牛，是唯一适应青藏高原特殊生态环境的牛种，是我国高原人民群众的重要生产和生活资料。能为牧民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生产和生活必需品，是西部少数民族地区畜牧业经济中不可缺少的重要畜种。我国现有牦牛1 400多万头，主要分布在以青藏高原为中心的青海、西藏、四川、甘肃、云南、新疆等地的藏族同胞聚居区。其饲养方式还保持着原始的纯天然放牧方式。
牦牛的饲养主要为野外放牧，公母畜之间的繁殖交配并不是在牧民计划下的选种选配，而是仍停留在自然交配的水平上。全年中的大部分时间，牦牛被放牧在草原上。公母牛混养，没有准确的交配记录，不能判断新生牛犊父权归属、也不清楚牦牛个体之间的亲缘关系以及是否存在近交等，给牦牛的保种和选育带来很大困难。这就迫切的需要一种实用的亲权鉴定方法来解决这些问题。
以微卫星标记为基础的亲权鉴定技术是目前动物亲权鉴定中应用最为广泛最可靠的手段之一。但是目前有关于牦牛亲权鉴定的研究十分少见。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记，该分子标记可以有效的鉴定牦牛亲本和子代的亲权关系。
本发明的第二目的在于提供一种用于扩增上述SSR分子标记的引物组，可成功扩增出上述用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记。
本发明的第三目的在于提供一种用于牦牛亲权鉴定的试剂盒，该试剂盒包含上述用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记。
本发明的第四目的在于提供一种牦牛亲权鉴定的方法。
本发明的第五目的在于提供一种上述用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记、上述用于扩增上述SSR分子标记的引物组、上述用于牦牛亲权鉴定的试剂盒或上述牦牛亲权鉴定的方法的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
本发明提供了一种用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记，所述SSR分子标记包括scaffold2072、scaffold341和scaffold1139；具有如下表所示的位点信息：
优选地，所述SSR分子标记还包括scaffold879、scaffold2036、scaffold2058、scaffold1000、scaffold1649、scaffold4112、scaffold506、scaffold1645、scaffold2687、scaffold1210、scaffold547、scaffold1214、scaffold1343、scaffold1141、scaffold94、scaffold738和scaffold629中的一个或多个位点；具有如下表所示的位点信息：
优选地，所述SSR分子标记还包括scaffold879。
优选地，所述SSR分子标记还包括scaffold2036、scaffold2058、scaffold1000和scaffold1649中的一个或几个位点；
更优选地，所述SSR分子标记还包括scaffold2036、scaffold2058、scaffold1000和scaffold1649。
优选地，所述SSR分子标记还包括scaffold4112、scaffold506、scaffold1645、scaffold2687、scaffold1210、scaffold547、scaffold1214、scaffold1343、scaffold1141、scaffold94、scaffold738和scaffold629中的一个或几个位点；
更优选地，所述SSR分子标记还包括scaffold4112、scaffold506、scaffold1645、scaffold2687、scaffold1210、scaffold547、scaffold1214、scaffold1343、scaffold1141、scaffold94、scaffold738和scaffold629。
本发明还提供了用于扩增上述SSR分子标记的引物组，包括如下引物对：
用于扩增scaffold2072的引物对，具有如SEQ ID NO.1所示序列和具有如SEQ IDNO.2所示序列；
用于扩增scaffold341的引物对，具有如SEQ ID NO.3所示序列和具有如SEQ IDNO.4所示序列；
用于扩增scaffold1139的引物对，具有如SEQ ID NO.5所示序列和具有如SEQ IDNO.6所示序列；
和/或，如下引物对中的至少一对：
用于扩增scaffold879的引物对，具有如SEQ ID NO.7所示序列和具有如SEQ IDNO.8所示序列；
用于扩增scaffold2036的引物对，具有如SEQ ID NO.9所示序列和具有如SEQ IDNO.10所示序列；
用于扩增scaffold2058的引物对，具有如SEQ ID NO.11所示序列和具有如SEQ IDNO.12所示序列；
用于扩增scaffold1000的引物对，具有如SEQ ID NO.13所示序列和具有如SEQ IDNO.14所示序列；
用于扩增scaffold1649的引物对，具有如SEQ ID NO.15所示序列和具有如SEQ IDNO.16所示序列；
用于扩增scaffold4112的引物对，具有如SEQ ID NO.17所示序列和具有如SEQ IDNO.18所示序列；
用于扩增scaffold506的引物对，具有如SEQ ID NO.19所示序列和具有如SEQ IDNO.20所示序列；
用于扩增scaffold1645的引物对，具有如SEQ ID NO.21所示序列和具有如SEQ IDNO.22所示序列；
用于扩增scaffold2687的引物对，具有如SEQ ID NO.23所示序列和具有如SEQ IDNO.24所示序列；
用于扩增scaffold1210的引物对，具有如SEQ ID NO.25所示序列和具有如SEQ IDNO.26所示序列；
用于扩增scaffold547的引物对，具有如SEQ ID NO.27所示序列和具有如SEQ IDNO.28所示序列；
用于扩增scaffold1214的引物对，具有如SEQ ID NO.29所示序列和具有如SEQ IDNO.30所示序列；
用于扩增scaffold1343的引物对，具有如SEQ ID NO.31所示序列和具有如SEQ IDNO.32所示序列；
用于扩增scaffold1141的引物对，具有如SEQ ID NO.33所示序列和具有如SEQ IDNO.34所示序列；
用于扩增scaffold94的引物对，具有如SEQ ID NO.35所示序列和具有如SEQ IDNO.36所示序列；
用于扩增scaffold738的引物对，具有如SEQ ID NO.37所示序列和具有如SEQ IDNO.38所示序列；
用于扩增scaffold629的引物对，具有如SEQ ID NO.39所示序列和具有如SEQ IDNO.40所示序列。
优选地，所述引物对中的引物经过修饰和/或经过标记物标记；所述修饰包括：磷酸化修饰、内部氨基酸修饰和/或硫代修饰；所述标记物标记包括：生物素标记、地高辛标记和/或荧光标记。
本发明还提供了一种用于牦牛亲权鉴定的试剂盒，该试剂盒包含上述引物对。
本发明还提供了一种牦牛亲权鉴定的方法，包括：提供待测样本的DNA，然后扩增待测样品的DNA的SSR分子标记，然后依据扩增结果进行基因分型，再计算LOD值判断亲本与子代的亲权关系；
若LOD值大于0，则表示与任意个体相比，候选亲本是真实的亲本；若LOD值小于0表示与任意个体相比，候选亲本不是真实的亲本；
所述SSR分子标记包括上述SSR分子标记。
本发明还提供了上述SSR分子标记、上述引物对、上述试剂盒或上述牦牛亲权鉴定的方法，在如下(x1)-(x4)中的应用：(x1)个体识别；(x2)家系管理；(x3)种质资源鉴定；(x4)遗传多态性位点分析。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记，至少包含scaffold2072、scaffold341和scaffold1139三个位点，在给定候选双亲基因型，排除候选双亲的条件下，累计非父排除概率可达到99％，并且通过增加位点数量，还能够进一步提高各条件下的累积非父排除率。
本发明还提供了用于扩增上述SSR分子标记的引物组，可特异性的扩增出SSR分子标记中的各位点，以实现比对样本的SSR基因型。
本发明还提供了包含上述引物组的用于牦牛亲权鉴定的试剂盒及牦牛亲权鉴定的方法，鉴定准确并且鉴定效率高，可广泛应用于牦牛的个体识别，家系管理，种质资源鉴定和遗传多态性位点分析中。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[术语解释]
亲权鉴定(Parentage testing)，亲权鉴定亦称亲子鉴定，是将生物学、分子遗传学、医学方法结合起来，根据亲本与后代的形态结构和遗传物质进行遗传相似性分析，确定亲代与子代的关系。
微卫星(Microsatellite)，又称短串联重复序列(short Tandem Repeat，SSR)或简单重复序列(Simple Sequences Repeat，SSR)，由1-6个碱基对为核心单元进行串联重复构成。同一类微卫星DNA可分布在整个基因组不同位置，由于重复次数不用，或重复程度不完全，而形成每个座位的多态性。
最小等位基因频率(MAF)，指在给定群体中的最不常见的等位基因发生频率。
多态信息含量(Polymorphism information content，PIC)表示后代所获等位基因标记来自它的母亲或父亲的同一个等位标记的可能性，反映微卫星多态性高低的一个重要指标。多态信息含量公式如下：
I和j分别表示为第i和第j个等位基因；pi和pj分别表示第i和第j个等位基因频率；n表示某一位点的等位基因数；N表示群体中的个体数；ii表示第i个等位基因纯合的个体数；jn表示与i共显的第n个等位基因。
杂合度(Heterozygosity，H)表示微卫星座位在群体中为杂合子的比率，主要分为期望杂合度(Expectedheterozygosity，He)和观察杂合度(Observedheterozygosity，Ho)。Ho是指在一个群体中观察到的杂合个体总数与观察到的个体总数之比。He是在哈温平衡假设下杂合度的期望值，公式如下：
非父排除率(Probability of paternity exclution，PE)经过遗传标记检测后可以将不是生父的个体排除掉的概率叫作非父排除率，可以衡量每个遗传标记在亲权鉴定中的价值，PE的大小与被检测对象无关，与等位基因频率、等位基因数和系统遗传方式有关。
单个位点的非父排除率PE(只测父母的其中一个与子代)，计算公式如下：
pi为等位基因在群体中的频率，n为等位基因的数目。
累计非父排除率(Comulate PE，CPE)在亲权鉴定中大多使用多个遗传标记，如果各个遗传标记之间没有遗传连锁不平衡现象，累计非父排除率的公式如下。
m个位点累计非父排除率CPE为：
亲权指数(Paternity index，PI)即假设生物学父亲提供生父基因成为子代生父的可能性和随机雄性个体提供生父基因成为子代生父的可能性的比值，用来判定是否是亲生关系。
LOD值(Logarithm of the odds，优势对数值)：遗传学上通常用似然率的常用对数作为标准的衡量方法，确定两个基因座是否在染色体上距离很近，该值的对数值称为LOD值或优势对数值。在亲权鉴定中，每个候选亲本的总体似然率为每个位点似然率的乘积，通常用LOD值表示。本申请中运用LOD值作为亲子指数(Paternity index)的对数值，LOD值大于0的则表示与任意个体相比，候选亲本(Candidate parent)最有可能是真实的亲本；LOD值小于0表示与任意个体相比，候选亲本不可能是真实的亲本。
本发明提供了一种用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记，包括scaffold2072、scaffold341和scaffold1139，双亲累计排非父除率大于99％。
通过增加SSR分子标记中位点的数量，可以进一步增加双亲累计排除率，因此在一些可选的实施方式中，所述一组用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记还可以包括如下位点中的一个位点或者多个位点：scaffold879、scaffold2036、scaffold2058、scaffold1000、scaffold1649、scaffold4112、scaffold506、scaffold1645、scaffold2687、scaffold1210、scaffold547、scaffold1214、scaffold1343、scaffold1141、scaffold94、scaffold738和scaffold629。上述SSR分子标记的位点信息如表1和表2所示：
表1 SSR分子标记的位点信息
表2 SSR分子标记的遗传信息
在一些优选的实施方式中，一组用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记包括如下4个位点：scaffold2072、scaffold341、scaffold1139和scaffold879，在给定候选亲本和子代基因型的条件下，排出候选亲本的累计非父排除率可大于90％，同时在给定候选双亲基因型，排除候选双亲的条件下，累计非父排除概率可达到99％。
在一些更优选的实施方式中，一组用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记包括如下8个位点：scaffold2072、scaffold341、scaffold1139、scaffold879、scaffold2036、scaffold2058、scaffold1000和scaffold1649，在给定候选亲本和子代基因型，排出候选亲本的条件下，累计非父排除率可大于99％。
在更进一步优选的实施方式中，一组用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记共包括如下20个位点：scaffold2072、scaffold341、scaffold1139、scaffold879、scaffold2036、scaffold2058、scaffold1000、scaffold1649、scaffold4112、scaffold506、scaffold1645、scaffold2687、scaffold1210、scaffold547、scaffold1214、scaffold1343、scaffold1141、scaffold94、scaffold738和scaffold629，在给定候选亲本和子代基因型，排出候选亲本的条件下，累计非父排除率可大于99.99％。
在一些优选的实施方式中，scaffold2072可通过具有如SEQ ID NO.1所示序列和具有如SEQ ID NO.2所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold341可通过具有如SEQ ID NO.3所示序列和具有如SEQ ID NO.4所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold1139可通过具有如SEQ ID NO.5所示序列和具有如SEQ ID NO.6所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold879可通过具有如SEQ ID NO.7所示序列和具有如SEQ ID NO.8所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold2036可通过具有如SEQ ID NO.9所示序列和具有如SEQ ID NO.10所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold2058可通过具有如SEQ ID NO.11所示序列和具有如SEQ ID NO.12所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold1000可通过具有如SEQ ID NO.13所示序列和具有如SEQ ID NO.14所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold1649可通过具有如SEQ ID NO.15所示序列和具有如SEQ ID NO.16所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold4112可通过具有如SEQ ID NO.17所示序列和具有如SEQ ID NO.18所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold506可通过具有如SEQ ID NO.19所示序列和具有如SEQ ID NO.20所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold1645可通过具有如SEQ ID NO.21所示序列和具有如SEQ ID NO.22所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold2687可通过具有如SEQ ID NO.23所示序列和具有如SEQ ID NO.24所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold1210可通过具有如SEQ ID NO.25所示序列和具有如SEQ ID NO.26所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold547可通过具有如SEQ ID NO.27所示序列和具有如SEQ ID NO.28所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold1214可通过具有如SEQ ID NO.29所示序列和具有如SEQ ID NO.30所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold1343可通过具有如SEQ ID NO.31所示序列和具有如SEQ ID NO.32所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold1141可通过具有如SEQ ID NO.33所示序列和具有如SEQ ID NO.34所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold94可通过具有如SEQ ID NO.35所示序列和具有如SEQ ID NO.36所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold738可通过具有如SEQ ID NO.37所示序列和具有如SEQ ID NO.38所示序列的引物对扩增得到。
在一些优选的实施方式中，scaffold629可通过具有如SEQ ID NO.39所示序列和具有如SEQ ID NO.40所示序列的引物对扩增得到。
本发明还提供了用于扩增上述SSR分子标记的引物组，可特异性的扩增出SSR分子标记中的各位点，具有良好的特异性，包括如下引物对：
用于扩增scaffold2072的引物对，具有如SEQ ID NO.1所示序列和具有如SEQ IDNO.2所示序列；
用于扩增scaffold341的引物对，具有如SEQ ID NO.3所示序列和具有如SEQ IDNO.4所示序列；
用于扩增scaffold1139的引物对，具有如SEQ ID NO.5所示序列和具有如SEQ IDNO.6所示序列；
和/或如下引物对中的至少一对：
用于扩增scaffold879的引物对，具有如SEQ ID NO.7所示序列和具有如SEQ IDNO.8所示序列；
用于扩增scaffold2036的引物对，具有如SEQ ID NO.9所示序列和具有如SEQ IDNO.10所示序列；
用于扩增scaffold2058的引物对，具有如SEQ ID NO.11所示序列和具有如SEQ IDNO.12所示序列；
用于扩增scaffold1000的引物对，具有如SEQ ID NO.13所示序列和具有如SEQ IDNO.14所示序列；
用于扩增scaffold1649的引物对，具有如SEQ ID NO.15所示序列和具有如SEQ IDNO.16所示序列；
用于扩增scaffold4112的引物对，具有如SEQ ID NO.17所示序列和具有如SEQ IDNO.18所示序列；
用于扩增scaffold506的引物对，具有如SEQ ID NO.19所示序列和具有如SEQ IDNO.20所示序列；
用于扩增scaffold1645的引物对，具有如SEQ ID NO.21所示序列和具有如SEQ IDNO.22所示序列；
用于扩增scaffold2687的引物对，具有如SEQ ID NO.23所示序列和具有如SEQ IDNO.24所示序列；
用于扩增scaffold1210的引物对，具有如SEQ ID NO.25所示序列和具有如SEQ IDNO.26所示序列；
用于扩增scaffold547的引物对，具有如SEQ ID NO.27所示序列和具有如SEQ IDNO.28所示序列；
用于扩增scaffold1214的引物对，具有如SEQ ID NO.29所示序列和具有如SEQ IDNO.30所示序列；
用于扩增scaffold1343的引物对，具有如SEQ ID NO.31所示序列和具有如SEQ IDNO.32所示序列；
用于扩增scaffold1141的引物对，具有如SEQ ID NO.33所示序列和具有如SEQ IDNO.34所示序列；
用于扩增scaffold94的引物对，具有如SEQ ID NO.35所示序列和具有如SEQ IDNO.36所示序列；
用于扩增scaffold738的引物对，具有如SEQ ID NO.37所示序列和具有如SEQ IDNO.38所示序列；
用于扩增scaffold629的引物对，具有如SEQ ID NO.39所示序列和具有如SEQ IDNO.40所示序列。
在一些优选的实施方式中，所述引物对中的引物经过修饰和/或标记物标记；可根据后续试验的需求对引物进行修饰或添加标记物，例如对用于Q-PCR的引物可在引物末端添加荧光基团和猝灭基团；例如使用毛细管电泳检测PCR产物可在引物末端添加例如可以为但不限于为FAM、HEX、TAM或ROX的荧光染料等。所述修饰例如可以为但不限于为磷酸化修饰、内部氨基酸修饰和/或硫代修饰；所述标记物标记例如可以为但不限于为生物素标记、地高辛标记和/或荧光标记。
本发明还提供了一种用于牦牛亲权鉴定的试剂盒，该试剂盒包括上述引物对。在一些可选的实施方式中，所述试剂盒还包括用于扩增样品DNA的其他生物学领域可接受的其他试剂，例如Buffer，dNTP，DNA聚合酶，Syber Green染料等。
本发明还提供了一种牦牛亲权鉴定的方法，包括：提供待测样本的DNA，然后扩增待测样品的DNA的所述SSR分子标记，然后依据扩增结果进行基因分型，然后计算LOD值判断亲本与子代的亲权关系。
本发明还提供了一种上述SSR分子标记、上述引物对、上述试剂盒或上述牦牛亲权鉴定的方法的应用，可广泛应用于牦牛的个体识别，家系管理，种质资源鉴定和遗传多态性位点分析中，具有广泛的应用前景。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。
样本采集：颈静脉采取活体牦牛血液样本，添加血液抗凝剂EDTA后放入-80℃超低温冰箱冻存。样本主要分为两部分，其中，一部分为四川省阿坝州金川县的牧民散养，共73头，为随机选择，雌雄比例相近，这些样本用来测试筛选位点用于亲权鉴定的各项参数；另一部分为有明确记录的阳性样本，有6个家系，共18头(样本包括父、母、子代)，来自四川省龙日种蓄场，这些样本用来亲本分析，进行临床检验。
实施例1
微卫星引物设计：针对20个牦牛亲权鉴定微卫星位点，分别设计PCR扩增引物，并在每个正向引物的5’端用6-FAM荧光基团进行修饰用于荧光PCR分析。引物由派森诺生物工程股份有限公司合成，引物信息如表3所示。
表3引物信息
DNA提取：使用改良的缓冲液系统法提取牦牛血液样本的DNA，包括如下步骤：
(1)提取DNA所用的器材要经过高压灭菌，以防止杂质污染。
(2)将冻存血样放入37℃水浴锅中解冻。
(3)取3mL含抗凝剂的血液放入15mL离心管中，加入3mL细胞裂解液(Tris-Cl10mmol/L，pH8.0；EDTA0.1mol/LSDS 0.5％；不含DNase的胰RNase 20ug/ml)，充分混匀后，3600rpm离心2min，弃上清。注意混匀时尽量避免产生气泡。
(4)再次加入3mL细胞裂解液，充分混匀至无沉淀，3 600rpm离心2min，弃上清。
(5)按照10:1的比例混合缓冲液(Tris-Cl 100mmol/L,pH8.0；EDTA 50mmol/L,pH8.0；Nacl 500mmol/L)与蛋白酶K(20mg/mL)。
(6)加入1mL缓冲液与蛋白酶K的混合液，涡旋震荡至无团块，65℃水浴30分钟。
(7)加入1mL异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。
(8)3 600rpm离心8min，弃上清。将离心管倒置于干净滤纸上，确保沉淀存在。
(9)加入3mL 70％乙醇，涡旋震荡5s，3600rpm离心3min，弃上清。
(10)将离心管倒置于干净滤纸上5min，确保沉淀存在，然后空气干燥5min。
(11)加入300μL双蒸水，低速涡旋5s，65℃水浴加热1h溶解DNA。
荧光PCR：
使用荧光引物进行PCR，反应体系以及程序设定如表4和表5所示。
表4 PCR体系
表5 PCR程序
纯化：
(1)PCR结束以后，瞬离样品以除去管壁样品，随机挑取样品2μL进行凝胶电泳。以确定样品浓度、片段大小范围等。
(2)取一新的96孔板标明板号。根据电泳情况调整加样量(如有必要需稀释后加样)，加入冷的70％乙醇至终体积50μL，震荡充分混匀。
(3)3 700rpm/min，4℃离心30min，以纯化样品。倒置瞬离，以除去乙醇。静置15min待乙醇挥发干净。
毛细管电泳及分型：
(1)在乙醇已经挥发完全的板中加入内标LIZ500和Hi-Ditm Formamide，震荡充分混匀，瞬离以除去管壁样品。
(2)放入PCR仪，95℃、4min变性。
(3)放到ABI 3730XL遗传分析仪中进行毛细管电泳及分型。
数据分析：
待结果出来后用GeneMapper进行分析，得到相应的位点的片段大小和信号值。
然后使用Cervus 3.0软件分析等位基因个数(n)，多态信息含量(PIC)，期望杂合度(He)，表观杂合度(Ho)，第一非亲排除率(PE-1)，第二非亲排除率(PE-2)，以检验位点。
鉴定结果
20个微卫星位点的遗传多样性计算见表6，20个微卫星位点的等位基因数在4-8之间，均表现高度多态性。观察杂合度在0.411-0.836之间，平均观察杂合度为0.622，期望杂合度在0.588-0.806之间，平均观察杂合度为0.766，多态信息含量在0.491-0.769之间，平均多态信息含量为0.718。说明这20个位点在牦牛亲权鉴定中有较高的使用价值。
表6等位基因数、杂合度及多态信息含量
20个微卫星位点的排除概率和结合排除概率见表7，其中，PE-1：给定候选亲本与子代基因型，排除候选亲本的概率；PE-2：给定已知亲本基因型、候选亲本基因型和子代基因型，排除候选亲本的概率；PE-P：给定候选双亲基因型，排除候选双亲的概率。CPE-1、CPE-2、CPE-P分别为三种情况下的结合排除概率。
表7 20个位点的排除概率、结合排除概率
从表7可以看出，当所述一组用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记包括scaffold2072、scaffold341和scaffold1139时，其CPE-P大于99％，即3个位点就可以进行子代一亲本基因型已知情况下的亲权鉴定。
当所述一组用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记包括scaffold2072、scaffold341、scaffold1139和scaffold879时，CPE-1大于90％，同时CPE-P大于99％，提高了亲权鉴定的准确率。
当所述一组用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记包括scaffold2072、scaffold341、scaffold1139、scaffold879、scaffold2036、scaffold2058、scaffold1000和scaffold1649时，3种情况下的结合排除概率都大于99％。
实施例2阳性样本验证
阳性样本前期处理与前部分样本一致，即DNA提取、荧光PCR、纯化、毛细管电泳及分型，然后随机加入部分公牛数据与阳性公牛一起作为候选亲本，运用Cervus 3.0软件对其进行亲本分析，结合纸质记录，分析所筛选微卫星位点进行亲权鉴定的准确率。
对有明确记录的6个家系18个样本进行亲本分析结果见表8，运用Cervus 3.0软件中Analysis程序的Parentage Analysis模块进行数据分析，得到的LOD值作为亲子指数(Paternity index)的对数值，LOD值大于0的则表示与任意个体相比，候选亲本(Candidateparent)最有可能是真实的亲本；LOD值小于0表示与任意个体相比，候选亲本不可能是真实的亲本。Cervus会显示最可能的候选亲本。最终分析结果与记录结果一致，且LOD值均为正数，说明了用这些位点进行亲权鉴定的准确性，结果如表8所示。
表8亲本分析
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南民族大学
<120> 用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记、引物组及其应用
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (12)
1.一种用于牦牛亲权鉴定的SSR分子标记，其特征在于，所述SSR分子标记包括scaffold2072、scaffold341和scaffold1139；具有如下表所示的位点信息：
其中，scaffold2072由如SEQ ID NO.1所示序列和如SEQ ID NO.2所示序列的引物对扩增得到；
scaffold341由如SEQ ID NO.3所示序列和如SEQ ID NO.4所示序列的引物对扩增得到；
scaffold1139由如SEQ ID NO.5所示序列和如SEQ ID NO.6所示序列的引物对扩增得到。
2.根据权利要求1所述的SSR分子标记，其特征在于，所述SSR分子标记还包括scaffold879、scaffold2036、scaffold2058、scaffold1000、scaffold1649、scaffold4112、scaffold506、scaffold1645、scaffold2687、scaffold1210、scaffold547、scaffold1214、scaffold1343、scaffold1141、scaffold94、scaffold738和scaffold629中的一个或多个位点；具有如下表所示的位点信息：
其中，scaffold879由如SEQ ID NO.7所示序列和如SEQ ID NO.8所示序列的引物对扩增得到；
scaffold2036由如SEQ ID NO.9所示序列和如SEQ ID NO.10所示序列的引物对扩增得到；
scaffold2058由如SEQ ID NO.11所示序列和如SEQ ID NO.12所示序列的引物对扩增得到；
scaffold1000由如SEQ ID NO.13所示序列和如SEQ ID NO.14所示序列的引物对扩增得到；
scaffold1649由如SEQ ID NO.15所示序列和如SEQ ID NO.16所示序列的引物对扩增得到；
scaffold4112由如SEQ ID NO.17所示序列和如SEQ ID NO.18所示序列的引物对扩增得到；
scaffold506由如SEQ ID NO.19所示序列和如SEQ ID NO.20所示序列的引物对扩增得到；
scaffold1645由如SEQ ID NO.21所示序列和如SEQ ID NO.22所示序列的引物对扩增得到；
scaffold2687由如SEQ ID NO.23所示序列和如SEQ ID NO.24所示序列的引物对扩增得到；
scaffold1210由如SEQ ID NO.25所示序列和如SEQ ID NO.26所示序列的引物对扩增得到；
scaffold547由如SEQ ID NO.27所示序列和如SEQ ID NO.28所示序列的引物对扩增得到；
scaffold1214由如SEQ ID NO.29所示序列和如SEQ ID NO.30所示序列的引物对扩增得到；
scaffold1343由如SEQ ID NO.31所示序列和如SEQ ID NO.32所示序列的引物对扩增得到；
scaffold1141由如SEQ ID NO.33所示序列和如SEQ ID NO.34所示序列的引物对扩增得到；
scaffold94由如SEQ ID NO.35所示序列和如SEQ ID NO.36所示序列的引物对扩增得到；
scaffold738由如SEQ ID NO.37所示序列和如SEQ ID NO.38所示序列的引物对扩增得到；
scaffold629由如SEQ ID NO.39所示序列和如SEQ ID NO.40所示序列的引物对扩增得到。
3.根据权利要求2所述的SSR分子标记，其特征在于，还包括scaffold879。
4.根据权利要求3所述的SSR分子标记，其特征在于，还包括scaffold2036、scaffold2058、scaffold1000和scaffold1649中的一个或几个位点。
5.根据权利要求4所述的SSR分子标记，其特征在于，还包括scaffold2036、scaffold2058、scaffold1000和scaffold1649。
6.根据权利要求4所述的SSR分子标记，其特征在于，还包括scaffold4112、scaffold506、scaffold1645、scaffold2687、scaffold1210、scaffold547、scaffold1214、scaffold1343、scaffold1141、scaffold94、scaffold738和scaffold629中的一个或几个位点。
7.根据权利要求6所述的SSR分子标记，其特征在于，还包括scaffold4112、scaffold506、scaffold1645、scaffold2687、scaffold1210、scaffold547、scaffold1214、scaffold1343、scaffold1141、scaffold94、scaffold738和scaffold629。
8.用于扩增权利要求1-7中任一项所述的SSR分子标记的引物组，其特征在于，包括如下引物对：
用于扩增scaffold2072的引物对，序列如SEQ ID NO.1所示和如SEQ ID NO.2所示；
用于扩增scaffold341的引物对，序列如SEQ ID NO.3所示和如SEQ ID NO.4所示；
用于扩增scaffold1139的引物对，序列如SEQ ID NO.5所示和如SEQ ID NO.6所示；
和/或，序列如下引物对中的至少一对：
用于扩增scaffold879的引物对，序列如SEQ ID NO.7所示和如SEQ ID NO.8所示；
用于扩增scaffold2036的引物对，序列如SEQ ID NO.9所示和如SEQ ID NO.10所示；
用于扩增scaffold2058的引物对，序列如SEQ ID NO.11所示和如SEQ ID NO.12所示；
用于扩增scaffold1000的引物对，序列如SEQ ID NO.13所示和如SEQ ID NO.14所示；
用于扩增scaffold1649的引物对，序列如SEQ ID NO.15所示和如SEQ ID NO.16所示；
用于扩增scaffold4112的引物对，序列如SEQ ID NO.17所示和如SEQ ID NO.18所示；
用于扩增scaffold506的引物对，序列如SEQ ID NO.19所示和如SEQ ID NO.20所示；
用于扩增scaffold1645的引物对，序列如SEQ ID NO.21所示和如SEQ ID NO.22所示；
用于扩增scaffold2687的引物对，序列如SEQ ID NO.23所示和如SEQ ID NO.24所示；
用于扩增scaffold1210的引物对，序列如SEQ ID NO.25所示和如SEQ ID NO.26所示；
用于扩增scaffold547的引物对，序列如SEQ ID NO.27所示和如SEQ ID NO.28所示；
用于扩增scaffold1214的引物对，序列如SEQ ID NO.29所示和如SEQ ID NO.30所示；
用于扩增scaffold1343的引物对，序列如SEQ ID NO.31所示和如SEQ ID NO.32所示；
用于扩增scaffold1141的引物对，序列如SEQ ID NO.33所示和如SEQ ID NO.34所示；
用于扩增scaffold94的引物对，序列如SEQ ID NO.35所示和如SEQ ID NO.36所示；
用于扩增scaffold738的引物对，序列如SEQ ID NO.37所示和如SEQ ID NO.38所示；
用于扩增scaffold629的引物对，序列如SEQ ID NO.39所示和如SEQ ID NO.40所示。
9.根据权利要求8所述的引物对，其特征在于，所述引物对中的引物经过修饰和/或经过标记物标记；
所述修饰包括：磷酸化修饰、内部氨基酸修饰和/或硫代修饰；
所述标记物标记包括：生物素标记、地高辛标记和/或荧光标记。
10.一种用于牦牛亲权鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求8或9所述的引物对。
11.一种牦牛亲权鉴定的方法，其特征在于，包括：提供待测样本的DNA，然后扩增待测样品的DNA的SSR分子标记，然后依据扩增结果进行基因分型，再计算LOD值判断亲本与子代的亲权关系；
若LOD值大于0，则表示与任意个体相比，候选亲本是真实的亲本；若LOD值小于0表示与任意个体相比，候选亲本不是真实的亲本；
所述SSR分子标记包括权利要求1-7中任一项所述的SSR分子标记。
12.权利要求1-7中任一项所述的SSR分子标记、权利要求8或9所述的引物对、权利要求10所述的试剂盒或权利要求11所述的牦牛亲权鉴定的方法，在如下(x1)-(x4)中的应用：
(x1)个体识别；
(x2)家系管理；
(x3)种质资源鉴定；
(x4)遗传多态性位点分析。
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| 微卫星DNA在牦牛亲权鉴定中的应用研究;张浩等;《畜牧与饲料科学》;20141231;第35卷(第6期);第56-58页 |
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