CN109207482B

CN109207482B - 青虾gem基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN109207482B
Application number: CN201811086230.9A
Authority: CN
Inventors: 金舒博; 傅洪拓; 乔慧; 张文宜; 孙盛明; 蒋速飞; 熊贻伟; 龚永生; 吴滟
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2038-09-18
Also published as: CN109207482A

Abstract

本发明公开了青虾GEM基因及其编码蛋白和应用，GEM基因全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。由青虾GEM基因编码的蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述青虾GEM基因在青虾雄性分化及发育过程中的重要作用，为青虾雄性分化及其发育机制的研究提供理论依据和思路；(2)本发明所述青虾GEM基因能够调控青虾免疫应答机制；(3)本发明所述青虾GEM基因能够用于青虾全雄群体选育中，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和应用前景。

Description

青虾GEM基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及青虾的发育调控，具体为青虾GEM基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称河虾，隶属十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，广泛分布于我国各地水域，生长快、适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。据2012年《中国渔业年鉴》记载，全国养殖青虾年产量超过23万吨，年产值超过150亿元，是目前淡水养殖业中最有发展前途的品种之一。在青虾养殖过程中存在着显著的雌雄生长差异现象，即雄性青虾的生长速度显著快于雌性青虾，在收获季节，雄性青虾的个体大小为雌性青虾的2-2.5倍，青虾全雄群体选育具有显著的经济价值以及应用前景。因此，全面了解青虾雄性分化以及发育机制，建立青虾性别选育技术刻不容缓。

促雄腺是甲壳类动物特有的内分泌腺，其分泌的激素对甲壳类动物雄性分化及雄性特征维持起重要的作用。先前研究结果表明，在雄性罗氏沼虾中拔除促雄腺，可诱使雄性罗氏沼虾分化出雌性特征；在雌性罗氏沼虾中植入促雄腺，可诱使雌性罗氏沼虾分化出雄性特征。基于促雄腺在甲壳类动物雄性分化及发育过程中的重要作用，对促雄腺中表达基因的研究成为近些年来的热点。本课题组从青虾转录组文库及青虾蛋白质文库中筛选得到编码GEM基因的mRNA序列以及蛋白质序列。GEM基因的功能尚不明确。

原位杂交(In situ hybridization)技术是一种广泛存在于真核生物中的高效的序列特异性基因定位技术。原位杂交技术是透过靶基因序列设计带有荧光信号的特异性序列探针，通过与组织学切片杂交，从而对基因在组织中进行准确定位以及功能研究。近年开始在甲壳动物基因功能研究中使用。目前，关于Rev3基因的原位杂交研究尚未见报道。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，阐明GEM基因在青虾雄性分化及发育过程中的重要作用，为青虾雄性分化及其发育机制的研究提供理论依据和思路，本发明提供了青虾GEM基因及其编码蛋白和应用。

技术方案：青虾GEM(Gem-associated protein 2-like isoform X1，GEM)基因，GEM基因全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。SEQ ID NO:1序列如下：

AATCTCGTTTTCCCGTAGACGCTATAGCTAATGTCCCTGACATATTCATTCTTAATAAATTTTCAGCGCGTTTACGAGATTATTTAACGGTTTTTGAACGAACCCTAGGATCTGAGCTTGCTTAAGCACAGAGTTCTTCTTACAACCATGAATGACAATGACGGTGGGGATGATAATCTTTTATCACAGGCTTTTGCAGTAAGTAAAGTGCCAGACAATTATGACCCATCAGTACCACCAGCATCAGCAGAAGAGTATCTTCAGCATGTAGTATGGGAGGCTCGTCAGTGCAAAGAAGTAGTAACAGTTGATGTTGACAGAAAGAAACTTAAAAAGTTAGGAGCAGTAGTTAAGAAACCAGTGAAAGAAAATGCCCCTGTCGGATATGCTCCGTCTGCACAAACTCAGAAGGACTTACTATCAGCATTTTCTAAGTTACGCACGCAAATTGCTACAATGAGAGCTTCAGAAGAGGTTCCAAATGCTCCAGTTCCTTTGCCTGGTATTAAAAAGAGGGAAGAATGGTGCAAGTTTTGTTTTGGAAATAGTTTCCAACTTGCTTTGTTGAACAAAGCTGGCAGCACCACTCCAAAACCAGAATTGATAGAAGGTCATCAGCCTCTTCTCAGTATTGTCTTGAATATAAAGCAGAGAGGTATTGAAAATCTCTTAGAATGGCATGCCCAGTGGCTAGAAGTGCTTGGATTTTCAAAGCCTCAAGGTCAATGGTTTTATGCTCTTCTAGCTTGCCTTGAAAAGCCTGTTACACCAGAGAGTTGTTCTCAGATTCGTCACATTGCTAGAATGTGTGCAAAAATAAGAGCATCGCTGGATTCTGCTGATCATCCTGATTTACCACAGCTCAATGTTATAATCTGCATTGTCGCTAGGTATTTCAGTCAAGAGGATCTTGCTGATGGATGAGATTCGTATGATGTGATGTGAAGTTCTGTATTAGGATTAGTGATTACAGTATGTTATCAATGTAATAAAAAATTTTCTGATTAAAAAAAAAAAA。

优选的，GEM基因全长cDNA序列克隆的特异性正向引物为：

3GEM-F1(SEQ ID NO:3)：AGTATGGGAGGCTCGTCAGT；和

3GEM-F2(SEQ ID NO:4)：ATGCCCAGTGGCTAGAAGTG；

特异性反向引物为：

5GEM-R1(SEQ ID NO:5)：AATGCTCCAGTTCCTTTGCCT；和

5GEM-R2(SEQ ID NO:6)：CCTGTCGGATATGCTCCGTC。

优选的，GEM基因的荧光定量PCR引物为：

GEM-RTF(SEQ ID NO:7)：ATGCCCAGTGGCTAGAAGTG；

GEM-RTR(SEQ ID NO:8)：GCAGAATCCAGCGATGCTCT。

优选的，GEM基因的原位杂交试验中，正义原位杂交探针为(SEQ ID NO:9)：GCACTGACGAGCCTCCCATACTACATGCTGAAGATAC，反义原位杂交探针为(SEQ ID NO:10)：GTATCTTCAGCATGTAGTATGGGAGGCTCGTCAGTGC。

由青虾GEM基因编码的蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。SEQID NO:2序列如下：

MNDNDGGDDNLLSQAFAVSKVPDNYDPSVPPASAEEYLQHVVWEARQCKEVVTVDVDRKKLKKLGAVVKKPVKENAPVGYAPSAQTQKDLLSAFSKLRTQIATMRASEEVPNAPVPLPGIKKREEWCKFCFGNSFQLALLNKAGSTTPKPELIEGHQPLLSIVLNIKQRGIENLLEWHAQWLEVLGFSKPQGQWFYALLACLEKPVTPESCSQIRHIARMCAKIRASLDSADHPDLPQLNVIICIVARYFSQEDLADG。

以上任一所述青虾GEM基因在调控青虾雄性分化及其发育过程中的应用。

以上任一所述青虾GEM基因在调控青虾免疫应答机制中的应用。

以上任一所述青虾GEM基因在青虾全雄群体选育中的应用。

有益效果：(1)本发明所述青虾GEM基因在青虾雄性分化及发育过程中的重要作用，为青虾雄性分化及其发育机制的研究提供理论依据和思路；(2)本发明所述青虾GEM基因能够调控青虾免疫应答机制；(3)本发明所述青虾GEM基因能够用于青虾全雄群体选育中，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和应用前景。

附图说明

图1是青虾GEM基因在不同成体组织中的相对表达量结果图；

图2是青虾GEM基因在精巢、促雄腺和肝胰腺中的原位杂交结果图；其中ST为精原细胞，SC为精母细胞，SP为精子，M为肌肉，C为促雄腺细胞，FS为索状结构，LG为脂肪粒细胞，HC为肝胰腺细胞，该图标尺为50μm。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：青虾GEM基因全长CDNA的获得

总RNA提取：选取10只健康成熟的雄性青虾促雄腺，迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速的研磨。总RNA的提取使用Takara公司的RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法进行，提取方法参照使用说明书。经过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，分光光度计分析该样品OD260/280比值在1.8～2.0之间，并测定RNA的浓度。

从青虾促雄腺转录组中获得GEM基因cDNA中间片段序列。根据GEM基因cDNA中间片段序列，设计特异性正向引物3GEM-F1(SEQ ID NO:3)、3GEM-F2(SEQ ID NO:4)；和反向引物5GEM-R1(SEQ ID NO:5)、5GEM-R2(SEQ ID NO:6)分别进行cDNA 3’和5’快速扩增，操作步骤按TaKaRa 3’-RACE和TaKaRa5’-RACE试剂盒说明书进行。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。采用上海生工生物工程有限公司(Sangon)的柱式DNA胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物连接到pMD18-T载体(Takara)，并转化入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，将插入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。将得到的几段产物进行拼接，得到青虾GEM基因全长cDNA序列。经过序列比对显示，青虾GEM基因与其他物种的同源性为47％，但覆盖度达到98％。其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2：青虾GEM基因组织表达

以SEQ ID NO:1核苷酸序列为依据，在开放阅读框以内采用NCBI在线引物设计软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计制备青虾GEM基因的荧光定量PCR的引物(SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8)。从健康成熟的青虾中获取精巢、促雄腺、卵巢、肝胰腺、肠以及心脏等组织(N≥3)，并将组织保存在RNA保存液中(Takara)。按实施例1所述提取各组织总RNA并使用iScriptTM cDNA Synthesis Kit perfect Real Time(Bio-Rad)试剂盒将总RNA反转成cDNA，采用Bio-Rad iCycler iQ5荧光定量PCR分析系统检测GEM基因在青虾各组织中的相对表达量。如图1所示，青虾GEM基因在精巢及促雄腺中的表达量显著高于其他检测的基因，因此推测该基因可能在青虾雄性分化及其发育过程中起重要的作用。

实施例3：青虾GEM基因的原位杂交研究

以SEQ ID NO:1核苷酸序列为依据，在开放阅读框以内采用Primer5引物设计软件设计制备青虾GEM基因的原位杂交正义探针序列和反义探针序列，并委托利用上海生工生物工程有限公司(Sangon)合成标有地高辛信号的正义原位杂交探针和反义原位杂交探针(SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10)。从健康成熟的雄性青虾中获取精巢、促雄腺和肝胰腺组织，并保存在4％多聚甲醛溶液中固定。制备各组织的冰冻切片。使用Zytofast PLUS CISHimplementation kit(Zyto Vision GmBH,Germany)原位杂交试剂盒对各组织进行组织学定位，并在显微镜下观察定位结果。如图2所示，青虾GEM基因在青虾精巢中的精原细胞观察到了较强的地高辛信号，但在精母细胞及其镜子中未观察到地高辛信号，因此该基因在启动精巢发育过程中起重要作用。该基因在青虾促雄腺中的索状结构中观察到了较强的地高辛信号，但并未直接在促雄腺细胞中观察得到地高辛信号。促雄腺索状结构的形成对促雄腺细胞的形成起重要的促进和支撑作用。因此，该基因并不是促雄腺细胞所分泌，但该基因在促雄腺索状结构的形成过程中重要作用，为促雄腺细胞的形成起到促进和职称的作用。该基因还在青虾肝胰腺细胞中观察到较强的地高辛信号，证明该基因还参与青虾免疫应答机制。结果证明，青虾GEM基因在青虾雄性分化及其发育过程中起重要的作用，为该基因的新功能，未在其他物种中报道，这一研究结果为青虾雄性分化及其发育机制的研究提供了理论依据，也为后续青虾全雄群体选育提供指导意义。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 青虾GEM基因及其编码蛋白和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1018

<212> DNA

<213> 青虾(shrimp)

<400> 1

aatctcgttt tcccgtagac gctatagcta atgtccctga catattcatt cttaataaat 60

tttcagcgcg tttacgagat tatttaacgg tttttgaacg aaccctagga tctgagcttg 120

cttaagcaca gagttcttct tacaaccatg aatgacaatg acggtgggga tgataatctt 180

ttatcacagg cttttgcagt aagtaaagtg ccagacaatt atgacccatc agtaccacca 240

gcatcagcag aagagtatct tcagcatgta gtatgggagg ctcgtcagtg caaagaagta 300

gtaacagttg atgttgacag aaagaaactt aaaaagttag gagcagtagt taagaaacca 360

gtgaaagaaa atgcccctgt cggatatgct ccgtctgcac aaactcagaa ggacttacta 420

tcagcatttt ctaagttacg cacgcaaatt gctacaatga gagcttcaga agaggttcca 480

aatgctccag ttcctttgcc tggtattaaa aagagggaag aatggtgcaa gttttgtttt 540

ggaaatagtt tccaacttgc tttgttgaac aaagctggca gcaccactcc aaaaccagaa 600

ttgatagaag gtcatcagcc tcttctcagt attgtcttga atataaagca gagaggtatt 660

gaaaatctct tagaatggca tgcccagtgg ctagaagtgc ttggattttc aaagcctcaa 720

ggtcaatggt tttatgctct tctagcttgc cttgaaaagc ctgttacacc agagagttgt 780

tctcagattc gtcacattgc tagaatgtgt gcaaaaataa gagcatcgct ggattctgct 840

gatcatcctg atttaccaca gctcaatgtt ataatctgca ttgtcgctag gtatttcagt 900

caagaggatc ttgctgatgg atgagattcg tatgatgtga tgtgaagttc tgtattagga 960

ttagtgatta cagtatgtta tcaatgtaat aaaaaatttt ctgattaaaa aaaaaaaa 1018

<210> 2

<211> 258

<212> PRT

<213> 青虾(shrimp)

<400> 2

Met Asn Asp Asn Asp Gly Gly Asp Asp Asn Leu Leu Ser Gln Ala Phe

1 5 10 15

Ala Val Ser Lys Val Pro Asp Asn Tyr Asp Pro Ser Val Pro Pro Ala

20 25 30

Ser Ala Glu Glu Tyr Leu Gln His Val Val Trp Glu Ala Arg Gln Cys

35 40 45

Lys Glu Val Val Thr Val Asp Val Asp Arg Lys Lys Leu Lys Lys Leu

50 55 60

Gly Ala Val Val Lys Lys Pro Val Lys Glu Asn Ala Pro Val Gly Tyr

65 70 75 80

Ala Pro Ser Ala Gln Thr Gln Lys Asp Leu Leu Ser Ala Phe Ser Lys

85 90 95

Leu Arg Thr Gln Ile Ala Thr Met Arg Ala Ser Glu Glu Val Pro Asn

100 105 110

Ala Pro Val Pro Leu Pro Gly Ile Lys Lys Arg Glu Glu Trp Cys Lys

115 120 125

Phe Cys Phe Gly Asn Ser Phe Gln Leu Ala Leu Leu Asn Lys Ala Gly

130 135 140

Ser Thr Thr Pro Lys Pro Glu Leu Ile Glu Gly His Gln Pro Leu Leu

145 150 155 160

Ser Ile Val Leu Asn Ile Lys Gln Arg Gly Ile Glu Asn Leu Leu Glu

165 170 175

Trp His Ala Gln Trp Leu Glu Val Leu Gly Phe Ser Lys Pro Gln Gly

180 185 190

Gln Trp Phe Tyr Ala Leu Leu Ala Cys Leu Glu Lys Pro Val Thr Pro

195 200 205

Glu Ser Cys Ser Gln Ile Arg His Ile Ala Arg Met Cys Ala Lys Ile

210 215 220

Arg Ala Ser Leu Asp Ser Ala Asp His Pro Asp Leu Pro Gln Leu Asn

225 230 235 240

Val Ile Ile Cys Ile Val Ala Arg Tyr Phe Ser Gln Glu Asp Leu Ala

245 250 255

Asp Gly

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtatgggag gctcgtcagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcccagtg gctagaagtg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgctccag ttcctttgcc t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctgtcggat atgctccgtc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgcccagtg gctagaagtg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcagaatcca gcgatgctct 20

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcactgacga gcctcccata ctacatgctg aagatac 37

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtatcttcag catgtagtat gggaggctcg tcagtgc 37

Claims

1.青虾GEM基因，其特征在于，GEM基因全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的青虾GEM基因，其特征在于，GEM基因全长cDNA序列克隆的特异性正向引物为：3GEM- F1，其序列为SEQ ID NO:3和3GEM- F2，其序列为SEQ ID NO:4，特异性反向引物为：5 GEM-R1，其序列为SEQ ID NO:5和5 GEM-R2，其序列为SEQ ID NO:6。

3.根据权利要求1所述的青虾GEM基因，其特征在于，GEM基因的荧光定量PCR引物为：GEM-RTF，其序列为SEQ ID NO:7和GEM-RTR，其序列为SEQ ID NO:8。

4.根据权利要求1所述的青虾GEM基因，其特征在于，GEM基因的原位杂交试验中，正义原位杂交探针为SEQ ID NO:9，反义原位杂交探针为SEQ ID NO:10。

5.由青虾GEM基因编码的蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。