CN103484459A - 青虾est-ssr分子标记的引物组、标记方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及淡水经济甲壳动物青虾EST微卫星标记（EST-SSR）的筛选和应用。可以利用该EST-SSR标记技术研究青虾选育群体的遗传特征和群体结构，实现分子标记在青虾育种中的初步应用，为构建高密度青虾遗传连锁图片、QTL定位重要经济性状进行分子标记辅助育种奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及淡水经济甲壳动物青虾（日本沼虾，Macrobrachium nipponense）EST（expressed sequence tags, ESTs）微卫星标记（EST-SSR）的筛选和应用。
背景技术
青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense) ，隶属十足目（Decapoda），长臂虾科（Palaemonidae）、沼虾属（Macrobrachium），广泛分布于中国、日本、韩国、越南、缅甸等亚洲国家，具有营养价值高、生长快、适应能力强等特点，深受广大消费者的欢迎，是重要的经济养殖虾类。我国目前有18个省市（区）进行青虾养殖，其养殖面积居淡水虾类第一位。《中国渔业年鉴》2011年统计数据显示，青虾在我国养殖年产量约23.02万吨，养殖年产值超过100亿元。但目前养殖的青虾大多数为未经系统遗传选育的野生种在池塘多代养殖的后代，随着青虾养殖业的高速增长，集约化程度的不断提高，近年来出现了严重的品种退化现象，严重制约了青虾养殖业的发展。要实现青虾养殖的可持续发展，必须对青虾进行遗传改良。目前，国内渔业遗传改良方法主要以群体选育为主。采用该种方法得到的后代个体亲缘关系不明，因此需要更精确的分子水平方法辅助进行有效鉴别，从而能建立选育群体的谱系，有效减少近交，即分子标记辅助育种方法。
EST是短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一部分。近年来，大量数据库中EST数量迅速增长，其中大量EST中含有微卫星序列（microsatellite，又叫simple sequence repeats，SSR），为EST-SSR标记的开发提供了丰富的序列资源。由于EST-SSR标记开发是基于基因组中的表达序列，与普通基因组微卫星标记（genomic-SSR，gSSR）相比具有信息量大、通用性好、开发简单快捷、费用低等优点，更重要的是，该标记能直接和功能基因相关，在分子标记辅助育种的相关研究如遗传连锁图构建、重要性状相关标记关联分析、分离和鉴定新基因等中都有极高的应用价值。
目前青虾EST数据库中包含大量EST序列，已有报道从这些序列中克隆得到多个性别、生殖、发育等相关基因，而从青虾EST文库中筛选多态微卫星标记的方法至今没有报道。
发明内容
本发明利用生物学信息学方法从青虾促雄腺转录组文库（http://www.ffrc.cn/gene/list.asp）中搜索EST微卫星序列，并筛选具有多态的微卫星引物，找到青虾EST-SSR标记的特异引物，为青虾的青虾群体遗传多样性分析提供可用的分子标记。进一步可以利用该EST-SSR标记技术研究青虾选育群体的遗传特征和群体结构，实现分子标记在青虾育种中的初步应用，为构建高密度青虾遗传连锁图片、QTL定位重要经济性状进行分子标记辅助育种奠定基础。具体的技术方案是：
一种青虾EST-SSR分子标记的引物组，其特征在于，包括有如下3个位点所对应的正向和反向引物：
EWXM33
F: AACATTCACTGGCTCTTCG(SEQ ID NO.1)
R: CCACTACTGTTTCTATCCACC(SEQ ID NO.2)
EWXM62
F:GCTTGTAGAAACCCGTAG(SEQ ID NO.3)
R:CTCTGACCTGCTTAGAAAA(SEQ ID NO.4)
EWXM147
F:ATTGTCGTAGGCTCACGT(SEQ ID NO.5)
R:AAAATTGGTCTTGCTCCC(SEQ ID NO.6)
本发明还提供了一种基于上述EST-SSR分子标记的引物组的青虾分子标记方法，包括如下步骤：
第1步、提取青虾样本的DNA；
第2步、使用分子标记引物组对青虾样本进行PCR扩增；
第3步、对扩增产物进行电泳分析，利用电泳结果对青虾进行分类。
上述的PCR扩增中，反应体系可以包括有：2.5mM dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP） 1μL，10×Buffer 2.5μL，25mM MgC12 2μL，8pmol/μL的两侧引物各0.75μL，5 U Taq DNA 聚合酶0.2μL，50ng/μL的DNA模板2μL，用超纯水补足至25μL。
上述的PCR扩增中，扩增程序可以是：94℃预变性5min；94℃变性30s, Tm 30s, 72℃45s, 30个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存；所述的Tm是指：SEQ ID NO.1～2 54℃、SEQ ID NO.1～2 52℃、SEQ ID NO.5～6 50℃。
在PCR扩增结束后，可以对扩增结果使用电泳分析，来获得样品分类信息。
电泳分析的参数可以是：采用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行检测，电压200V，电泳时间3～4小时，电压完毕后用染料染色10-15分钟。
上述的EST-SSR分子标记的引物组可以在青虾群体遗传多样性分析中应用。
有益效果
本发明的方法筛选得到了具有多态的微卫星引物，为利用EST-SSR标记技术研究青虾选育群体的遗传特征和群体结构，实现分子标记在青虾育种中的初步应用，为构建高密度青虾遗传连锁图片、QTL定位重要经济性状进行分子标记辅助育种奠定基础。
附图说明
图1.微卫星位点EWXM33在太湖群体中扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（Marker依次从上到下：234bp，213bp，192bp，184bp，124bp）
图2.微卫星位点EWXM62 在太湖群体中扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（Marker依次从上到下：267bp，234bp，213bp，192bp，184bp，124bp）
图3.微卫星位点EWXM147 在太湖群体中扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（Marker依次从上到下：267bp，234bp，213bp，192bp，184bp）
具体实施方式
微卫星序列的筛选及多态性标记的确定
1. 微卫星序列来源及筛选
青虾EST-SSR标记特异引物筛选方法包括以下步骤包括：从本课题组构建的青虾促雄腺转录组文库（http://www.ffrc.cn/gene/list.asp）中公布的青虾ESTs中，该文库序列全部为青虾的EST序列，来源于青虾促雄腺，采用微卫星序列检索软件SSR-hunter进行微卫星序列的查找，共采用70,702条EST序列，对于2～6个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星序列进行分离。（按照微卫星筛选原则，最基本的原则是：对于2个及2个上碱基重复单元重复次数不低于5次，在此基础上，可按照自己经验和研究的需要，进一步改善或提高参数）。经过筛选，得到含有微卫星重复的ESTs共12,437条。接下来，再对这些ESTs序列进行聚类分析，采用DNAstar 对这些微卫星ESTs进行聚类，选取不同类群中的EST设计引物。
2. 微卫星标记引物设计
根据该微卫星重复两端侧翼序列采用Primer5 设计引物，采用Primer Primer 5软件对引物微卫星重复两端侧翼序列设计引物，参数为：①引物长度范围为20±2bp；②正反引物之间应该低互补性或无互补性；③引物退火温度为50~60℃，正反引物之间退火温度相差不超过3℃；④扩增片段长度在100--500 bp之间；⑤(G+C)含量为40％~60％。继而进行引物检测及优化。按照以上参数，在12,437条含有微卫星重复的ESTs中共设计得到引物968组。
3. 引物PCR扩增体系优化
实验中所用的青虾均为野生成体青虾，全部采自太湖无锡湖区（120°13'44"E ，31°28'22"N），以下简称太湖野生群体（THW），所有样品采集后均保存在无水乙醇中保存于-20℃备用。采用酚氯仿抽提方法提取32个青虾基因组DNA。用设计好的引物扩增青虾基因组。采用25μL反应体系：其中2.5mM dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP） 1μL，10×Buffer 2.5μL，25mM MgC12 2μL，8pmol/μL两侧引物各0.75μL，5 U Taq DNA 聚合酶0.2μL，50ng/μL的DNA模板2μL，用超纯水补足25μL。PCR反应在Eppendorf公司的Autherized Thermal Cycler上进行。根据每对引物特性，对其设计的退火温度（Tm）进行优化，优化幅度以1度为单位，范围上下±5度。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s, 复性Tm 30s, 72℃45s, 30个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。
PCR产物检测：扩增得到的产物在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行检测，电压200V，电泳时间3-4小时（根据产物片段大小决定），电压完毕后用Goldview染料染色10-15分钟，然后在凝胶成像系统下观察拍照，筛选出无杂带、目的条带特异性高的Tm 即为该微卫星引物的最佳Tm。
在968组引物中随机采取135组引物进行合成，按照以上参数进行PCR扩增并筛选，有72组能够扩增出目的产物条带。
4.微卫星标记的确定
选取最佳Tm下的电泳结果图，作为检测引物的多态性分析的依据。采用BIO-PROFIL软件对电泳图形进行分析，行，并使用PopGene（Version 3.2）软件进行进行遗传多样性参数统计，观测杂合度(HO)和期望杂合度(HE)，由公式：
计算多态信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）。其中n是等位基因数，Pi和Pj分别是第i和第j个等位基因频率。
根据统计结果，有多态性引物为14组，其中高多态性（PIC>0.6）的引物组有3个，分别为EWXM33、EWXM62 和EWXM147，具体信息见表1。
对EST-SSR标记进行综合评价，最终得到有多态性的青虾EST-SSR标记引物3组，其位点被命名为EWXM33、EWXM62、EWXM147。图1～3为微卫星位点EWXM33、62、147 在太湖群体中扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，从图中可以看出，三个位点扩增产生的条带清晰，可以扩增出多个等位基因。如表2所示，EWXM33在太湖群体中产生8个等位基因，观测杂合度(HO)为0.6625，期望杂合度(HE)为0.8388，PIC为0.890；EWXM62在太湖群体中产生10个等位基因，观测杂合度(HO)为0.7688，期望杂合度(HE)为0.8249，PIC为0.672；EWXM147在太湖群体中产生8个等位基因，观测杂合度(HO)为0.7138，期望杂合度(HE)为0.8652，PIC为0.657。这个三个标记在太湖青虾群体中均能产生高多态性，可用于青虾群体遗传多样性分析并进一步用于青虾分子标记辅助育种中。
表1. 青虾3组EST-SSR引物特征表
注：T m 代表退火温度；Na 代表等位基因数；H O 代表观测杂合度；H E 代表期望杂合度。
表2. 青虾3个位点等样本量、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度
附：
EWXM33引物对应EST序列：>comp577_c0_seq1：
TTGGCAGGACGATCGGCACAGGCACAGCATTACAAGCTGACAGTCTGCCACCTCTATTGGTCATCACGAGTGAGAAATTGTTTATAATCGGTAAGGAAGATGGTGGTCCGACAGTACAATGATGAGCTCAAATACCTTGAGCGCCTCACACCAAACTGTTGGCGTATCAAGAAAGGCTTCCAACCGAACATGAATGTGGATGGAATATTTTATGTTAATGATCATCTTGAAAAGCTTATGTTTGATGAACTGCGAAATTACTGTCGTCCAGGAGCTATTGGGGGTTTCCTTCCTGGCATGAAGCAAATTGCAAATGTTGCTGCTTTGCCTGGCATTGTTGGGAAGTCTGTAGGCTTGCCCGATGTTCATTCAGGATATGGCTTTGCTATAGGAAATATGGCTGCCTTTGACATGGATGATCCTAAGGCTGTTGTTTCTCCTGGTGGTGTCGGTTTTGACATTAATTGCGGAGTCCGACTACTTCGAACGAATCTCACCGAGGCAGATGTAACTCCTGTAAAGGAACAGTTGGCCCAGGCTATGTTTGATCACATCCCTGTAGGTGTAGGATCCAAAGGAATTATTCCAATGACAGCCAGAGATCTTGAAGAGGCATTGGAAATGGGCATGGATTGGTCTCTAAGAGAAGGTTATGTTTGGGCCGAAGACAAAGAACACTGTGAAGAATATGGACGAATGGCTCAAGCTGACCCTGCCAAAGTATCTATGAGGGCTAAGAAACGAGGACTACCACAGCTTGGAACACTAGGAGCTGGTAACCATTATGCAGAAATTCAAGTTGTAGATGAAATTTTTGACAAATGGGCTGCTAGCAAGATGGGAATAGAACAGAAAGGTCAAATTTGTGTGATGATTCACTCAGGTTCCCGAGGTTTTGGTCATCAAGTTGCCACAGATGCTCTTGTTGCTATGGAGAAAGCAATGAAAAGGGATGGAATTGACACCAATGATCGCCAGTTGGCGTGTGCCAGAATAAAGTCACAAGAGGGTCAAGATTATTTAAAATCAATGGCTGCAGCTGCAAATTTTGCCTGGGTTAATCGTTCATCTATGACCTTCTTGAGTCGCCAAGCCTTTGCCAAAATGTTTCACAGTAGTCCAGATGATCTCGATATGCATGTTATTTATGATGTTTCCCATAATATTGCCAAAATTGAACAACACTGGATTGATGGCAAACTTCGAACATTATTGGTTCATCGAAAGGGATCGACAAGGGCATTCCCACCCCACCATCCATTGATCCCAGTAGATTATCAACTGACTGGACAACCTGTCCTTATTGGTGGAACAATGGGAACTTGTTCCTATGTGTTGACTGGTACTGAACAAGGCATGATGGAAACGTTTGGATCAACTTGTCACGGCGCTGGACGAGCTCTTTCCAGGGCAAAATCTCGCAGGAATCTTGACTATACAGATGTGCTTAACAAGTTACAAGAAATGGGCATTAGTATCAGAGTAGCATCTCCTAAATTAGTCATGGAAGAGGCACCTGAATCTTACAAGAATGTTACGGATGTAGTGGATACCTGTCACGCTGCAGGGATTAGTAAAAAATGTATTAAACTACGACCCATTGCAGTAATTAAAGGCTAAGTATTTGTTTATTTATAGGTAATTGATGACTTTCATATAAATTATCCATAATATTATAATGTTAATCTACATACATACATACATTTCAAAATCCTTAATGATGCTGAAGTGAATGGGAAATGAATATTTTTCATGTAAAAAAATTTACTTAAGCTGAATAAAGGATCGAATGACTTGTTTATTTTATTTAATGTTCCTACTATGGTATATGACAGGAAATCATAACATTATGATGGCAATAACTGGTTTTGAACTTTTAATAATAAATTAATATAATGTTCAGGAAAGTTTTTTGTGACAACACAGAAATGTCTTTCTACATAATTACAAACTTACTTATAACTATAATGATATCAGTAATAACAGTTATGATGAAAGCTTTCTATGACCAACAATACCTTTTTCGGAGGATCTTGCTTAAAAATCATATTGCACAGTTTTACCGAGTCATGAATTATGCAAGCAGATTGTCATTAAAACTTACAGAATCTACAAGGCAAAAACGAAGCACCCTTGTATGAGTAGTGCTTTCAGTGCACCTCGAATGGTAAGACCAAAGGATTGTTAGCTATGAAAAACACAAATTGATTAGAAAATGTGGTATTTTTAGCCTTTACCTTAATTACCACATCCTCTCTTCAATTTTGCTGTCCGACACCTGTAAAACACTGTAAATCATTACAATAATCAAATTTCAATACAGTGACATTACTTGCCAGGCTAAGAAAAGGTCATTAAAACAGTATTTTATTTTACTCTCACACACATTTTCTCTTCTTGTCTCTTTTACTTCCCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTCGGATGTTAGCAACACAGCTGTGGCGACAGCAACTCGTGAATCTCGGATTCGACGTCCCCTAGAGCATCGCCATGATAATTCGCCTGGCTAGCCAGAGCTTGCGATGGGGTGTGTGGCACTGTCAAAGGTCGAGCGAGAGTGCCTATATATGCCCGACGGCCAGTGCCCGGGCAGCGTAGGAGCTCGA
EWXM62引物对应EST序列：>comp16794_c0_seq1：
GTGAGTGCCAGTCGTGCCCTACATTGCTCTCTGCGTTCTTATGTGGAAGGAAAAGACCTAAGAAAGATCATTTCCAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAACTGAGCGCAGTTACCAGTGGGATACGTGTGTTCCTTTCGCTGATGAAAAGTTTGATGTTGGTAATAACTTGATTGTTGACAGAGGGGAAGTGGAATAACCTGCTCTGAGTGTGTCAGAGGCAGAAGAACAGTCCATTGGTTGCTGGAGTTGCTTGATCAGCGTTCATGGATAATGTTCCTTCGGAAAAGCCTTCCATCTGGAGATTTTCTTAGTTATTGACTTGGCTGTTGAATAAGTTTAAGGCCTAAGAGCCTTTGCGGAACGATGACGACGCTGGCTAGAAGAAATTCTTCAATACACAAAGTCCGGGATTTCCAGTTAGCCAAAGTTGATTTGGATGACGAGTACGAAGTCCTTCACGTCATTCAAAAGGGATGGAGAGGAAAACTCCTTCTGGTGGAGCATCGGAGGACCCGTCATGAGGTTGTCCTGAAGGCTATTCATAAGGATGCCACTTCCCGCCTCGACTTCTTTCGGGAATTCCACTACAATTACTACCTCAGTCCCCACGAGAACATCCTCAATGCTTACGACGTGGCTTTTGAGGCCGACGACCACTTCGTCTTCGCCCAGGAGTATGCTCCCTTCGGGGACCTCACCAGCAACACCTCCGACGTGGGCCTAGGAGAGATCAACACCAAGAAAATAGCTCTCCAGTTGGCCTCTGCCCTCGACTTCATGCATTCAAAGGACTTGGTCCACAGGGACATCAACATGGATAATATCTTGGTCTTCAAAAGCGACTTCAGTCAGGTTAAACTTTGCGACTTTGGATCCACGAGGAAGAAAGCAACGCTGCTCAAGAAGAAGACGGTCTGGTTGCCCTACACGCCGCCGGAGATCGTGGATGCTGTGCACAATGAGGGCTTTCACGCAGAGACATCTCAGGATGTGTGGCAACTTGGTATACTGATCTACGTGCTCTTGACAGGTCAGCTGCCTTGGCAGAAGGCTGACCTCACTGACCCTAACTACGCAGAATATGTCAACTGGAGGAAGAGAAAGACGCTGCGGACCCCAAAACGCTTCACAAATTTCACATCTCGTCTCCTGCGCATGTTCAAGAGGTTGCTGGAACCGAAACCGGAGAAGAGATCCTCCGTGAGAGAGGTTTACAAATATCCGGACGACAAGTGGTTGGTGAAGCTTCCCCGCAGAGACGCCGGTGATATTGACAATCAAAGTATCTGCTACTCGACGTACTCGGCTCATTCCTGCCCGAAGGAGAAGGACTACGTGTTGAGGACTCTGAAGGAGGCCGGCATAGAGACCACCGTCGACCGCATCGCCAAACGCCAAAGGATACACGAATGGCTGGAACACTCGCTTTCTAACAAAACTCCGGAGGGAGACGACCAAAGGGCACTAGATGGTTCAACCTCTCCATCGACCGACCAAGATGACCAAAAAGAGGACGAGGTCGAATCTCAGTGCTCAGACAATGACAAGCGATTGCGGGAGAGTTTAAGGAAACAGTACGAAGACCTCGCTGCCTTGAGCATTGAAACTGCTCGAACGAGGAGTGCAACAAATAACGCCCACGATGGACACCATGGTCCTACTCAAGATAGAAAGTCAAGGATCACGGATTACAAGTCGCAATCTTCAAACAAAAAGATTGACCCTAGAAAGGGCGAAATTATTAACTCCGGCGTGATCGTCATATCAGGGAGCATAGTAACCCCTGTCCGAAGATTATCCCGCCCAAGAGCTCACAGTAATAGTCCGCACTTAGGAAGGAGAACTTTCACACGAACGCAGAAGTTCGGCGATGCGCCTCCAAGCCCGCCACCACCCAGACATACCCAGAGCGCCTCGCCTGCTGTGCCCGTTGAGAATCCCCTCGCCAAATGCCCTACTTACGGCAGATCCGATCGGACTGAATGCGGGTACGAGTTAAAACACAGCAAGACTTACGGGTACTTCATGACCGATTATTCAGACGAGCTGGAGTCGCAGAAAACGAGTCAAGATGACAGCAGTTCAACAGACACGAGCTTGGTGAGCGTGCTTGTGCAACCAACTACGTACCATTAAGGCAATGCAAGTGAGCACACACACACACACACACACAGGGGTCAGCCTTACTTTGAAAGGACACATCTTGCTATCTTTCTTTAATAAGTACTTGACTGTCAATTATAGTGCTTTACACAGGAAATATATACATATAAATTTAAATATAAACCTCCCTCTTACCTTTCAAGAGAAA
EWXM147引物对应EST序列：>comp18207_c0_seq1：
AAAAAAAAAAAAAAAGATGAAAAAACTTTTCACGCACCAGTTTCTTCTCCCTTCTCCTTCTTCTTCTTCTATTCTTGAAACGTTCTTTTCGTTTATTAGATTCTCTCGATTTTCTCTCGTAGTTCAAGTACCGATAACTATAGAGTTAATCGTTATCAAACACTCCTATACACAAATACGTCACTAAAGTTTCCAACCGCCTTGCAGCAGAAAGTTTGCTCTGGGAATCGTTACAAAGAGGTGCTTTTCCTTTTCGTGCAATTTCAACGCTATTACTCACAAATCTCGTTCGTCTCTGTTATGTTCATTAAAGTTTTTTATTATTCTTTGCACACACAATATACTTCGTATGGAAACCGTTTCTGTTTACGTGATCCATTCAGTGTATCGACAACGTCGAGCTGCATCCAGGCCTGATTGTATGGGTGTGTATGTAAGCATGTACAGTAGGTGTGTGTGTCGCATGTGCTTGGACGAACACACGTCTTTTAACTTTCATGCTCCCTCTCTCTTGCATACAGGCAATTTCAAATTGCATCATTTCAGAACAACGGTTTCTGATCCTAATGTGGGTCTCTGCTGTCCAACCCTCGCAAACTCAAAAAGGAGAAAAGAGTATTTAAATAAACTGCAATGAAAATGGCAGGAAACGGTGAGGAGATATCACCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGGGCCCGTTATAGGACAAAGACCGAATGAATATATAACAACGTTACTTAACTTGAACCTGCCAATCTTTAATACTGCCATTAGACTGCCGTTTCATCTCTCGAGACGTTTCCCTTTTTCCTCGAGCCGGGCTTCTCTCTGTCTCTGCCTGTCGCTCTCTCTTCAGTATGACTAGTTGTATCACTGCCCGCATATGATCTCTCGTAATGATTAAAAAAGTGCTCAAGTGAAGATTATTTATACTTTAG
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 青虾EST-SSR分子标记的引物组、标记方法及应用
<130> none
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacattcact ggctcttcg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccactactgt ttctatccac c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcttgtagaa acccgtag 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctctgacctg cttagaaaa 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
attgtcgtag gctcacgt 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaaattggtc ttgctccc 18
Claims (6)
1.一种青虾EST-SSR分子标记的引物组，其特征在于，包括有如下3个位点所对应的正向和反向引物：
EWXM33：SEQ ID NO.1～2；
EWXM62：SEQ ID NO.3～4；
EWXM147 ：SEQ ID NO.5～6。
2.一种基于权利要求1所述的EST-SSR分子标记的引物组的青虾分子标记方法，包括如下步骤：
第1步、提取青虾样本的DNA；
第2步、使用分子标记引物组对青虾样本进行PCR扩增；
第3步、对扩增产物进行电泳分析，利用电泳结果对青虾进行分类。
3.根据权利要求2所述的青虾分子标记方法，其特征在于：所述的PCR扩增中，反应体系包括有：2.5mM dNTP 1μL，10×Buffer 2.5μL，25mM MgC12 2μL，8pmol/μL的两侧引物各0.75μL，5 U Taq DNA 聚合酶0.2μL，50ng/μL的DNA模板2μL，用超纯水补足至25μL。
4.根据权利要求2所述的青虾分子标记方法，其特征在于：所述的PCR扩增中，优选的扩增程序是：94℃预变性5min；94℃变性30s, Tm 30s, 72℃45s, 共30个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存；所述的Tm是指：SEQ ID NO.1～2 54℃、SEQ ID NO.1～2 52℃、SEQ ID NO.5～6 50℃。
5.根据权利要求2所述的青虾分子标记方法，其特征在于：优选的电泳分析的参数是：采用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行检测，电压200V，电泳时间3～4小时，电压完毕后用染料染色10～15分钟。
6.权利要求1所述的EST-SSR分子标记的引物组在青虾群体遗传多样性分析中的应用。
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2013
- 2013-10-14 CN CN201310477265.6A patent/CN103484459B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103484459B (zh) | 2015-06-03 |
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