CN103397037A - 日本沼虾MnIAG基因、其扩增引物组及扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了日本沼虾MnIAG基因、其扩增引物组及扩增方法。利用本发明提供的引物组从日本沼虾促雄性腺组织中克隆到了MnIAG基因全长cDNA序列，对日本沼虾MnIAG基因功能尤其在性别分化中的重要作用的研究奠定重要基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因克隆领域，特别涉及日本沼虾MnIAG基因、其扩增引物组及扩增方法。
背景技术
促雄性腺（Androgenic gland）是雄性甲壳动物特有的一种内分泌腺，1947年在蓝蟹（Callinectes sapidus）中被首次发现。促雄性腺分泌促雄性腺激素（androgenic gland hormone），促雄性腺是甲壳类调控性别分化和维持雄性第二性征的功能的关键内分泌腺。移植促雄性腺或注射促雄性腺体提取物到甲壳类雌性个体体内会使雌性个体雄性化；反过来，把雄性个体切除促雄性腺则会导致雄性个体向雌性化发展。促雄性腺调控性别是通过促雄性腺激素发挥作用，促雄性腺激素是一种胰岛素类似的蛋白激素（insulin-like androgenic gland hormone，IAG），氨基酸序列包括信号肽、B链、C肽及A链四个部分。
日本沼虾 (Macrobrachium nipponense) ，俗名：青虾，河虾，隶属甲壳纲 (Crustacean) 、十足目 (Decapoda) 、长臂虾科 (Palaemonidae) 、沼虾属 (Macrobrachium) ，在中国各地都有分布，是我国重要的淡水养殖种类。沼虾属种类雄性个体普遍比雌性个体大，获得全雄性个体用于生产养殖一直是日本沼虾、罗氏沼虾养殖业生产实践的需要。最近有人用RNAi技术沉默IAG基因得到了全功能的性反转罗氏沼虾，对最终实现全雄性化养殖迈出了重要的一步。
目前数个物种的促雄性腺激素基因已经克隆，在GenBank数据库中登录的有罗氏沼虾、远海梭子蟹（Portunus pelagicus）、蓝蟹等11种甲壳类。而日本沼虾的IAG基因（这里命名为：MnIAG）还未见报道。我们利用RACE (rapid-amplification of cDNA ends) 克隆技术克隆了日本沼虾MnIAG基因全长cDNA，表达谱研究显示MnIAG在促雄性腺中特异性表达，这些结果对日本沼虾MnIAG基因功能尤其在性别分化中的重要作用的研究具有重要意义，也为实现日本沼虾全雄性化养殖奠定重要基础。
发明内容
本发明提供了日本沼虾MnIAG基因、其扩增引物组及扩增方法。
所述日本沼虾MnIAG基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
所述用于扩增日本沼虾MnIAG基因的引物组，其由如下引物组成：
IAG正向简并引物IAG-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
IAG反向简并引物IAG-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
3′正向外引物 3aMnIAG-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
3′正向内引物 3aMnIAG-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
5′反向外引物 5aMnIAG-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
5′反向外引物 5aMnIAG-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种扩增日本沼虾MnIAG基因的方法，包括如下步骤：
步骤1：获得日本沼虾促雄性腺组织的总RNA；
步骤2：将已公开的几种甲壳类IAG基因进行序列比对，找出保守序列，设计简并引物对，PCR扩增得到200bp的MnIAG基因的保守序列，所述简并引物对为：
IAG正向简并引物IAG-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
IAG反向简并引物IAG-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
步骤3：以此200bp的MnIAG基因保守序列作为模板，设计扩增MnIAG基因的3′端和5′端片段的特异性引物组；用引物组扩增获得日本沼虾MnIAG基因的3′端和5′端片段；所述引物组由如下引物组成：
3′正向外引物 3aMnIAG-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
3′正向内引物 3aMnIAG-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
5′反向外引物 5aMnIAG-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
5′反向外引物 5aMnIAG-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
步骤4：将所述MnIAG基因保守序列、所述MnIAG基因的3' 端和5' 端片段拼接，即得。
作为优选，步骤3所述扩增为套式两轮PCR。
本发明以日本沼虾促雄性腺组织为材料，分离了日本沼虾MnIAG基因全长cDNA序列。利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、嵌套聚合酶链式反应（nested-PCR）、3′端cDNA快速扩增（3′RACE）以及5′端cDNA快速扩增（5′RACE）的方法，对日本沼虾MnIAG基因进行了研究，首次从日本沼虾促雄性腺组织中克隆到了MnIAG基因全长cDNA序列，并对其所编码的MnIAG的序列特征、同源性、进化地位和表达谱进行了分析，确定其为日本沼虾IAG基因，这些结果对了解日本沼虾性别分化过程具有重要意义。
附图说明
图1为 MnIAG基因编码序列一致性最高的序列；
图2为 MnIAG基因在促雄性腺中特异性表达；
图3为不同甲壳类IAG的NJ系统进化树。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中日本沼虾由无锡太湖渔民提供，试剂均可由市场购得，RNA纯化等试剂购自美国Promega公司等，3′RACE和5′RACE试剂盒购自宝生物（大连）有限公司（Takara）。
总RNA提取：取30mg日本沼虾促雄性腺组织在研钵中加液氮研磨，用Trizol法提取总RNA，Trizol试剂采用Invitrogen公司，提取方法根据使用说明书。
日本沼虾MnIAG基因全长cDNA序列的克隆：
MnIAG基因200bp保守区片段的PCR扩增：
以已公开的几种甲壳类IAG基因进行序列比对，找出保守序列，设计简并引物，PCR扩增得到200bp的MnIAG基因的保守序列。所述简并引物对由如下引物组成：
IAG-F：CACCC(G/A/T)(C/A)GAGC(C/T)ACCCAC(T/C)TGAC
IAG-R：GCAATATTC(T/G)GCGACTTCCTCG
扩增反应体系如下：
| 3' 反转录液 | 1μL |
| dNTP Mixture (2.5 mM each) | 8μL |
| 10×LA PCR Buffer II (Mg2+ Free) | 5μL |
| MgCl2 (25 mM) | 5μL |
| TaKaRa LA Taq (5 U/μL) | 0.5μL |
| IAG-F (10 μM) | 2μL |
| IAG-R (10 μM) | 2μL |
| dH2O | up to 50μL |
扩增反应条件：94℃，3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；72℃，10 min；4℃保存。
PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收200bp左右处条带，使用美国Axygen公司产品（AxyPrep DNA Gel Extracion Kit）纯化，操作步骤按产品说明书进行。纯化的PCR产物与北京全式金生物技术公司pEASY-T1载体连接，转化E.coli TOP10菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，送测序公司测序。
MnIAG基因cDNA 3′端快速扩增（3′RACE）：
根据获得的200bp MnIAG基因保守序列，设计特异性3′正向外引物 3aMnIAG-F1和3′正向内引物 3aMnIAG-F2，其中，3′正向外引物 3aMnIAG-F1与3′RACE试剂盒中提供的3′RACE Outer Primer组成引物对进行第一轮PCR扩增，对扩增产物用3′正向内引物 3aMnIAG-F2和3′RACE Inner Primer进行第二轮PCR扩增，获得日本沼虾MnIAG基因的3′端片段；
3aMnIAG-F1：5' AATGCCTTCAGAGGTTCTTCGTC 3'
3aMnIAG-F2：5' GAAGAACCTCTGAAGGCATTGAA 3'
3′RACE Outer Primer：5' TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 3'
3′RACE Inner Primer：5' CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG 3'
反转录：
按照3′RACE试剂盒中的使用说明书进行，获得3′反转录液，反应体系如下：
| Total RNA | 1 μg |
| 3′ RACE Adaptor (5 μM) | 1 μL |
| 5×M-MLV Buffer | 2 μL |
| dNTP Mixture (10 mM each) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40 U/μL) | 0.25 μL |
| Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (200 U/μL) | 0.25 μL |
| RNase Free dH2O | up to 10 μL |
反应条件为：42℃, 60 min；70℃, 15 min；-20℃, 保存。
第一轮PCR：
扩增反应体系如下：
| 3'反转录液 | 0.6μL |
| 1×cDNA Dilution Buffer II | 2.4μL |
| 3aMnIAG-F1 (10 μM) | 0.6μL |
| 3′ RACE Outer Primer (10 μM) | 0.6μL |
| 10×LA PCR Buffer II (Mg2+ Free) | 1.2μL |
| MgCL2 (25 mM) | 0.9μL |
| TaKaRa LA Taq (5 U/μL) | 0.1μL |
| dH2O | up to 15μL |
第一轮PCR反应条件为：94℃，3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，20个循环；72℃，10 min；4℃保存。
第二轮PCR：
扩增反应体系如下：
| 第一轮 PCR 产物 | 1μL |
| dNTP Mixture (2.5 mM each) | 8μL |
| 10×LA PCR Buffer II (Mg2+ Free) | 5μL |
| MgCl2 (25 mM) | 5μL |
| TaKaRa LA Taq (5 U/μL) | 0.5μL |
| 3aMnIAG-F2 (10 μM) | 2μL |
| 3′ RACE Inner Primer (10 μM) | 2μL |
| dH2O | up to 50μL |
第二轮PCR反应条件为：94℃，3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，30个循环；72℃，10 min。
将第二轮PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收清晰明亮的单一条带。胶回收纯化使用美国Axygen公司产品（AxyPrep DNA Gel Extracion Kit），操作步骤按产品说明书进行。纯化的PCR产物与北京全式金生物技术公司pEASY-T1载体连接，转化E.coli TOP10菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，送测序公司测序。
MnIAG基因cDNA 5′端快速扩增（5′RACE）：
根据 MnIAG基因部分序列，设计特异性5′反向外引物 5aMnIAG-R1和5′反向内引物 5aMnIAG-R2，其中，5′反向外引物 5aMnIAG-R1与5′RACE试剂盒中提供的5′RACE Outer Primer组成引物对进行第一轮PCR扩增，对扩增产物用5′反向内引物 5aMnIAG-R2和5′RACE Inner Primer进行第二轮PCR扩增。正反引物序列如下：
5aMnIAG-R1：5' GTTTTCCTCACTCCGTCCCTCCG 3'
5aMnIAGR-R2：5' AATGCCTTCAGAGGTTCTTCGTC 3'
5' RACE Outer Primer：5' CATGGCTACATGCTGACAGCCTA 3'
5' RACE Inner Primer：5' CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG 3'
反转录：
按照5' RACE试剂盒操作说明书进行，首先用Alkaline Phosphatase (CIAP)对Total RNA中裸露的5' 磷酸基团进行去磷酸反应，然后使用Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉mRNA的5' 帽子结构，保留一个磷酸基团， 再连接5' RACE Adaptor，再进行反转录反应，得到5' 反转录液，反转录反应体系如下：
| Ligated RNA | 6 μL |
| Random 9 mers (50 μM) | 0.5 μL |
| 5×M-MLV Buffer | 2 μL |
| dNTP (10 mM each) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40 U/μL) | 0.25 μL |
| Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (200 U/μL) | 0.25 μL |
反转录反应条件为：30℃ 10min；42℃ 1hr；70℃ 15min。反转录产物-20℃保存。
第一轮PCR：
扩增反应体系如下：
| 5'反转录液 | 0.6μL |
| 1×cDNA Dilution Buffer II | 2.4μL |
| 5aMnIAG-R1 (10 μM) | 0.6μL |
| 5′ RACE Outer Primer (10 μM) | 0.6μL |
| 10×LA PCR Buffer II (Mg2+ Free) | 1.2μL |
| MgCl2 (25 mM) | 0.9μL |
| TaKaRa LA Taq (5 U/μL) | 0.1μL |
| dH2O | up to 15μL |
第一轮PCR反应条件为：94℃，3 min；94℃ 3 0s，55℃ 30s，72℃ 2min，20个循环；72℃，10 min；4℃保存。
第二轮PCR：
扩增反应体系如下：
| 1st PCR 产物 | 1μL |
| dNTP Mixture (2.5 mM each) | 8μL |
| 10×LA PCR Buffer II (Mg2+ Free) | 5μL |
| MgCl2 (25 mM) | 5μL |
| TaKaRa LA Taq (5 U/μL) | 0.5μL |
| 5aMnIAG-R2 (10 μM) | 2μL |
| 5′ RACE Inner Primer (10 μM) | 2μL |
| dH2O | up to 50μL |
第二轮PCR反应条件为：94℃，3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，25个循环；72℃，10 min。
将第二轮PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收清晰明亮的单一条带。胶回收纯化使用美国Axygen公司产品（AxyPrep DNA Gel Extracion Kit），操作步骤按产品说明书进行。纯化的PCR产物与全式金公司pEASY-T1载体连接，转化E.coli TOP10菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，送测序公司测序。
将日本沼虾MnIAG基因的3′序列、中间片段及5′序列进行cDNA全长拼接。
日本沼虾MnIAG基因全长cDNA序列特征见表1。
表1 日本沼虾MnIAG基因全长cDNA序列特征
| 日本沼虾 (M.nipponense) | |
| MnIAG | |
| 序列全长 (Full length) | 1719bp |
| 5' 非翻译区 (5'UTR) | 220bp |
| 开放阅读框 (ORF) | 528bp |
| 3' 非翻译区 (3'UTR) | 971bp |
| 加尾信号 (Poly A signal) | AATAAA |
| 前体 (Precursor) | 175aa |
| 信号肽 (Signal peptide) | 27aa |
| 成熟肽 (mature peptide) | 148aa |
对所得序列用NCBI网站blastx进行在线分析，与MnIAG基因编码序列一致性（Sequences producing significant alignments ）最高的前11个序列都是IAG，其中前4个分别是四种不同的虾类：Macrobrachium rosenbergii、Macrobrachium lar、Palaemon paucidens、Palaemon pacificus的IAG，显著性检验达到极大（e<2x10-40），可以确定所得序列为日本沼虾IAG基因 （图1）。
MnIAG基因编码的氨基酸序列具有典型甲壳类IAG序列特征：包括信号肽（1-27aa）、B链（28-67aa）、C肽（68-133aa）及A链（134-175aa）四个部分，分别在B链Cys12和A链Cys12以及B链Cys23和A链Cys29形成2个链间二硫键，而在A链的Cys11和Cys20形成1个链内二硫键。使用Clustalx 1.81将日本沼虾MnIAG基因，所编码的氨基酸序列与已公布的虾蟹类IAG氨基酸序列进行比对，使用MEGA3.1软件计算遗传距离，结果显示，MnIAG与一种贪食沼虾（Macrobrachiumlar）相似度最高（81.6%），其次与罗氏沼虾（Macrobrachiumrosenbergii）相似度较高（76.4%）。
用qPCR方法进行MnIAG基因在不同组织中表达谱检测，检测仪器采用Bio-Rad CFX96 System，根据MnIAG cDNA全长序列设计引物对序列为：MnIAG-F: 5′ GGTTCCTTGACCCCTTGCAT 3′和MnIAG-R: 5′ GGGAAGGGTCCAGCAAATGA 3′，反应体系采用SYBERGREEN荧光定量PCR试剂盒 (TAKARA公司)，使用方法按试剂盒说明书进行，反应程序如下：95℃，15s，60℃ 20s，72℃ 20s，40个循环，每个反应做3个重复，结果显示MnIAG基因在促雄性腺组织中高表达，而在其他组织中表达很低，MnIAG基因在促雄性腺组织中的表达水平是其他组织的4000倍以上（图2）。MnIAG基因在日本沼虾促雄性腺中特异表达，具有IAG基因表达谱的典型特征。
把日本沼虾MnIAG基因所编码的氨基酸序列与其他甲壳类物种IAG氨基酸序列利用Clustalx 1.81软件进行序列比对分析和使用MEGA3.1软件构建NJ系统发育树（如图3），由系统发育树可见，沼虾属IAG聚类在一个分支上，再与其他虾蟹IAG聚合。
以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 日本沼虾MnIAG基因、其扩增引物组及扩增方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1719
<212> DNA
<213> Macrobrachium nipponense
<400> 1
gttattccaa gaggggccaa gattgggatc ataccttgaa cggctgtgtt ccttccgccc 60
ccccctcgtc cgtttaaccg gtgtttcctc caaattccct ctcctgcttt ctggccaacc 120
tcgcactcac cctttcattt ccctcttcct tacatctcaa gacttcaaat tcttctctca 180
aggttttttt taaatcgaag tgaaacaaat aaactacaaa atgggatact ggaataccga 240
gatcaagtgt ctgttcttgt gctcactcgt agcgctgcat ctcccacaac ctttgtcgag 300
ctacgagatc gaatgcctct ccgtcgactt cgactgcggc gacatcacga acaccttcgc 360
ctccgtctgc ctgagataca acaactacat caacccagga ccaacctaca tttccagaca 420
gcgacgatct gctgacaact ataccgtata ttctgcaaag tctctatcgc tcgtccaccc 480
aagagctacc cacctgacca tggctgacga agaacctctg aaggcattga aggtggagga 540
ggaggaggag attcaccaca tgacgctgag ccggagagaa gcgaacaaga tgctgcagtc 600
gaagcgtcgc ttccggaggg acggagtgag gaaaactccg agggaggagt gctgcagcaa 660
cgcctccttc agacgctgca gcttcgagga agtggccgaa tattgcattg aactgcgtcc 720
cggcgttaac acctgcagct ccaagtagga ggtatgaagg atcatcccgt ccatgttata 780
cttggcttca gatgtctaaa gccttatcac agtcttcgag attgcaacat gactttcacg 840
atgtagaatg accaactaaa gctgcctttt gtctttcctc acactcaact gaaatatttt 900
tttgtcttcc ctttatcttc agctaaatta ttctcttgcc tcagctttaa cttccgctaa 960
agctttcttt tgtctcacct ttaaattcaa cattcgtctg ccttaccctt agttcagcta 1020
atggctcctg tttatctaac aattaacgtc cacaaaggtt tgtgttgtct taccctcggc 1080
tacacctttc gattgtccca cctttatctt ccactgaatc tttcttttga cttcctgcta 1140
ctttagcaga agctttcttt agtcacactt ttactttcag ttaggaattt tattttttgc 1200
cacttttacc tacagctaaa ggttcctttt gtctcaccct tgcctttagc taaagtttcc 1260
ttttgtcacc cttaccttca gctaaaggtt ccttttgtca cccttacctt cagctaaagg 1320
ttccttttgt cacccttacc ttcagctaaa ggttcctttt gtcaccctta ccttcagcta 1380
aaggttcctt gaccccttgc atgcagctaa aggttcttct tgtctcacct ttgccttcag 1440
ctaaaggttc gttttaccct tccaagcggc taatggctcc ttctgtctga accttgccct 1500
cagctaaact ctcgtttacc tttagctaaa gttttcattt gctggaccct tcccaaacgt 1560
tctagtgttt tacctttaca cgcaacagca tctagacatt tccgaacatt aagcatattg 1620
agttattatt ggtgattctt gtcaaagttt ccggaaaatt gtttaataca gcagttattc 1680
gtaaaataaa tgcttttgag aatactgaaa aaaaaaaaa 1719
<210> 2
<211> 1655
<212> DNA
<213> Macrobrachium nipponense
<400> 2
gttattccaa gaggggccaa gattgggatc ataccttgaa cggctgtgtt ccttccgccc 60
ccccctcgtc cgtttaaccg gtgtttcctc caaattccct ctcctgcttt ctggccaacc 120
tcgcactcac cctttcattt ccctcttcct tacatctcaa gacttcaaat tcttctctca 180
aggttttttt taaatcgaag tgaaacaaat aaactacaaa atgggatact ggaataccga 240
gatcaagtgt ctgttcttgt gctcactcgt agcgctgcat ctcccacaac ctttgtcgag 300
ctacgagatc gaatgcctct ccgtcgactt cgactgcggc gacatcacga acaccttcgc 360
ctccgtctgc ctgagataca acaactacat caacccagga ccaacctaca tttccagaca 420
gcgacgatct gctgacaact ataccgtata ttctgcaaag tctctatcgc tcgtccaccc 480
aagagctacc cacctgacca tggctgacga agaacctctg aaggcattga aggtggagga 540
ggaggaggag attcaccaca tgacgctgag ccggagagaa gcgaacaaga tgctgcagtc 600
gaagcgtcgc ttccggaggg acggagtgag gaaaactccg agggaggagt gctgcagcaa 660
cgcctccttc agacgctgca gcttcgagga agtggccgaa tattgcattg aactgcgtcc 720
cggcgttaac acctgcagct ccaagtagga ggtatgaagg atcatcccgt ccatgttata 780
cttggcttca gatgtctaaa gccttatcac agtcttcgag attgcaacat gactttcacg 840
atgtagaatg accaactaaa gctgcctttt gtctttcctc acactcaact gaaatatttt 900
tttgtcttcc ctttatcttc agctaaatta ttctcttgcc tcagctttaa cttccgctaa 960
agctttcttt tgtctcacct ttaaattcaa cattcgtctg ccttaccctt agttcagcta 1020
atggctcctg tttatctaac aattaacgtc cacaaaggtt tgtgttgtct taccctcggc 1080
tacacctttc gattgtccca cctttatctt ccactgaatc tttcttttga cttcctgcta 1140
ctttagcaga agctttcttt agtcacactt ttactttcag ttaggaattt tattttttgc 1200
cacttttacc tacagctaaa ggttcctttt gtctcaccct tgcctttagc taaaggttcc 1260
ttttgtcacc cttaccttca gctaaaggtt ccttttgtca cccttacctt cagctaaagg 1320
ttccttgacc ccttgcatgc agctaaaggt tcttcttgtc tcacctttgc cttcagctaa 1380
aggttcgttt tacccttcca agcggctaat ggctccttct gtctgaacct tgccctcagc 1440
taaactctcg tttaccttta gctaaagttt tcatttgctg gacccttccc aaacgttcta 1500
gtgttttacc tttacacgca acagcatcta gacatttccg aacattaagc atattgagtt 1560
attattggtg attcttgtca aagtttccgg aaaattgttt aatacagcag ttattcgtaa 1620
aataaatgct tttgagaata ctgaaaaaaa aaaaa 1655
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cacccdmgag cyacccacyt gac 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gcaatattck gcgacttcct cg 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
aatgccttca gaggttcttc gtc 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gaagaacctc tgaaggcatt gaa 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gttttcctca ctccgtccct ccg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
aatgccttca gaggttcttc gtc 23
Claims (4)
1.一种日本沼虾MnIAG基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于扩增如权利要求1所述的日本沼虾MnIAG基因的引物组，其特征在于由如下引物组成:
IAG正向简并引物IAG-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
IAG反向简并引物IAG-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
3′ 正向外引物 3aMnIAG-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
3′ 正向内引物 3aMnIAG-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
5′ 反向外引物 5aMnIAG-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
5′ 反向外引物 5aMnIAG-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.一种扩增如权利要求1所述日本沼虾MnIAG基因的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：获得日本沼虾促雄性腺组织的总RNA；
步骤2：将已公开的几种甲壳类IAG基因进行序列比对，找出保守序列，设计如权利要求2所述简并引物对，PCR扩增得到MnIAG基因的保守序列；
步骤3：以所述MnIAG基因保守序列作为模板，设计如权利要求2所述引物组，扩增获得日本沼虾MnIAG基因的3′ 端和5′端片段；
步骤4：将所述MnIAG基因保守序列、所述MnIAG基因的3' 端和5' 端片段拼接，即得。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在步骤3所述扩增为套式两轮PCR。
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