CN104988148A - 一种沼泽型水牛ssr引物及其应用 - Google Patents
一种沼泽型水牛ssr引物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104988148A CN104988148A CN201510426680.8A CN201510426680A CN104988148A CN 104988148 A CN104988148 A CN 104988148A CN 201510426680 A CN201510426680 A CN 201510426680A CN 104988148 A CN104988148 A CN 104988148A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffalo
- ssr
- primer
- type water
- swamp type
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241000740650 Bubalus carabanensis Species 0.000 claims description 52
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 claims description 5
- 241000030939 Bubalus bubalis Species 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 abstract description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 2
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000969780 Eleotris picta Species 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 235000020246 buffalo milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000026686 chromosomal inheritance Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000001324 spliceosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种沼泽型水牛SSR引物及其应用，通过构建沼泽型水牛Unigene序列，结合Perl编程语言方法，进行SSR序列查找和SSR标记引物设计，以沼泽型水牛基因组DNA为材料，对设计的SSR引物进行验证，从17201对引物中随机筛选了115对引物对7个水牛品种35头个体基因组DNA进行了验证，其中69对引物表现出多态性并可以成功区分不同地理来源的水牛材料。本发明可为水牛分子标记辅助育种提供新的分子标记，为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。
Description
【技术领域】
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及沼泽型水牛SSR引物在检测不同水牛品种遗传多样性中的应用。
【背景技术】
据FAO 2013年的统计数据显示，2011年底我国水牛存栏量为2338.2万头，仅次于印度11291.6万头和巴基斯坦3172.6万头，位居世界第三，可谓资源丰富。中国水牛属于沼泽型类型，具有耐粗饲、役力大、耐湿、耐高温、抗病力强等生物学特点，是我国南方地区重要的畜种，其资源丰富，奶质优良，营养丰富，具有“奶中之王”之美称。但我国水牛产奶量较低，其泌乳性能远低于世界著名的三大河流型水牛品种(摩拉、尼里-拉菲和地中海水牛)。为提升本地水牛的泌乳性能，我国自上世纪50年代和70年代分别从印度和巴基斯坦引进摩拉和尼里-拉菲水牛加以改良，并取得了较大成效。尽管其产奶量得到了较大的提高，但仍存在着明显的差异。因此，开发先进的分子标记辅助选择技术应用于优良的奶水牛品种选育，对于改善水牛种质资源的创新与利用，尤其是有效的提高选种效率具有重要的意义。
分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性直接的反映，可广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等研究领域。微卫星标记，又称简单重复序列(SSR)，均匀分布于真核生物基因组中，由1-6个核苷酸的串联重复片段构成。由于SSR重复基序和重复次数的不同使其在个体间呈高度变异性，且数量丰富，被广泛应用与遗传杂交育种、绘制染色体遗传图谱等领域。与其他的分子标记(RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等)相比，SSR标记具有多态性信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好和特异性强等特点。
目前，SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和转录组SSR(EST-SSR)，且后者比前者更具有经济和效率。由于EST-SSR来源于DNA的转录区域，还比前者更具通用性。传统的SSR标记开发，一般使用文库筛选、磁珠富集法以及EST数据库挖掘等手段，存在着费时费力、开发成本高等不足。尤其是第三种方法严重依赖于NCBI中EST数据库，对于尚未公布基因组测序信息的物种而言，其应用是有限的。但随着第二代测序技术的成熟，以及转录组测序数据信息的与日俱增，使其成为了开发EST-SSR的重要手段，并具有方便、快捷、准确且成本低廉等优势。目前，沼泽型水牛尚无全基因组序列信息，且SSR引物数量又少。显然，不依赖于参考基因组的转录组测序可成为大规模开发沼泽型水牛SSR引物的重要方法，利用该技术构建沼泽型水牛转录本，并以转录本为参考，组建unigene序列，进行后续的SSR挖掘。鉴定出有效的沼泽型水牛SSR标记，对于沼泽型水牛重要经济性状相关基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种等研究具有重要的科学意义。
【发明内容】
本发明提供了一种沼泽型水牛SSR引物及其应用，本发明通过构建相应的SSR引物，对水牛个体的基因组DNA进行SSR扩增，通过扩增产物分析沼泽型水牛的遗传多样性，为沼泽型水牛的重要经济性状相关基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种等研究提供新的思路。本发明所采取技术方案是：沼泽型水牛SSR引物在检测不同水牛品种遗传多样性中的应用，所述方法包括以下步骤：
1)沼泽型水牛SSR引物的获得：分别提取沼泽型水牛各组织器官的总RNA，利用转录组测序获得沼泽型水牛转录组的Raw Reads，构建沼泽型水牛Unigene序列，对Unigene进行SSR位点的检索，再对含有SSR位点信息的Unigene序列进行引物设计，获得一系列沼泽型水牛SSR引物；
2)实验材料：随机选取7个水牛品种35头个体作为模板，即摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、西林水牛、富钟水牛、贵州水牛、德昌水牛和德宏水牛，用于检测沼泽型水牛SSR引物在不同水牛品种遗传多样性分析中的有效性；
3)血液基因组DNA提取：针对每一头水牛个体，颈静脉取血5mL，采用动物血液基因组DNA试剂盒(天根，北京)制备每一头水牛个体的基因组DNA。利用Nanodrop2000和1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA样本质控；
4)SSR引物扩增：根据上述筛选的SSR引物，针对上述35头水牛个体基因组DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系(20.0μL)为：DNA模板1.0μL，引物混合物1.0μL，Premix rTaq 10.0μL，双蒸水8.0μL.PCR反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒,58℃～60℃退火30秒,72℃延伸30秒,循环35次；72℃延伸8分钟；
5)SSR扩增产物检测及片段大小判读：针对每一份PCR产物取10.0μL，以1：3的比例加入双蒸水进行稀释。根据HT DNA 5K Reagent Kit(PerkinElmer,USA)的操作说明进行上机前的胶、Marker和Ladder等试剂的灌注,之后利用LabChip GX生物大分子分析仪(PerkinElmer,USA)检测PCR产物并判读片段大小；
6)沼泽型水牛SSR引物遗传多样性分析：采用PowerMarker 3.25软件分析35头水牛个体的等位基因数(NA)、期望杂合度(HE)、观察杂合度(HO)和多态性信息含量(PIC)等遗传参数信息，同时计算出Nei遗传距离参数；以UPGMA算法对供试材料进行聚类分析。
本发明的优点：本发明方法具有高效、便捷、准确且成本低廉等优势，利用本发明可为水牛分子标记辅助育种提供新的分子标记，为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。
附图说明
图1为本发明实施例2中沼泽型水牛SSR密度分布图。
图2为本发明实施例2中沼泽型水牛SSR重复单元类型和数量。
图3为本发明实施例2中沼泽型水牛SSR引物扩增情况。
图4为本发明实施例3中7个水牛品种的聚类分析图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1沼泽型水牛Unigene序列获得及SSR引物设计
一、沼泽型水牛Unigene序列获得
1、RNA样本制备：屠宰沼泽型母水牛和公牛各1头，采集心、脑、肺、肾脏、脂肪、肝脏、脾脏、子宫、卵巢、睾丸和乳腺11个组织，立即置于液氮里，速冻后置于-80℃超低温冰箱保存。采用Trizol试剂分别提取各组织样本总RNA，取每个样本1.5μg，构建一个总量为16.5μg的样本混合池。
2、cDNA建库：以Dynabeads mRNA DIRECT Kit(Invitrogen，USA)从总RNA中抽提mRNA，mRNA总量大于100ng是可以正常建库(200ng以内)，利用物理法打断mRNA样本，以随机引物反转录合成cDNA第一链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过Qiaquick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加A并连接测序接头，连接产物纯化回收后做PCR扩增，PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶选择400～500bp目的条带，胶回收产物即为终文库，同时以qPCR方法对该文库进行质控。之后用Illumina HiSeqTM 2000测序平台对上述终文库进行测序。
3、沼泽型水牛Unigene序列组装：针对测序获得的转录组Raw Reads(见表1)，采用Trinity(版本：v2014-07-17；参数为默认参数)软件对序列进行组装，组装分为3个过程：Inchworm assembly：将测序reads构建k-mer库，根据k-mer的overlap通过greedy K-mer extension构建contigs；Chrysalis：对Inchworm的contigs基于k-mer-1的overlap及Reads支持进行聚类，可以聚类到一起的contigs簇作为component构建deBruijn graphs，将测序数据比对结合到deBruijn graphs中；Butterfly：根据Chrysalis组件信息重头构建转录本及基因的不同转录本的剪接体，得到transcripts序列。最后，我们依据component信息得到对应物种的Unigene序列数据，并以fasta格式保存，以便于后续的注释及表达分析。
表1沼泽型水牛转录组测序数据概况
二、SSR引物的识别
1.安装Perl语言：从网站https://www.perl.org/get.html下载ActivePerl 5.20.2版本并运行；
2.安装MISA软件：从网站http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/下载MISA.Pl和MISA.ini文件，并复制到C:\Perl64\bin文件夹下面；
3.SSR引物识别：首先将上述中Trinity软件组装的Trinity.fasta文件复制到C：\Perl64\bin文件夹下面，然后在Perl环境下运行命令为C：\Perl64\bin\perl misa.pl Trinity.fasta(参数：默认)，运行后产生Trinity.fasta.misa和Trinity.fasta.statistics两个文件，其中Trinity.fasta.statistics用以获得一系列沼泽型水牛SSR引物，Trinity.fasta.misa可用于后续引物设计；
三、SSR引物的设计
1.Primer3软件的安装：从网站http://primer3.sourceforge.net/releases.php下载Primer3Version 2.3.6,解压后并重命名文件夹为Primer3，然后复制到C:\Perl64\bin文件夹下面；从网站http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/primer3.html下载p3_in.pl和p3_out.pl文件并复制到C:\Perl64\bin文件夹下面；
2.应用p3_in.pl语句产生Primer3输入文件：在Perl环境下运行命令为C:\Perl64\bin\perlp3_in.pl Trinity.fasta.misa，运行之后产生一个名为Trinity.fasta.p3in文件，即为Primer3输入文件，之后将Trinity.fasta.p3in复制到C:\Perl64\bin\Primer3根目录下，为产生Primer3输出文件提供数据支持；
3.应用primer3_core语句产生Primer3输出文件：在Perl环境下运行命令为：C:\Perl64\bin\Primer3\primer3_core Trinity.fasta.p3out Trinity.fasta.p3in，产生一个名为Trinity.fasta.p3out的文件，即为Primer3输出文件，同时将该文件复制到C:\Perl64\bin\根目录下，便于SSR引物设计的结果产生；
4.应用p3_out.pl语句产生SSR引物设计结果：在Perl环境下运行命令：C:\Perl64\bin\perlp3_out.pl Trinity.fasta.p3out Trinity.fasta.misa，运行之后便得到Trinity.fasta.results文件，此即为设计好的引物。
实施例2沼泽型水牛SSR位点的挖掘
采用上述方法进行沼泽型水牛组织高通量测序，采用Trinity软件(默认参数)组装沼泽型水牛Unigene序列，共计86021条(见表2)，为下一步鉴定沼泽型水牛SSR引物提供有效的试验数据。在Perl语言采用MISA 1.0软件检索沼泽型水牛SSR引物，结果显示沼泽型水牛SSR引物密度分布出现频率最高的是单碱基微卫星，其次是二碱基微卫星(见表3，图1和图2)。
表2沼泽型水牛Unigene序列概况
表3 SSR引物重复基序统计情况
在Perl语言环境下采用Primer3.0软件(默认参数)批量设计沼泽型水牛SSR引物17201对。从中随机挑选了115对引物，对沼泽型水牛血液基因组DNA进行了PCR扩增。结果表明，共有110对引物检测出特异性条带，证实引物设计成果率较高(见图3)。
实施例3利用SSR引物对8个水牛品种进行多态性鉴定
一、实验材料：随机选取7个水牛品种35头个体作为模板，即摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、西林水牛、富钟水牛、贵州水牛、德昌水牛和德宏水牛，用于检测沼泽型水牛SSR引物在不同水牛品种遗传多样性分析中的有效性，具体材料信息见表4。
表4沼泽型水牛遗传多样性分析的品种信息
二、血液基因组DNA提取：针对每一头水牛个体，颈静脉取血5mL，采用动物血液基因组DNA试剂盒(天根，北京)制备每一头水牛个体的基因组DNA。利用Nanodrop2000和1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA样本的质控。
三、SSR引物扩增：利用实施例2中筛选的SSR引物，针对上述35头水牛个体基因组DNA进行PCR扩增。具体的扩增体系如下：
20.0μL PCR扩增体系为：DNA模板1.0μL，引物混合物1.0μL，Premix rTaq 10.0μL，双蒸水8.0μL。
在ABI PCR仪上进行PCR反应：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒,58℃～60℃退火30秒,72℃延伸30秒,循环35次；72℃延伸8分钟。
四、SSR扩增产物检测及片段大小判读：
1、PCR产物稀释：针对每一份PCR产物，利用移液器分别取10.0μL置于Bio-Rad 384孔板，并以1：3的比例加入双蒸水进行稀释。
2、Gel-Dye试剂配置：根据HT DNA 5K Reagent Kit(PerkinElmer,USA)的操作说明，在l.0mL的Gel中加入13μL的DNA Dye，涡旋混匀之后置于过滤柱中，室温下9200RCF离心7.5分钟。
3、灌胶：在DNA 5K芯片的3、7、8和10号孔中，分别注入75μL、75μL、75μL和120μL的Gel-Dye胶。在4号孔中加入120μL的DNA marker。
4、Ladder和Buffer准备：将12μL的DNA Ladder加入到108μL双蒸水当中，并置于0.2mL的Ladder管；加入750μL双蒸水于Buffer管中，用于后续试验操作；
5、上机：将灌好胶的DNA 5K芯片置于芯片槽，含DNA样本的Bio-Rad 384孔板放在样品槽，而Ladder管和Buffer管分别置于A孔和B孔，就绪后可以启动程序，等待检测结束。
6、结果分析：利用LabChip GX生物大分子分析仪(PerkinElmer,USA)自带软件分析PCR产物扩增结果，使用者可以有效的观察到每一份PCR产物的峰图和电泳图，根据SSR预期大小，判读PCR片段大小是否有效，便于后续试验分析。
五、沼泽型水牛SSR引物遗传多样性分析：
1、根据实施例中步骤(四)的检测结果，直接读取PCR片段的bp大小。采用PowerMarker 3.25软件分析69对SSR引物在35头水牛个体中的等位基因数(NA)、期望杂合度(HE)、观察杂合度(HO)和多态性信息含量(PIC)等遗传参数信息(见表5)，同时计算出Nei遗传距离参数(见表6)；
表5 69对沼泽型水牛SSR引物特征概况
表67个水牛品种Nei遗传距离
2、以UPGMA算法对供试材料进行聚类分析，聚类分析结果见图4，结果表明河流型水牛群体和沼泽型水牛群体各聚一类，其中沼泽型德宏水牛和德昌水牛聚为一亚类，其他沼泽型水牛类型则没有明显聚类。说明水牛群体各个品种间具有丰富的多样性以及遗传上的相似性。
Claims (5)
1.一种沼泽型水牛SSR引物，其特征在于：所述SSR引物的序列如SEQ ID NO.1～138所示。
2.如权利要求1所述的沼泽型水牛SSR引物的应用，其特征在于：该引物用于检测不同水牛品种遗传多样性。
3.如权利要求2所述的沼泽型水牛SSR引物的应用，其特征在于：该引物用于检测不同水牛品种遗传多样性的方法包括以下步骤：
1)沼泽型水牛SSR引物的获得：分别提取沼泽型水牛各组织器官的总RNA，利用转录组测序获得沼泽型水牛转录组的Raw Reads，构建沼泽型水牛Unigene序列，对Unigene进行SSR位点的检索，再对含有SSR位点信息的Unigene序列进行引物设计，获得一系列沼泽型水牛SSR引物；
2)血液基因组DNA提取：随机选取7个水牛品种，采集其血样并提取基因组DNA；.
3)SSR引物扩增：根据上述筛选的SSR引物，针对上述水牛个体基因组DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系为：DNA模板1.0μL，引物混合物1.0μL，Premix rTaq 10.0μL，双蒸水8.0μL.PCR反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒,58℃～60℃退火30秒,72℃延伸30秒,循环35次；72℃延伸8分钟。
4)SSR扩增产物检测及片段大小判读：针对每一份PCR产物取10.0μL，以1：3的比例加入双蒸水进行稀释。根据HT DNA 5K Reagent Kit的操作说明进行上机前的胶、Marker和Ladder等试剂的灌注,之后利用LabChip GX生物大分子分析仪检测PCR产物并判读片段大小。
5)沼泽型水牛SSR引物遗传多样性分析：采用PowerMarker 3.25软件分析35头水牛个体的等位基因数(NA)、期望杂合度(HE)、观察杂合度(HO)和多态性信息含量(PIC)等遗传参数信息，同时计算出Nei遗传距离参数；以UPGMA算法对供试材料进行聚类分析。
4.如权利要求3所述的沼泽型水牛SSR引物在检测不同水牛品种遗传多样性中的应用，其特征在于：在步骤3)中，SSR扩增的PCR反应条件为95℃预变性3分钟；95℃变性30秒,58℃～60℃退火30秒,72℃延伸30秒,循环35次；72℃延伸8分钟。
5.如权利要求3所述的沼泽型水牛SSR引物在检测不同水牛品种遗传多样性中的应用，其特征在于：在步骤2)中，所述水牛品种为摩拉水牛、尼里水牛、西林水牛、富钟水牛、贵州水牛、德昌水牛和德宏水牛。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510426680.8A CN104988148B (zh) | 2015-07-20 | 2015-07-20 | 一种沼泽型水牛ssr引物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510426680.8A CN104988148B (zh) | 2015-07-20 | 2015-07-20 | 一种沼泽型水牛ssr引物及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104988148A true CN104988148A (zh) | 2015-10-21 |
| CN104988148B CN104988148B (zh) | 2017-12-15 |
Family
ID=54300043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510426680.8A Active CN104988148B (zh) | 2015-07-20 | 2015-07-20 | 一种沼泽型水牛ssr引物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104988148B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106222271A (zh) * | 2016-08-03 | 2016-12-14 | 苏州大学 | 一种微卫星遗传标记监测鱖种质的方法 |
| CN108998549A (zh) * | 2018-09-26 | 2018-12-14 | 西南民族大学 | 用于牦牛亲权鉴定的ssr分子标记、引物组及其应用 |
| CN110628917A (zh) * | 2019-09-27 | 2019-12-31 | 北部湾大学 | 一种中国鲎ssr引物组及其应用 |
| CN112634983A (zh) * | 2021-01-08 | 2021-04-09 | 江苏先声医疗器械有限公司 | 病原物种特异pcr引物优化设计方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101058831A (zh) * | 2007-04-23 | 2007-10-24 | 中国科学院南海海洋研究所 | 太平洋牡蛎est微卫星标记的筛选方法 |
| CN101565705A (zh) * | 2008-04-22 | 2009-10-28 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 日本血吸虫微卫星位点及其应用 |
| CN101684481A (zh) * | 2009-03-30 | 2010-03-31 | 电子科技大学 | 丹参est-ssr分子标记的制备方法、特异引物及其应用 |
| CN103484459A (zh) * | 2013-10-14 | 2014-01-01 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 青虾est-ssr分子标记的引物组、标记方法及应用 |
| CN103642912A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-03-19 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 基于转录组测序开发绿豆ssr引物的方法 |
| CN104293778A (zh) * | 2014-07-01 | 2015-01-21 | 浙江省农业科学院 | 兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒 |
-
2015
- 2015-07-20 CN CN201510426680.8A patent/CN104988148B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101058831A (zh) * | 2007-04-23 | 2007-10-24 | 中国科学院南海海洋研究所 | 太平洋牡蛎est微卫星标记的筛选方法 |
| CN101565705A (zh) * | 2008-04-22 | 2009-10-28 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 日本血吸虫微卫星位点及其应用 |
| CN101684481A (zh) * | 2009-03-30 | 2010-03-31 | 电子科技大学 | 丹参est-ssr分子标记的制备方法、特异引物及其应用 |
| CN103484459A (zh) * | 2013-10-14 | 2014-01-01 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 青虾est-ssr分子标记的引物组、标记方法及应用 |
| CN103642912A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-03-19 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 基于转录组测序开发绿豆ssr引物的方法 |
| CN104293778A (zh) * | 2014-07-01 | 2015-01-21 | 浙江省农业科学院 | 兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| QIULIANG YAN 等: "Identification of microsatellites in cattle unigenes", 《JOURNAL OF GENETICS AND GENOMICS》 * |
| 黄心尧 等: "EST及EST-SSR分子标记应用", 《畜禽业》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106222271A (zh) * | 2016-08-03 | 2016-12-14 | 苏州大学 | 一种微卫星遗传标记监测鱖种质的方法 |
| CN108998549A (zh) * | 2018-09-26 | 2018-12-14 | 西南民族大学 | 用于牦牛亲权鉴定的ssr分子标记、引物组及其应用 |
| CN108998549B (zh) * | 2018-09-26 | 2019-07-12 | 西南民族大学 | 用于牦牛亲权鉴定的ssr分子标记、引物组及其应用 |
| CN110628917A (zh) * | 2019-09-27 | 2019-12-31 | 北部湾大学 | 一种中国鲎ssr引物组及其应用 |
| CN110628917B (zh) * | 2019-09-27 | 2022-06-14 | 北部湾大学 | 一种中国鲎ssr引物组及其应用 |
| CN112634983A (zh) * | 2021-01-08 | 2021-04-09 | 江苏先声医疗器械有限公司 | 病原物种特异pcr引物优化设计方法 |
| CN112634983B (zh) * | 2021-01-08 | 2021-07-09 | 江苏先声医疗器械有限公司 | 病原物种特异pcr引物优化设计方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104988148B (zh) | 2017-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Transcriptome sequencing of mung bean (Vigna radiate L.) genes and the identification of EST-SSR markers | |
| CN107345256A (zh) | 一种基于转录组测序开发山黧豆est‑ssr引物组及方法和应用 | |
| CN104988148B (zh) | 一种沼泽型水牛ssr引物及其应用 | |
| Kiethega et al. | RNA-level unscrambling of fragmented genes in Diplonema mitochondria | |
| Liang et al. | De novo transcriptome assembly of pummelo and molecular marker development | |
| CN104673884B (zh) | 利用全基因组和est数据开发多态性est‑ssr标记的方法 | |
| CN109706231B (zh) | 一种用于凡纳滨对虾分子育种的高通量snp分型方法 | |
| CN103667275A (zh) | 油茶ssr分子标记 | |
| CN105238781A (zh) | 基于转录组序列开发的李ssr标记引物对及其应用 | |
| CN113667760B (zh) | 一种评估黄鳍鲷种群遗传多样性的ssr标记引物和方法 | |
| CN109337997B (zh) | 一种山茶属多态性叶绿体基因组微卫星分子标记引物及筛选和甄别近缘种的方法 | |
| CN109112217A (zh) | 一种与猪体长和乳头数显著关联的遗传标记及应用 | |
| CN117965781A (zh) | 一种花生40K液相SNP芯片“PeanutGBTS40K”及其应用 | |
| CN105624322A (zh) | 一种开发黄姑鱼ssr分子标记用于种群鉴定方法 | |
| Khaldi et al. | Genetic characterization of three ovine breeds in Tunisia using randomly amplified polymorphic DNA markers | |
| CN110106279A (zh) | 基于老芒麦基因组序列开发的单位点ssr引物组及其应用 | |
| CN117487933A (zh) | 一种评估绿鳍马面鲀种群遗传多样性的ssr标记引物、方法及应用 | |
| CN107365839A (zh) | 一种用于鹿科动物鉴定的引物及其应用 | |
| CN103589716B (zh) | 猪sncg基因的一个可用于溯源的snp分子标记及其检测方法 | |
| CN107365840A (zh) | 基于dna条形码的鹿科动物快速鉴定试剂盒及其应用 | |
| CN117051151A (zh) | 一种辣椒5k液相芯片及其应用 | |
| Ramadan et al. | Biological Identifications through DNA barcodes | |
| CN106367498A (zh) | 美洲大蠊微卫星位点及其应用 | |
| CN105543403A (zh) | 水牛泌乳相关基因Leptin作为分子标记的方法及其应用 | |
| Emil et al. | Genetic characterization of Romanian local breeds using microsatellite markers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20151021 Assignee: Cenxi Longyuan Breeding Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION BUFFALO INSTITUTE Contract record no.: X2023980046140 Denomination of invention: A SSR primer for swamp buffalo and its application Granted publication date: 20171215 License type: Common License Record date: 20231108 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |