CN110527684A - 纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，属于基因工程及其应用领域，能够解决纳米化RNAi制剂在防治PVY病毒方面的问题。该RNAi制剂是由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，其中dsRNA是由三个基因衣壳蛋白CP、辅助成分‑蛋白酶HC‑Pro和基因组连接蛋白VPg制得的，它们对PVY病毒在植物体内复制增殖移动起到关键作用的基因。本发明提供的纳米化RNAi制剂用于PVY的病毒防治，可使dsRNA的稳定性更强、作用更加持久，能起到良好的病毒防治效果，本发明在PVY病毒防治领域具有良好的应用前景。

Description

纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种纳米化RNAi制剂在PVY防治中的新应用。
背景技术
马铃薯Y病毒(Potato Virus，PVY)的宿主广泛，是全世界范围内的一种病毒，可引起植物叶脉坏死，造成重大的经济损失，但该病毒至今仍缺少有效的防治措施。
近年来，已有研究报道了通过纳米材料与dsRNA结合的方式，解决dsRNA存在的自身稳定性差、易降解等问题，达到对某些植物病毒的良好防治效果。如中国专利文献CN109169702A公开了一种纳米化的RNAi制剂在TMV病毒防治方面的应用，该现有技术具有环境友好、持效时间长、对作物无害等多重优点，能有效防治TMV病毒。尽管纳米化的RNAi制剂在TMV病毒防治方面取得良好效果，但对于该制剂在PVY病毒防治的应用研究鲜少，所以能有效利用现有技术的思路，将该制剂运用到PVY的病毒防治中，对于该病毒的大规模防治具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，该制剂具有稳定性强、不易被降解、促进dsRNA在植物体内穿梭和转运来增加药效等优点，能有效防治PVY。
为了达到上述目的，本发明采用的具体技术方案为：
本发明提供了纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，所述纳米化RNAi制剂是由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，所述dsRNA是包括衣壳蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg的三个对PVY在植物体内复制增殖移动起到关键作用的蛋白基因制得。
作为优选，所述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：
选取经PVY侵染后的植物叶片，提取其总RNA后，通过逆转录过程得到PVY的cDNA；
以所述PVY的cDNA为模板，设计CP、HC-Pro和VPg序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到所述三种基因的扩增产物；
以所述扩增产物为模板，体外合成dsRNA。
作为优选，所述dsRNA的浓度为0.8～1.5μg/μl。
作为优选，步骤所述的提取总RNA的方法为Trizol抽提法或根据总RNA提取试剂盒的说明书提取得到。
作为优选，步骤所述CP基因的上下游引物序列为SEQ ID NO.1-2所示的DNA序列，HC-Pro基因的上下游引物序列为SEQ ID NO.3-4所示的DNA序列，VPg基因的上下游引物引物序列为SEQ ID NO.5-6所示的DNA序列。
作为优选，所述壳聚糖纳米材料的制备方法是将壳聚糖溶解于1％冰乙酸中，制得壳聚糖纳米材料；所述壳聚糖纳米材料溶液的终浓度为1.5～2.5μg/μl。
作为优选，所述纳米化RNAi制剂是将dsRNA液体缓慢加到所述壳聚糖纳米材料溶液中混匀后制得。
作为优选，所述壳聚糖和dsRNA的质量比是(10～30):1。
作为优选，所述纳米化RNAi制剂的使用方法是将成品溶液均匀涂抹或喷施在植物叶片上。
作为优选，所述纳米化RNAi制剂可施用于烟草、番茄、辣椒或马铃薯叶片。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
(1)本发明提供了纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，以PVY的三种基因衣壳蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg为模板体外合成相应的dsRNA，通过与壳聚糖纳米材料的结合提高dsRNA的稳定性，使其能更稳定的引起植物体内的RNAi；
(2)本发明提供的制剂除了能增加dsRNA的稳定性，还能促进dsRNA在植物体内的转运和穿梭，达到增加药效的目的；
(3)本发明提供的制剂dsRNA浓度为0.8～1.5μg/μl，壳聚糖纳米材料溶液浓度为1.5～2.5μg/μl，且当壳聚糖纳米材料溶液与dsRNA的混合比例为(10～30:1)时两者混合后的效果良好；
(4)本发明提供的纳米化RNAi制剂可采用喷洒或施肥的方式，应用于PVY的防治；
(5)本发明提供的纳米化RNAi制剂可作为生物助长器，应用于农业方面的相关生产中。
附图说明
图1为本发明实施例1所提供的提取PVY RNA的琼脂糖凝胶电泳结果图，图中：从左到右的泳道分别为Marker、PVY RNA1、PVY RNA2、PVY RNA3；
图2为本发明实施例1所提供的体外转录合成dsRNA的琼脂糖凝胶电泳结果图，图中：从左到右的泳道分别为Marker、对照组、CP dsRNA、HC-Pro dsRNA和VPg dsRNA；
图3为本发明实施例1所提供的dsRNA与不同比例壳聚糖融合的琼脂糖凝胶电泳图，图中：从左到右的泳道分别为Marker，CP dsRNA：壳聚糖1:2，1:5，1:10，1:20，1:30；Marker，HC-Pro dsRNA:壳聚糖1:2，1:5，1:10，1:20，1:30；Marker，VPg dsRNA:壳聚糖1:2，1:5，1:10，1:20，1:30。
图4为本发明实施例2所提供的经PVY和dsRNA-壳聚糖接种后烟草叶片的表型结果，图中4-1、4-2、4-3、4-4、4-5分别为CP dsRNA+PVY烟草感病情况、HC-Pro dsRNA+PVY烟草感病情况、VPg dsRNA+PVY烟草感病情况、PVY烟草染病情况和阴性对照组感病情况。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，所述纳米化RNAi制剂是由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，所述dsRNA是包括衣壳蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg的三个对PVY在植物体内复制增殖移动起到关键作用的蛋白基因制得。
dsRNA是由三个基因蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg制得的，选取这三个基因的原因在于CP基因作为病毒的衣壳蛋白，包裹病毒的基因组单链RNA，同时也在细胞间的复制增殖移动，蚜虫传播和基因组扩增等方面产生重要影响；HC-Pro在基因组的扩增，自身互作，细胞间的长距离运输，病毒的种传等方面起到重要作用；VPg基因也在长距离运输和基因组扩增过程中担任重要的角色，所以三个基因在病毒的复制增殖移动方面均起到十分重要的作用，通过RNAi技术特异性的沉默三个重要的功能基因，对于PVY病毒的防治意义重大。
在一优选实施例中，所述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：
S1：选取经PVY侵染后的植物叶片，提取其总RNA后，通过逆转录过程得到PVY的cDNA；
S2：以所述PVY的cDNA为模板，设计HC-Pro、CP和VPg序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到所述三种基因的扩增产物；
S3：以所述扩增产物为模板，进行dsRNA体外合成。
在一优选实施例中，所述dsRNA的浓度为0.8～1.5μg/μl。
其中，dsRNA的浓度可选择0.8、0.9、1.0、1.1、1.3、1.5μg/μl等数值。
在一优选实施例中，所述提取总RNA的方法为Trizol抽提法或根据总RNA提取试剂盒的说明书提取得到。
在一优选实施例中，所述CP基因的上下游引物序列为SEQ ID NO.1-2所示的DNA序列，HC-Pro基因的上下游引物序列为SEQ ID NO.3-4所示的DNA序列，VPg基因的上下游引物引物序列为SEQ ID NO.5-6所示的DNA序列。
在一优选实施例中，所述壳聚糖纳米材料的制备方法是将壳聚糖溶解于1％冰乙酸中，制得壳聚糖纳米材料；所述壳聚糖纳米材料溶液的终浓度为1.5～2.5μg/μl。
其中壳聚糖纳米材料溶液终浓度可选择1.8、1.9、2.0、2.2或2.5μg/μl等数值。
本发明还提供了纳米化RNAi制剂的制备方法是将dsRNA液体缓慢加到所述壳聚糖纳米材料溶液中混匀后制得。
在一优选实施例中，所述壳聚糖和dsRNA的质量比是(10～30):1。
其中，若质量比过低，会使许多的dsRNA未与壳聚糖结合，最终影响PVY病毒防治的效果，若比例过高，会使许多壳聚糖纳米材料未附着dsRNA，造成不必要的浪费。
在一优选实施例中，所述纳米化RNAi制剂的使用方法是将成品溶液均匀涂抹或喷施在植物叶片上。
其中，在使用时需要向成品溶液中加入金刚砂，目的是为了使叶片产生伤口，促进PVY病毒侵染，保证病毒接种的成功率，以便更好的了解壳聚糖dsRNA防治效果。
在一优选实施例中，所述纳米化RNAi制剂可施用于烟草、番茄、辣椒或马铃薯。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的用于防治PVY的纳米化RNAi制剂及其制备方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
用于防治PVY的纳米化RNAi制剂的制备方法，包括以下步骤：
(S1)：使用总RNA提取试剂盒进行植物叶片植物总RNA的提取，具体步骤如下：
S1-1：称取50～100mg植物叶片放入1.5ml RNA-Free离心管中，使用研磨棒在液氮中迅速研磨成粉末，加入添加了β-巯基乙醇的500μl SL涡旋混匀。12000rpm，离心2min；
S1-2：将上清液转移至过滤柱CS上，过滤柱CS放于收集管，12000rpm离心2min，在吸头避免吸取底部沉淀的情况下小心吸取收集管中的上清液到新的1.5ml RNA-Free离心管中；
S1-3：向离心管中加入0.4倍上清体积的无水乙醇。来回颠倒混匀，将溶液全部转入吸附柱CR3中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管；
S1-4：向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1,12000rpm离心30～60s，弃掉废液，将吸附柱放回收集管；
S1-5：配置DNaseI溶液：10μl DNaseI加入70μl RDD溶液，缓慢混匀；
S1-6：向吸附柱CR3中加入80μl DNaseI溶液，室温下静置15min；
S1-7：向CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心30～60s,弃置废液，将吸附柱放回收集管；
S1-8：向吸附柱中CR3中加入500μl漂洗液RW(加入无水乙醇)，静置2min，12000rpm离心30～60s，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管，去除色素等杂质。吸附柱放入新收集管中，12000rpm离心2min，离心后吸附柱CR3室温静置，通风晾干；
S1-9：将吸附柱CR3放入RNase-Free离心管中，加入30～50μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，4℃12000rpm离心2min。
最后，将提取的RNA经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所述，然后将提取的RNA置于-80℃超低温冰箱中保存。
(S2)：PVY基因组cDNA的合成，该反应利用天根的FastKing RT Kit(With gDNase)FastKing cDNA第一链合成试剂盒进行逆转录过程，具体操作如下：
S2-1：模版RNA在冰上进行解冻，5×gDNA Buffer，FQ-RY Primer Mix,10×KingRT Buffer，RNase-Free ddH2O在室温的条件下解冻，之后放置在冰上，之后的几步均在冰上完成；
S2-2：2μl 5×gDNA Buffer与RNA 8μl混匀离心42℃孵育3min，完成后放于冰上；
S2-3：配制反转录体系混合液体系，具体体系为：10×King RT Buffer 2μl；Fasting RT Enzyme Mix 1μl；FQ-RY Primer Mix 2μl；RNase-Free ddH2O 5μl；
S2-4：将反转录反应中产生的溶液加入(3)配置的混合液中，混匀；
S2-5：42℃，孵育15min；
S2-6：95℃，孵育3min，产物置于-80℃超低温冰箱中保存。
(S3)：CP、HC-Pro和VPg的基因扩增
S3-1：根据序列信息设计三个基因的引物，引物序列如表1所示：
表1：CP、HC-Pro和VPg基因扩增引物及相应序列
S3-2：利用表1所示引物对PVY基因组进行PCR扩增反应，得到CP、HC-Pro和VPg三个基因的扩增产物；
PCR反应体系具体为：Taq mix 12.5μl；Genomic DNA(PVY)1μl；Primer F 0.5μl；Primer R 0.5μl；H2O 11μl；
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，Tm退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min，最后12℃保温。
(S4)：体外转录制备三个基因的dsRNA，参照T7RiboMAXtm Express RNAi System试剂盒的说明书进行体外转录制备，具体操作如下：
S4-1：dsRNA的制备：取8μl PCR扩增产物配置反应体系，其中，线性PCR产物中的DNA能够产生单链的转录母链，将其作为实验组；而Express Positive ControlTemplate不能产生完整的母链，因此无法产生dsRNA，将它作为对照组；
实验组dsRNA的合成体系的配制：RiboMAX ExpressTM T7 2X buffer* 10μl；linear DNA template 8μl；Nuclease-Free Water 7μl；Enzyme Mix,T7Express 2μl；
对照组dsRNA的合成体系的配制：RiboMAX ExpressTM T7 2X buffer* 10μl；Express Positive Control Template 1μl；Nuclease-Free Water 7μl；EnzymeMix,T7Express 2μl；
在冰盒上完成体系的配置，体系配置完毕后轻轻混匀，在PCR仪中恒温37℃孵育3h。
S4-2：去除DNA模版,退火dsRNA,移除ssRNA:将上一步产物在PCR仪中70℃孵育10min，然后缓慢冷却到室温，通过这种操作来退火dsRNA。稀释RNase Solution到1:200，及加入1μl RNase Solution到199μl的去离子水中。取1μl稀释后的RNase Solution和1μl的RQ1RNase-Free DNase，并在PCR仪中37℃孵化30min，以此除去残留的单链RNA和双链DNA模版；
S4-3：纯化dsRNA：加入2μl 3M Sodium Acetate(PH5.2)和50μl 95％的酒精，混合均匀并在冰上放置5min，出现浑浊之后12000转离心10min，在底部能够观察到白色的沉淀，抽取并弃置上清液，用0.5ml预冷过的70％酒精清洗底部沉淀。在空气中室温干燥15min，酒精挥发完毕，加入40～100μl去离子水，得到dsRNA；
S4-4：dsRNA的检测：通过琼脂糖凝胶电泳，dsRNA加入loading buffer观察条带是否单一且明亮，电泳检测结果见图2；并使用微量分光光度计测定dsRNA的浓度。
(S5)壳聚糖纳米材料与dsRNA的结合，具体操作步骤如下所示：
S5-1：将壳聚糖溶解于1％冰乙酸中，制得终浓度为2μg/μl的壳聚糖溶液A；
S5-2：将不同浓度的PVY dsRNA溶液缓慢加入壳聚糖溶液A中，HC-Pro、CP和VPg三种dsRNA分别设置5个混合比例，dsRNA:冰乙酸壳聚糖溶液1:2、1:5、1:10、1:20、1:30装管，并标记；
S5-3：以6:3.5的比例混合含有dsRNA的壳聚糖溶液和1％的SDS溶液，前者缓慢加入后者，不能改变加入顺序，震荡10min；
S5-4：取5μl混合溶液加入1μl 6×DNA loading buffer，琼脂糖凝胶电泳观察结果。若无条带出现，且点样孔周围出现明亮条带，证明壳聚糖dsRNA稳定性强，结合成功，dsRNA与不同壳聚糖融合的结果见图3。
实施例2
一种实施例1的用于防治PVY的纳米化RNAi制剂在PVY病毒治疗中的应用，具体应用方法如下：
S1：实验室烟草的种植和移栽：
取15个一次性塑料杯，酒精灯灼烧玻璃棒在塑料杯底部戳洞，方便泥土吸水。营养土与蛭石1:1混合保证充足的营养和强大吸水能力。在花盆中率先种植烟草，待植株高度适宜后移栽进入塑料杯中。移栽过程中保证烟草根部完整，保证充足的供水，恒温室每日18h光照。等待2～3周；
S2：dsRNA与PVY的接种：
带有荧光标记的GFP-PVY经过在液氮中研磨后加入10ml 1×PBS缓冲液，加入少量金刚砂(产生伤口)，取0.1ml涂抹在烟草叶片上轻柔的，朝一个方向涂匀。本实验采用PVY和dsRNA同时接种的方法，壳聚糖dsRNA制剂通过涂抹或者喷施的方法施用在烟草叶片上，每种处理3个重复，3盆烟草仅接种GFP-PVY作为阳性对照组,3盆烟草喷施等量壳聚糖溶液作为阴性对照组。
S3：植物全蛋白质的提取，具体步骤如下：
对PVY和dsRNA-壳聚糖接种后的叶片通过植物蛋白提取试剂盒进行蛋白质的提取，用于Western Blot。
(1)取150mg植物叶片在液氮中研磨；
(2)加入1ml裂解液，4℃处理20min，每5min进行一次震荡；
(3)在4℃的高速冷冻离心机中14000rpm离心30min；
(4)吸取上清液到新的离心管，-80℃保存，各组烟草叶片表型结果见图4。
Western Blot结果表明，CP-dsRNA、HC-dsRNA和VPg-dsRNA 3种壳聚糖纳米制剂后，PVY病毒CP蛋白的表达量明显下降，说明CP-dsRNA、HC-dsRNA和VPg-dsRNA 3种壳聚糖纳米制剂对PVY的复制侵染有抑制作用。
序列表
<110> 中国农科院烟草研究所
山东省花生研究所
贵州省烟草公司遵义市公司
<120> 纳米化的RNAi制剂在PVY防治中的应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> PVYCP-F
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ATTCT CTAGA AGCTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA TGACA CAATT GATGC AGTAG AA
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> PVYCP-R
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<210> 3
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<212> DNA
<213> PVYHC-F
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ATTCT CTAGA AGCTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA TGGAT TCAAT GGTTC AGTTC TC
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<211> 57
<212> DNA
<213> PVYHC-R
<400> 4
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<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> PVYVPg-F
<400> 5
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<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> PVYVPg-R
<400> 6
ATTCT CTAGA AGCTT AATAC GACTC ACTAT AGGGT TCATG CTCCA CCTCC TGTGC TG
<210> 7
<211> 807
<212> DNA
<213> CP-U25672.1
<400> 7
1 ATGGCAAATG ACACAATTGA TGCAGTAGAA AGCAACAAGA AAGAATCAAA ACCAGAGCAA
61 GGCAGCATCC AGTCAAACTC GAACAAAGGA ATAGATAAGG ATGTGAATGC TGGTACGTCC
121 GGAACACATA CTGTGCCGAG AATCAAGGCT ATCACGTCCA AAATGAGAAT GCCCAAAAGC
181 AAGGGAGCAA CCGTGCTAAAT TTAGAACACT TGCTTGAGTA CGCTCCACAA CAAATTGATA
241 TTTCAAATAC TCGGGCAACT CAATCACAGT TTGATACGTG GTATGAGGCA GTGCGGATGG
301 CATACGACAT AGGAGAAACT GAGATGCCAA CTGTGATGAA TGGGCTTATG GTTTGGTGCA
361 TTGAAAATGG AACCTCGCCA AATGTCAACG GAGTTTGGGT TATGATGGAT GGGAATGAAC
421 AAGTTGAGTA CCCGTTGAAA CCAATCGTTG AGAATGCAAA ACCAACCCTT AGGCAAATCA
481 TGGCACATTT CTCAGATGTT GCAGAAGCGT ATATAGAAAT GCGCAACAAA AAGGAACCAT
541 ATATGCCACG ATATGGTTTA ATTCGAAATC TGCGGGATGT GGGTTTAGCG CGTTATGCCT
601 TTGACTTTTA TGAGGTCACA TCACGAACAC CAGTGAGGGC TAGGGAAGCG CACATTCAAA
721 TGAAGGCCGC AGCATTGAAA TCAGCCCAAC CTCGACTTTT CGGGTTGGA CGGTGGCATC
781 AGTACACAAG AGGAGAACAC AGAGAGGCAC ACCACCGAGG ATGTCTCTCC AAGTATGCAT
807 GCTCTACTTG GAGTCAAGAA CATGTGA
<210> 8
<211> 1396
<212> DNA
<213> HC-Pro-JF927762
<400> 8
1 GGGGTTATGG ATTCAATGGT TCAGTTCTCA AGCGCTGAAA GCTTTTGGAA GGGATTGGAC
61 GGCAATTGGG CACAAATGAG ATATCCTACA GATCATACAT GTGTGGCAGG TCTACCAGTT
121 GAAGACTGTG GCAGAGTTGC AGCGATAATG ACACACAGTA TTTTACCGTG CTATAAGATA
181 ACCTGCCCTA CCTGTGCCCA ACAGTATGCC AACTTGCCAG CCAGTGACTT ACTTAAGATA
241 TTACACAAGC ACGCAAGTGA TGGTTTAAAT CGATTAGGGG CAGACAAAGA TCGCTTTGTG
301 CATGTCAAAA AGTTCTTAAC AATCTTAGAG CACTTAACTG AACCGGTTGA TCTGAGTCTA
361 GAAATTTTCA ATGAAGTGTT CAAGTCTATA GGGGAGAAGC AACAATCACC TTTCAAAAAC
421 CTGAATATTC TGAATAATTT CTTTTTGAAA GGAAAGGAAA ATACAGCTCG TGAATGGCAG
481 GTGGCTCAAT TAAGCTTACT TGAATTGGCA AGATTCCAAA AGAACAGAAC GGATAATATC
541 AAGAAAGGAG ACATTTCGTT CTTTAGGAAT AAACTATCTG CCAAAGCAAA TTGGAACTTG
601 TATCTGTCAT GTGATAACCA GCTGGATAAG AATGCAAACT TCCTGTGGGG ACAGAGGGAA
721 TATCATGCTA AGCGATTTTT CTCGAATTAT TTCGAGGAAA TTGATCCAGC GAAGGGCTAT
781 TCAGCATACG AAAATCGTTT GCATCCGAAT GGGACAAGAA AACTTGCAAT TGGAAACCTA
841 ATTGTACCAC TTGATCTGGC TGAGTTTAGG CGGAAGATGA AAGGTGATTA TAAAAGACAG
901 CCAGGGGTGA GTAAGAAGTG CACGAGCTCG AAGGATGGAA ACTACGTGTA TCCCTGTTGT
961 TGCACTACAC TTGATGATGG CTCAGCTGTT GAATCAACAT TTTACCCGCC AACTAAGAAG
1021 CACCTCGTAA TAGGTAATAG TGGCGACCAA AAGTATGTTG ACTTACCAAA AGGGAATTCT
1081 GAGATGTTAT ATATTGCCAG GCAAGGCTTC TGTTACATTA ACATTTTCCT CGCGATGTTG
1141 ATTAACATTA GTGAGGAAGA TGCAAAGGAT TTCACTAAGA AGGTTCGTGA CATGTGTGTG
1201 CCAAAGCTTG GAACCTGGCC AACCATGATG GATCTGGCTA CAACTTGTGC TCAAATGAAA
1261 ATATTCTACC CTGATGTTCA TGATGCAGAA CTGCCTAGAA TACTAGTCGA TCACGAAACA
1321 CAGACATGCC ATGTGGTTGA CTCGTTTGGC TCACAAACAA CTGGGTATCA TATTCTAAAA
1381 GCATCCAGCG TATCTCAACT TATCTTGTTT GCAAATGATG AATTAGAATC TGATATAAAA
1396 CATTATAGAG TTGGT
<210> 9
<211> 505
<212> DNA
<213> VPg-KC005987
<400> 9
1 GGGAAAAATA AATCCAAAAG AATCCAAGCC TTGAAGTTTC GCCATGCTCG TGACAAAAGG
61 GCTGGCTTTG AAATTGACAA CAATGATGAC ACAATAGAGG AATTCTTCGG ATCTGCATAC
121 AGGAAAAAGG GAAAAGGTAA AGGTACCACA GTTGGTATGG GTAAGTCAAG CAGGAGGTTC
181 ATCAACATGT ATGGGTTTGA TCCAACAGAG TACTCATTCA TCCAATTCGT TGATCCACTC
241 ACTGGGGCGC AAATAGAAGA AAATGTCTAT GCTGACATTA GAGATATTCA AGAGAGATTT
301 AGTGAAGTGC GAACGAAAAT GGTTGAGAAT GATGACATTG AAATGCAAGC CTTGGGTAGT
361 AACACGACCA TACATGCATA CTTCAGGAAA GATTGGTCTG ACAAAGCTTT GAAGATTGAT
421 TTAATGCCAC ATAACCCACT CAAAGTTTGT GACAAAACAA ATGGCATTGC CAAATTTCCT
481 GAGAGAGAGC TCGAACTAAG GCAGACTGGG CCAGCTGTAG AAGTCGACGT GAAGGACATA
505 CCAGCACAGG AGGTGGAGCA TGAA

Claims (10)

1.纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂是由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，所述dsRNA是包括衣壳蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg的三个对PVY在植物体内复制增殖移动起到关键作用的蛋白基因制得。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：
选取经PVY侵染后的植物叶片，提取其总RNA后，通过逆转录过程得到PVY的cDNA；
以所述PVY的cDNA为模板，设计CP、HC-Pro和VPg序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到所述三种基因的扩增产物；
以所述扩增产物为模板，体外合成dsRNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述dsRNA的浓度为0.8～1.5μg/μl。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述提取总RNA的方法为Trizol抽提法或根据总RNA提取试剂盒的说明书提取得到。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CP基因的上下游引物序列为SEQ IDNO.1-2所示的DNA序列，HC-Pro基因的上下游引物序列为SEQ ID NO.3-4所示的DNA序列，VPg基因的上下游引物引物序列为SEQ ID NO.5-6所示的DNA序列。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖纳米材料的制备方法是将壳聚糖溶解于1％冰乙酸中，制得壳聚糖纳米材料；所述壳聚糖纳米材料溶液的终浓度为1.5～2.5μg/μl。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂是将dsRNA液体缓慢加到所述壳聚糖纳米材料溶液中混匀后制得。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖和dsRNA的质量比是(10～30):1。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂的使用方法是将成品溶液均匀涂抹或喷施在植物叶片上。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂可施用于烟草、番茄、辣椒或马铃薯。
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