CN103074348A - 重组鲤鱼Nrf2基因、蛋白及其制备与检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组鲤鱼Nrf2基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。重组鲤鱼Nrf2基因具有SEQIDNO:1所示的序列。重组鲤鱼Nrf2蛋白具有SEQIDNO:2所示的序列。本发明获得的鲤鱼Nrf2基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测Nrf2基因的组织表达特异性，也可进一步实现鲤鱼Nrf2基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的Nrf2蛋白，进而可用于抗体生产，检测鲤鱼各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的Nrf2基因的表达情况等。

Description

重组鲤鱼Nrf2基因、蛋白及其制备与检测方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组鲤鱼Nrf2基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。

背景技术

核因子相关因子2 (NF-E2-related factor 2，Nrf2)是调控肠粘膜谷胱甘肽-S-反转移酶（glutathione S-trans ferase，GST）基因表达的关键信号分子。抗氧化反应元件（Antioxidant Response Element，ARE）是GST基因启动子区域的5′-TGACnnnGC-3′序列。研究表明：信号分子Nrf2与GST基因的ARE序列结合，可激活GST转录。鼠和人的Cu/ZnSOD基因启动子上游区域存在ARE序列。然而，不同物种之间Cu/ZnSOD的基因全序列特征存在很大差异。人的Cu/ZnSOD基因组序列为8419bp（有5个外显子和4个内含子），但海湾扇贝基因全序列仅为4279bp（只有4个外显子和3个内含子），而果蝇基因全序列比较短，只有1425bp（仅有2个外显子和1个内含子）。因此，鱼的Cu/ZnSOD基因表达的调控与其它动物可能存在差异，需要进一步研究。有限的研究表明：Nrf2是大鼠心脏Cu/ZnSOD基因转录的信号分子。但是，Nrf2是否是水生动物肠细胞Cu/ZnSOD基因转录的信号调控分子未见研究报道，开展研究非常必要。

迄今，关于Nrf2在哺乳动物细胞抗氧化蛋白质合成中发挥的调节作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳动物细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见有关低等脊椎动物鱼类细胞中Nrf2的研究报道，也未见有鲤鱼Nrf2基因的cDNA全长核苷酸序列和与其对应的氨基酸序列的报道。

研究和开发与鲤鱼Nrf2蛋白相关的基因克隆及其重组表达具有极其重要的作用，因为研究清楚鲤鱼的Nrf2基因和蛋白的功能，可以用于研究营养物质提高细胞抗氧化能力的机制等方面，由重组Nrf2基因序列设计的荧光定量引物和表达蛋白制备的抗体可以检测Nrf2基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况，对进一步阐明Nrf2调控这些基本生物过程的机理意义重大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组鲤鱼Nrf2基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：一种重组鲤鱼NRF2基因，为下述序列之一：1)序列表中SEQ ID No：1所示的基因序列；2) 将SEQ ID NO :1所示的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQ ID No：1所示的基因序列表达的氨基酸序列相同的基因序列。

一种重组鲤鱼NRF2氨基酸序列，为下述序列之一：1) SEQ ID NO :2所示的由权利要求1所述重组鲤鱼NRF2基因所表达的氨基酸序列；2)将SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与具有与SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白质。

一种上述重组鲤鱼NRF2基因的制备方法，包括下述步骤：

1）采集鲤鱼的总RNA并以其肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链；

2）以步骤1）中的cDNA第一链为模板，利用引物N1、N2进行PCR扩增，得到SEQ ID NO :1所示的序列，所述引物N1具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物N2具有SEQ ID NO :4所示的序列；

所述步骤2）中以Nl、N2为引物，利用DNA聚合酶进行PCR反应的50μl PCR扩增体系中各组分及其比例为：cDNA第一链，2.5 μl；50μM 的N1，0.25μl；50μM的N2，0.25μl；10×LA PCR Buffer II，5.0μl；each 2.5 mM 的dNTP Mixture，8.0μl；ddH₂O，33.5μl；5 U/μl的DNA聚合酶，0.5μl；反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30 sec，72℃延伸2 min，共40个循环；最后72℃延伸 10 min，反应完成。

一种上述方法制备的重组鲤鱼NRF2基因的检测方法，包括下述步骤：

1）将N1和N2 PCR回收产物的PCR扩增采用2×Taq PCR MasterMix进行，50μl PCR扩增体系中各组分及其比例为：50倍稀释的NRF2回收产物，1.0μl；50μM的N3，0.25μl；50μM 的N4，0.25μl；2×Taq PCR MasterMix，25.0μl；ddH₂O，23.5μl；反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5 min，反应完成；所述N3具有SEQ ID NO :5所示的序列，引物N4具有SEQ ID NO :6所示的序列；

2）取5μl PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。

具体地，所述50倍稀释的NRF2回收产物指重组鲤鱼NRF2基因cDNA编码区核苷酸序列的制备方法中所制备的重组鲤鱼NRF2基因cDNA序列。

一种上述方法制备的重组鲤鱼NRF2基因的检测方法，包括下述步骤：

1）将N1和N2 PCR回收产物的PCR扩增采用2×Taq PCR Master Mix进行，50μl PCR扩增体系中各组分及其比例为：50倍稀释的NRF2回收产物，1.0μl；50μM的N5，0.25μl；50μM 的N6，0.25μl；2×Taq PCR Master Mix，25.0μl；ddH₂O，23.5μl；反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min，反应完成；所述N5具有SEQ ID NO :7所示的序列，引物N6具有SEQ ID NO :8所示的序列；

2）取5μl PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。

上述重组鲤鱼NRF2基因在检测鲤鱼NRF2基因的表达情况中的应用。

具体地，鲤鱼NRF2基因的表达情况包括鲤鱼NRF2基因在各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的表达情况。

在检测中，根据SEQ ID NO :1所示序列设计上游引物ND1、下游引物ND2；采用荧光定量PCR扩增，20μl PCR扩增体系中各组分及其比例为：cDNA，2.0μl；10μM 的ND1，1.0μl；10μM的 ND2，1.0μl；                                                

II（2×），10.0μl；dH₂O，6.0μl；反应循环条件：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60 ℃退火15sec，72℃延伸15sec，共44个循环；最后72℃延伸2min，反应完成。

本发明的重组鲤鱼NRF2基因及其表达的蛋白具有极其重要的作用，研究清楚重组鲤鱼NRF2基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养存活率、提高细胞抗氧化能力，以调控细胞生长等方面，由重组NRF2蛋白制备的抗体可以检测NRF2基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。

本发明提供的重组鲤鱼NRF2基因NRF2基因的cDNA全序列为1761bp，为如SEQ ID NO :1所示的基因序列，该序列为编译特异性蛋白的碱基序列。本发明通过比对已知的斑马鱼、人、大鼠、小鼠的NRF2基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据斑马鱼胚胎的NRF2基因（NM_182889.1）cDNA编码区的序列，在不打破氨基酸编码的前提下设计上游引物（5’-从起始密码子ATG的开始），下游引物5’端起始于斑马鱼NRF2基因的终止密码子TAA，设计出了一对用于通过RT-PCR方法扩增鲤鱼NRF2基因cDNA编码区片段的引物(上游引物称为N1，下游引物称为N2)，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了重组鲤鱼NRF2基因的1761bp片段，序列分析表明与斑马鱼的序列（NM_182889.1）同源性为77.4%，且保持了正确的编码。

本发明的目的是通过己知的不同物种的NRF2的核苷酸序列设计引物，然后通过RT-PCR方法获得重组鲤鱼NRF2基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码重组鲤鱼NRF2蛋白的基因的cDNA的编码区1761bp的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列（序列详见SEQ ID NO :1所示的基因序列、SEQ ID NO :2所示的蛋白序列）。

综上所述，本发明的有益效果是：本发明研究和开发的重组鲤鱼NRF2蛋白相关的基因克隆及其重组表达具有极其重要的作用，因为研究清楚鲤鱼的NRF2基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养存活率、提高细胞抗氧化能力，防止细胞氧化损伤，以调控细胞生长等方面，由重组NRF2蛋白制备的抗体可以检测NRF2基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。

附图说明

图1是从重组鲤鱼NRF2基因序列的电泳图；

图2是以N1和N2引物对扩增产物为模板，以N3、N4为引物或以N5、N6为引物进行PCR鉴定的电泳图；

图3是以N1和N2引物对扩增产物为模板，以N3、N4为引物或以N5、N6为引物进行PCR鉴定的电泳图；

图4是鲤鱼不同肠段信号分子Nrf2 mRNA相对表达量的检测示意图；

图5是肌醇对幼建鲤前肠Nrf2总蛋白的影响的检测示意图；

图6是肌醇对幼建鲤中肠Nrf2总蛋白的影响的检测示意图；

图7是肌醇对幼建鲤后肠Nrf2总蛋白的影响的检测示意图；

图8是肌醇对幼建鲤前肠Nrf2磷酸化的影响的检测示意图；

图9是肌醇对幼建鲤中肠Nrf2磷酸化的影响的检测示意图；

图10是肌醇对幼建鲤后肠Nrf2磷酸化的影响的检测示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图，对本发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本实施例的重组鲤鱼NRF2基因为序列表中SEQ ID No：1所示的基因序列。作为本领域的技术人员，该序列也可以是将SEQ ID NO :1所示的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQ ID No：1所示的基因序列表达的氨基酸序列相同的基因序列。如610位的A替换成G,序列编码的氨基酸序列是相同。

本实施例的重组鲤鱼NRF2氨基酸序列为SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列；作为本领域的技术人员，该序列也可以是将将SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与具有与SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白质。如123位的A替换成G，蛋白质的生物活性不会发生改变。

实施例2：

为了获取实施例1中所述的重组鲤鱼NRF2基因序列，可以采用本实施例的方法，具体如下：

首先按照提取总RNA的标准要求采集鲤鱼（Common carp, Cyprinus carpio）的各类组织样本。现场宰杀鲤鱼后立即取肾脏、肠道、肌肉、脾脏及肝胰脏等组织块，放入冷冻管后立即入液氮保存，带回实验室后置于-80℃冰箱保存备用。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒（TaKaRa RNAiso Reagent）并按照使用说明书的操作程序提取鲤鱼肠道、肌肉、肾脏、肝胰脏及脾脏等组织的总RNA，最后根据文献报道的哺乳动物NRF2基因在各类组织中的表达情况和总RNA提取结果，选定以肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第一链为模板，利用特异性引物N1、N2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电泳后分离的目的片段切胶回收，测定双链cDNA的浓度，以巢式PCR方法对扩增产物进行鉴定。N1和N2引物对的扩增产物通过N3和N4、N5和N6的PCR扩增，电泳鉴定的得到预期大小的DNA片段，初步验证了N1和N2扩增产物的正确性。将N1和N2引物对的扩增产物的样品送上海生工生物工程有限公司测序。作为结果，获得了1761bp的鲤鱼cNRF2基因cDNA编码区的核苷酸序列，即序列表中SEQ ID No：1所示的基因序列。

显示上面提到的特征的本发明的特异性PCR引物N1和N2，可以利用RT-PCR方法扩增出鲤鱼的cNRF2基因的cDNA编码区片段。根据本发明获得的重组鲤鱼NRF2基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测NRF2基因的组织表达特异性，也可进一步实现鲤鱼NRF2基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的NRF2蛋白，进而可用于抗体生产，检测鲤鱼各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的NRF2基因的表达情况等等。

鲤鱼NRF2基因的cDNA编码区1761bp片段的克隆

为了克隆来自鲤鱼肠道组织细胞的NRF2基因包含1761 bp编码区的cDNA，根据公开的核苷酸序列（NM_182889.1），首先设计合成允许扩增1761bp的cDNA的PCR引物对，即：

上游引物5'- ATGATGGAGATTGAATTGCCTAA -3'（N1）

下游引物5'- CCAAGCTAGTTGTTCTTTACGAG -3'（N2）。

然后设计合成了另外两对用于鉴别N1和N2扩增产物的引物，即：

上游引物N3，5'-GACGCACACCAACACGACAAAT-3'，

下游引物N4，5'-TATAAGGGCAACCAAATGGAAT-3'

上游引物N5，5'- CAGATGAAAGCGAAGAACCCA-3'，

下游引物N6，5'-TAAGGCGAGGAACGAGAAAAA-3'。

为了利用RT-PCR方法克隆NRF2基因的cDNA，从鲤鱼肠道组织提取总RNA，利用TaKaRa总RNA提取试剂盒（TaKaRa RNAiso Reagent）并按照使用说明书的操作程序提取鲤鱼肠道组织总RNA，进行电泳检测和紫外测定RNA浓度后置于-80℃冰箱保存备用。然后，利用TaKaRa的M-MLV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录反应，得到cDNA第一链。

以上面得到的cDNA第一链为模板，Nl、N2为引物，利用TaKaRa LA Taq DNA聚合酶进行PCR反应。50μl PCR扩增体系：cDNA，2.5 μl；N1（50μM），0.25μl；N2（50μM），0.25μl；10×LA PCR Buffer II (Mg²⁺ Plus)，5.0μl；dNTP Mixture (each 2.5 mM)，8.0μl；ddH₂O，33.5μl；TaKaRa LA Taq (5 U/μl)，0.5μl。反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60 ℃退火30sec，72℃延伸2 min，共40个循环；最后72℃延伸8 min，反应完成。取5μl PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测（100V，10 min），凝胶成像系统观察分析结果。作为结果，得到了1761bp的特异性目的片段（SEQ ID NO :1所示序列）。

N1和N2 PCR回收产物的PCR扩增采用2×Taq PCR Master Mix（KT201）进行，50μl PCR扩增体系：NRF2回收产物（50×稀释），1.0μl；N3（50μM），0.25μl和N4（50μM）或N5（50μM），0.25μl和N6（50μM），0.25μl；2×Taq PCR Master Mix，25.0μl；ddH₂O，23.5μl。反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min，反应完成。取5μl PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测（100V，10min），凝胶成像系统观察分析结果。作为结果，分别得到了约900（图2）和约550 bp（图3）的扩增产物。其大小与N3、N4引物对设计的扩增产物896bp和N5、N6引物对设计的扩增产物535bp相符，表明扩增产物的特异性，DNA序列就是预期的序列。如果扩增产物与设计目的扩增大小不相符，则表明扩增产物不具有特异性，DNA序列不是预期的序列。

经过两次鉴定，将具有特异性的N1、N2扩增产物送往上海生工生物工程有限公司用测序。作为结果，获得了1761bp的重组鲤鱼NRF2基因的核苷酸序列（图2）。

重组鲤鱼NRF2基因的核苷酸序列

SEQ ID NO: 1显示了本实施实例所获得的重组鲤鱼NRF2基因的核苷酸序列，SEQ ID NO: 2是由此编译的氨基酸序列。重组NRF2基因的核苷酸序列包括了1761bp的开放阅读框，该开放阅读框编码586个氨基酸残基，分子量为66071.96Da。

本发明所获得的重组鲤鱼NRF2基因的核苷酸序列与斑马鱼（NM_182889.1）、人（NM_006164.4）、小鼠（NM_010902.3）和大鼠（NM_031789.2）的NRF2基因cDNA的核苷酸序列的比较。结果表明：1）鲤鱼NRF2基因cDNA的核苷酸序列与斑马鱼、人、小鼠和大鼠的NRF2基因cDNA的核苷酸序列分别有77.4、50.1、50.0和50.3 %的相似性。由鲤鱼的这段核苷酸序列推导出的氨基酸序列与斑马鱼、人、小鼠和大鼠的相似性分别为：82.5、46.7、46.7和46.7 %。

正如清楚说明的和如上说明，本发明提供利用RT-PCR法克隆重组鲤鱼NRF2基因的引物和编码鲤鱼的NRF2蛋白质的1761bp的cDNA和由此获得的氨基酸序列。此cDNA包括了1761bp的核苷酸序列，它编码含有586个氨基酸残基的蛋白质，经过进一步的改造后它可以亚克隆到如pET或pcDNA3.1等原核或真核表达载体上进行表达。重组的cDNA片段能够表达出完整的NRF2蛋白多肽段，进而可用于抗体生产，检测鲤鱼各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的NRF2基因的表达情况等等。

实施例3：

本实施例为实施例1和实施例2记载的重组鲤鱼NRF2蛋白在测定鲤鱼不同肠段信号分子Nrf2 mRNA相对表达量的应用。

本实例以鲤鱼肠道对象，根据本发明克隆得到的重组鲤鱼Nrf2基因序列，设计了一对Nrf2特异性定量扩增引物检测了鲤鱼不同肠段Nrf2 mRNA的表达情况。各肠段Nrf2 mRNA相对表达量以同一体系中Nrf2与管家基因β-actin的荧光值的相对比值×100来表示。

检测结果如图4所示，结果表明：鲤鱼不同肠段肠道组织Nrf2 mRNA相对表达量存在显著差异。其中，第1和3肠段Nrf2 mRNA相对表达量显著高于其它各肠段（P<0.05）；第7肠段Nrf2 mRNA相对表达量显著低于其它各肠段（P<0.05）。结果说明：Nrf2蛋白对鱼类肠道前段的抗氧化作用调控作用更强，为研究营养物质提高鱼肠道抗氧化能力的分子机制奠定重要基础。

实施例4：

本实施例为实施例1和实施例2记载的重组鲤鱼NRF2蛋白在测定肌醇对幼建鲤不同肠段Nrf2总蛋白的影响中的应用。

本实例根据重组鲤鱼Nrf2的C末端筛选制备的Nrf2总蛋白抗体，检测量肌醇对鲤鱼不同肠段Nrf2总蛋白表达量的影响。

检测结果如图5、图6、图7所示，结果表明：肌醇显著提高了鲤鱼前肠和中肠Nrf2的总蛋白含量（P < 0.05）；但对后肠Nrf2的总蛋白含量影响不显著（P > 0.05）。结果说明肌醇可以通过提高Nrf2蛋白量，而增强鱼类前肠和中肠的抗氧化能力，提高肠道健康水平。为生产实践中肌醇的合理提供理论支撑。根据重组鲤鱼Nrf2的C末端筛选制备的Nrf2总蛋白抗体检查鲤鱼肠道的Nrf2总蛋白含量是可行的。

实施例5：

本实施例为实施例1和实施例2记载的重组鲤鱼NRF2蛋白在测定肌醇对鲤鱼不同肠段Nrf2蛋白的39位丝氨酸磷酸化水平的影响中的应用。

本实例根据鲤鱼Nrf2的39位丝氨酸残筛选制备的Nrf2磷酸化抗体，检测量肌醇对鲤鱼不同肠段Nrf2的39位丝氨酸磷酸化水平的影响。结果表明：肌醇显著提高了鲤鱼前肠Nrf2的39位丝氨酸磷酸化水平（P < 0.05）；但对中肠和后肠Nrf2的39位丝氨酸磷酸化水平影响不显著（P > 0.05）。结果说明肌醇可以通过提高Nrf2的磷酸化水平，增强鱼类前肠的抗氧化能力，提高肠道健康水平。根据重组鲤鱼Nrf2的39位丝氨酸残筛选制备的Nrf2磷酸化抗体检测鲤鱼肠道的Nrf2总蛋白含量是可行的。

如上所述，可以较好的实施本发明。

 <110>  四川农业大学

 

<120>  重组鲤鱼Nrf2基因、蛋白及其制备与检测方法和应用

 

<130>  重组鲤鱼Nrf2基因、蛋白及其制备与检测方法和应用

 

<160>  10   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1761

<212>  DNA

<213>  鲤鱼

 

<400>  1

atgatggaga ttgaattgcc taaaatgcat ccaagccaac aggatatgga tctgatagat     60

 

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ttctcgccca gcgaatactc ccttcagcac actgcggacg acaccctttt tctcgttcct   1740

 

cgccttaaaa gattctcgta a                                             1761

 

 

<210>  2

<211>  586

<212>  PRT

<213>  鲤鱼

 

<400>  2

 

Met Met Glu Ile Glu Leu Pro Lys Met His Pro Ser Gln Gln Asp Met

1               5                   10                  15     

 

 

Asp Leu Ile Asp Ile Leu Trp Arg Gln Asp Val Asp Leu Gly Ala Gly

            20                  25                  30         

 

 

Arg Glu Val Phe Asp Phe Ser Tyr Arg Gln Lys Glu Val Glu Leu Arg

        35                  40                  45             

 

 

Leu Gln Arg Glu Lys Glu Glu Glu Lys Gln Gln Gln Arg Leu Arg Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Gln Glu Lys Ala Leu Leu Ala Gln Leu Gln Leu Asp Glu Glu Thr Gly

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Phe Val Pro Arg Ser Ala Pro Pro Thr His Thr Asn Thr Thr Asn

                85                  90                  95     

 

 

Ala Glu Val Thr Gln Asn Glu Ala Phe Ala Glu Gln Asp Gly Asp Ala

            100                 105                 110        

 

 

Met Ser Phe Asp Glu Cys Met Gln Leu Leu Ala Glu Thr Phe Pro Leu

        115                 120                 125            

 

 

Asp Glu Ala Ala Glu Ser Val Pro Pro Cys Leu Asp Ala Ser Val Pro

    130                 135                 140                

 

 

Pro Ser Thr Asp Leu Met Met Pro Ser Asp Ile Pro Ala Phe Thr Gln

145                 150                 155                 160

 

 

Asn Pro Leu Leu Pro Gly Ser Leu Asp Gln Ala Trp Met Glu Leu Leu

                165                 170                 175    

 

 

Ser Leu Pro Glu Leu Gln Gln Cys Leu Asn Met Gln Met Gln Asp Ser

            180                 185                 190        

 

 

Leu Asp Met Asp Gly Phe Met Lys Pro Ser Thr Glu Ala Gln Asp Pro

        195                 200                 205            

 

 

Asn Tyr Ser Gln Tyr Leu Pro Gly Met Asp His Leu Ser Ser Val Gln

    210                 215                 220                

 

 

Thr Glu Gly Cys Pro Pro Glu Tyr Ile Asn Thr Tyr Asp Gly Ser Phe

225                 230                 235                 240

 

 

Asn Thr Met Val Ser Pro Asn Leu Ser Gln Met Ser Leu Asn Val Pro

                245                 250                 255    

 

 

Asp Val Arg Ala Glu Phe Gly Pro Glu Glu Phe Asn Glu Leu Phe Tyr

            260                 265                 270        

 

 

Pro Glu Met Arg Glu Val Lys Val Asn Ser Gly Pro Leu Thr Ser Asp

        275                 280                 285            

 

 

Glu Gly Asn Thr Val Ser Gln Leu Val Glu Ile Pro Ser Asp Pro Pro

    290                 295                 300                

 

 

Val Asn Thr Met Asp Leu His Ser Phe Ser Pro Gly Ser Phe Ser Ser

305                 310                 315                 320

 

 

Gly Lys Pro Glu Pro Met Ser Glu Phe Pro Asp Ser Asp Ser Gly Leu

                325                 330                 335    

 

 

Ser Leu Asp Ala Ser Pro His Thr Ser Ser Pro Gly Lys Ser Leu Asn

            340                 345                 350        

 

 

Gly Asp Gly Ser Phe Gly Phe Ser Asp Ser Asp Ser Glu Glu Met Asp

        355                 360                 365            

 

 

Gly Ser Pro Gly Asp Met Glu Ser Asp Tyr Ala Glu Ile Phe Pro Leu

    370                 375                 380                

 

 

Val Tyr Leu Thr Asp Glu Ala Gln Ala Ser Leu Ser Glu Lys Pro Pro

385                 390                 395                 400

 

 

Ala Glu Ala Leu Gln Met Lys Ala Lys Asn Pro Lys Ile Glu Pro Ala

                405                 410                 415    

 

 

Glu Ala Ser Gly His Ser Lys Pro Pro Phe Thr Lys Asp Lys Gln Lys

            420                 425                 430        

 

 

Lys Arg Ser Glu Ala Arg Leu Pro Arg Asp Glu Gln Arg Ala Lys Ala

        435                 440                 445             

 

 

Leu Gln Ile Pro Phe Thr Val Asp Lys Ile Ile Asn Leu Pro Val Asp

    450                 455                 460                

 

 

Asp Phe Asn Glu Met Met Ser Lys His Gln Leu Asn Glu Ala Gln Leu

465                 470                 475                 480

 

 

Ala Leu Val Arg Asp Ile Arg Arg Arg Gly Lys Asn Lys Val Ala Ala

                485                 490                 495    

 

 

Gln Asn Cys Arg Lys Arg Lys Met Glu Asn Ile Val Gly Leu Glu Tyr

            500                 505                 510        

 

 

Glu Leu Asp Ser Leu Lys Glu Glu Lys Glu Arg Leu Met Lys Glu Lys

        515                 520                 525            

 

 

Ser Glu Arg Ser Ser Asn Leu Arg Glu Met Lys Gln Gln Leu Ser Thr

    530                 535                 540                

 

 

Leu Tyr Gln Glu Val Phe Ser Met Leu Arg Asp Glu Asp Gly Lys Pro

545                 550                 555                 560

 

 

Phe Ser Pro Ser Glu Tyr Ser Leu Gln His Thr Ala Asp Asp Thr Leu

                565                 570                 575    

 

 

Phe Leu Val Pro Arg Leu Lys Arg Phe Ser

            580                 585    

 

 

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

atgatggaga ttgaattgcc taa                                             23

 

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ccaagctagt tgttctttac gag                                             23

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

gacgcacacc aacacgacaa at                                              22

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

tataagggca accaaatgga at                                              22

 

 

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

cagatgaaag cgaagaaccc a                                               21

 

 

<210>  8

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

taaggcgagg aacgagaaaa a                                               21

 

 

<210>  9

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

ttcccgctgg tttaccttac                                                 20

 

 

<210>  10

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

cgtttcttct gcttgtcttt                                                 20

 

 

Claims (9)

1.一种重组鲤鱼NRF2基因，为下述序列之一：1)序列表中SEQ ID No：1所示的基因序列；2) 将SEQ ID NO :1所示的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQ ID No：1所示的基因序列表达的氨基酸序列相同的基因序列。

2.一种重组鲤鱼NRF2氨基酸序列，为下述序列之一：1) SEQ ID NO :2所示的由权利要求1所述重组鲤鱼NRF2基因所表达的氨基酸序列；2)将SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与具有与SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白质。

3.一种权利要求1所述重组鲤鱼NRF2基因的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

1）采集鲤鱼的总RNA并以其肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链；

2）以步骤1）中的cDNA第一链为模板，利用引物N1、N2进℃R扩增，得到SEQ ID NO :1所示的序列，所述引物N1具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物N2具有SEQ ID NO :4所示的序列；

所述步骤2）中以Nl、N2为引物，利用DNA聚合酶进℃R反应的50μl℃R扩增体系中各组分及其比例为：cDNA第一链，2.5 μl；50μM 的N1，0.25μl；50μM的N2，0.25μl；10×LA℃R Buffer II，5.0μl；each 2.5 mM 的dNTP Mixture，8.0μl；ddH₂O，33.5μl；5 U/μl的DNA聚合酶，0.5μl；反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30 sec，72℃延伸2 min，共40个循环；最后72℃延伸 10 min，反应完成。

4.一种权利要求3所制备的重组鲤鱼NRF2基因的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：

1）将N1和N2℃R回收产物℃R扩增采用2×Taq℃R MasterMix进行，50μl℃R扩增体系中各组分及其比例为：50倍稀释的NRF2回收产物，1.0μl；50μM的N3，0.25μl；50μM 的N4，0.25μl；2×Taq℃R MasterMix，25.0μl；ddH₂O，23.5μl；反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5 min，反应完成；所述N3具有SEQ ID NO :5所示的序列，引物N4具有SEQ ID NO :6所示的序列；

2）取5μl℃R产物用1.0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。

5.根据权利要求4所述重组鲤鱼NRF2基因的检测方法，其特征在于，所述50倍稀释的NRF2回收产物指重组鲤鱼NRF2基因cDNA编码区核苷酸序列的制备方法中所制备的重组鲤鱼NRF2基因cDNA序列。

6.一种权利要求3所制备的重组鲤鱼NRF2基因的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：

1）将N1和N2℃R回收产物℃R扩增采用2×Taq℃R Master Mix进行，50μl℃R扩增体系中各组分及其比例为：50倍稀释的NRF2回收产物，1.0μl；50μM的N5，0.25μl；50μM 的N6，0.25μl；2×Taq℃R Master Mix，25.0μl；ddH₂O，23.5μl；反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min，反应完成；所述N5具有SEQ ID NO :7所示的序列，引物N6具有SEQ ID NO :8所示的序列；

2）取5μl℃R产物用1.0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。

7.权利要求1所述重组鲤鱼NRF2基因在检测鲤鱼NRF2基因的表达情况中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，鲤鱼NRF2基因的表达情况包括鲤鱼NRF2基因在各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的表达情况。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，在检测中，根据SEQ ID NO :1所示序列设计上游引物ND1、下游引物ND2；采用荧光定℃R扩增，20μl℃R扩增体系中各组分及其比例为：cDNA，2.0μl；10μM 的ND1，1.0μl；10μM的 ND2，1.0μl；                                                

II（2×），10.0μl；dH₂O，6.0μl；反应循环条件：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60 ℃退火15sec，72℃延伸15sec，共44个循环；最后72℃延伸2min，反应完成。

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