CN114457085B

CN114457085B - 拟穴青蟹cap′n′collar基因及其在制备病理检测诊断试剂中的应用

Info

Publication number: CN114457085B
Application number: CN202111583605.4A
Authority: CN
Inventors: 程长洪; 郭志勋; 马红玲; 刘广鑫; 邓益琴; 冯娟
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114457085A

Abstract

本发明公开了一种拟穴青蟹cap'n'collar基因，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。还公开了拟穴青蟹cap'n'collar基因编码的蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。以及上述拟穴青蟹cap'n'collar基因或蛋白在制备拟穴青蟹病理检测诊断试剂中的应用。还进一步公开了检测上述拟穴青蟹cap'n'collar基因的引物，以及所述引物在制备检测拟穴青蟹cap'n'collar基因的表达量试剂中的应用。

Description

拟穴青蟹cap′n′collar基因及其在制备病理检测诊断试剂中的应用

技术领域

本发明属于拟穴青蟹技术领域，具体涉及拟穴青蟹cap′n′collar基因及其在制备病理检测诊断试剂中的应用。

背景技术

拟穴青蟹俗称青蟹，具有生长迅速、营养价值高等特点，是我国东南沿海重要的养殖蟹类之一。依据2020年中国渔业统计年鉴统计，养殖青蟹超过2.6万公顷，产量超过16.8万吨，为增加农渔民收入、促进沿海农村经济发展做出了重要的贡献。但近年来随着养殖规模的不断扩大，青蟹病害问题爆发严重，很多青蟹养殖池塘发病率超过60％，青蟹亩产只有几十公斤，因此，青蟹病害问题严重限制了青蟹养殖业健康发展。而目前关于青蟹病害的监测技术相对缺乏，急需发展青蟹养殖病害监测技术，为防止青蟹病害爆发提供有效手段。

Nrf2是一种含亮氨酸拉链结构的转录因子，属于cap′n′collar转录因子家族的成员，在氧化应激反应中起关键作用。哺乳动物叫nrf2，而在无脊椎动物中Nrf2被命名为cap′n′collar。可通过调控解毒酶的活性，能够降低机体损伤。Nrf2通过调节抗氧化系统，发挥着抗氧化功能。除此之外，Nrf2还参与机体免疫应答，在人类各种疾病预防起着关键作用。当水生动物遇到各种环境胁迫或细菌感染时，Nrf2通常用来反应机体健康状态，在疾病监测中具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟穴青蟹cap′n′collar基因及其编码的蛋白。

本发明的目的还在于提供含有上述拟穴青蟹cap′n′collar基因或其编码的蛋白在制备拟穴青蟹病理检测诊断试剂中的应用。

本发明的最后一个目的在于提供检测上述拟穴青蟹cap′n′collar基因的引物以及所述引物在制备检测拟穴青蟹cap′n′collar基因的表达量试剂中的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种拟穴青蟹cap′n′collar基因，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述拟穴青蟹cap′n′collar基因编码的蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述拟穴青蟹cap′n′collar基因或上述蛋白在制备拟穴青蟹病理检测诊断试剂中的应用。

优选的，所述拟穴青蟹病理检测包括拟穴青蟹感染病原菌副溶血弧菌检测。

本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种检测上述拟穴青蟹cap′n′collar基因的引物，所述引物包括Spcap′n′collar-F和Spcap′n′collar-R，其中所述Spcap′n′collar-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Spcap′n′collar-R的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还进一步提供上述引物在制备检测拟穴青蟹cap′n′collar基因的表达量试剂中的应用。

本发明具有以下有益效果：本发明中的Spcap′n′collar基因在感染病原菌比如副溶血弧菌表达量上调，说明青蟹处于不健康状态，可能是感染了某些病原菌比如副溶血弧菌，因此可以对于拟穴青蟹病害预防提供预警作用，可防止青蟹病害大规模爆发，并可进一步促进青蟹养殖业健康发展。

附图说明

图1是实施例1中Spcap′n′collar蛋白功能结构域；

图2是实施例1中Spcap′n′collar在不同组织中表达情况，不同字母表示不同组织间差异显著；

图3是实施例1中在副溶血弧菌刺激下Spcap′n′collar基因表达变化情况，星号(*)表示对照组和副溶血弧菌显著性差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

1、材料方法

1.1 RNA提取和cDNA合成

利用天根生物公司的RNA提取试剂盒，从拟穴青蟹肝胰腺中提取总RNA。分别利用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳判断总RNA纯度和质量。将检测合格的总RNA使用Takara公司的逆转录试剂盒逆转录为总cDNA。

1.2 cap′n′collar基因全长合成

利用本实验室构建的拟穴青蟹转录组文库，从文库中调取cap′n′collar基因中间片段，以此序列为模板，利用SMARTTM RACE cDNA Amplification kit(Takara，中国大连)试剂盒，分别合成cap′n′collar基因5’和3’端，具体操作参照该说明书。通过测序和拼接，得到该基因全长序列，利用生物信息学软件对该基因进行比对和分析该基因核苷以及氨基酸序列。

1.3 cap′n′collar基因荧光定量

选取拟穴青蟹18s rRNA作为内参基因，根据其核苷酸序列设计荧光定量引物，其引物序列为：Sp18s-F:5’-TTTTCTGAACCCGAGGTAATGAC-3’和Sp18s-R:5’-ATGCTTTCGCAGTAGTTCGTCTT-3’。

根据cap′n′collar基因核苷酸序列设计一对荧光定量引物，其引物序列为：Spcap′n′collar-F:agtgtcagggtcttctgtggagc-3’(如SEQ ID NO.3所示)和Spcap′n′collar-R:5’-cataggcaggttgatgatgtcgt-3’(如SEQ ID NO.4所示)。利用总RNA的反转录产物作为cDNA模板。

荧光定量试剂盒为Takara TB

Premix Ex Taq^TM，反应体系如下表1所示：/>

表1反应体系

利用德国耶拿荧光定量PCR仪进行基因扩增，其反应程序如下：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃20s，40个循环；进行溶解曲线分析。利用2^－ΔΔCT方法对荧光定量结果进行相对定量分析，实验组和对照组共设置6个平行反应。

1.4组织表达分析

分别取6只健康的拟穴青蟹各个组织，进行RNA提取和反转录为cDNA(见步骤1.1)，采用荧光定量分析方法，检测Spcap′n′collar基因在拟穴青蟹肝胰腺、鳃、肠、血细胞、心脏、肌肉和胃组织分布情况。

取健康的拟穴青蟹，分别注射1×10⁶个病原菌副溶血弧菌，对照组注射等量的PBS，在6、12、24、48和72h后取样。提取各个时间点肝胰腺组织总RNA提取并反转录为cDNA(见步骤1.1)，依此为模版，进行荧光定量PCR，分析Spcap′n′collar基因变化情况。

2、实验结果

2.1拟穴青蟹Spcap′n′collar基因生物信息学分析

Spcap′n′collar基因全长为2,578bp，包含85bp的5’非编码区和1755bp的3’非编码区，开放阅读框长度为738bp编码245个氨基酸。Spcap′n′collar氨酸酸等电点为9.45，蛋白子量为28.5kDa。

Spcap′n′collar开放阅读框cDNA序列和氨基酸序列

通过氨基酸序列比对分析发现Spcap′n′collar蛋白属于cap′n′collar蛋白家族，具有Nrf2功能结构域亮氨酸拉链结构(BRLZ)(图1)，表明Spcap′n′collar蛋白具有Nrf2功能。

2.2拟穴青蟹Spcap′n′collar组织表达分析

拟穴青蟹Spcap′n′collar在所有组织中均有表达，其中在鳃组织中中表达最高，在胃组织中表达量最低(图2)，说明Spcap′n′collar基因分布广泛，在青蟹所有组织中均能表达，取不同组织都可以监测Spcap′n′collar基因变化量。

2.3病原菌副溶血弧菌刺激对拟穴青蟹Spcap′n′collar基因表达的影响

在病原菌副溶血弧菌刺激后，拟穴青蟹Sp-cap′n′collar基因表达量在6-48h显著上调(图3)，说明病原菌感染后，Sp-cap′n′collar基因表达量会上调。Sp-cap′n′collar基因变化情况，可以反映拟穴青蟹健康状态，对青蟹病害爆发起预警作用。

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 拟穴青蟹cap'n'collar基因及其在制备病理检测诊断试剂中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 738

<212> DNA

<213> 转录因子(cap'n'collar)

<400> 1

atggccagga tgggcggcag tgatgacagc ccacctgccg ttggacagat acaggtgcgg 60

gaatctttca gttttttcaa cacatttgct aaattagtcc cagaagtgtc agggtcttct 120

gtggagcatg tgcagcacaa ccatacttac catatgtccc cagagggacc gtcagggctg 180

tcacgaccaa cctccaggga caaacagaaa aaccgaaaga acgatagtga acggacactg 240

tccagagatg agaagcgagc ccgggccatg aaccttccca tctcctgtga cgacatcatc 300

aacctgccta tggatgagtt caatgagcgc atctccaagt atgacttaac agaggcacag 360

ctttcactaa tcagagacat tcggcgccgt ggcaaaaaca aggttgcagc ccagaactgc 420

cggaagcgta agctggacca aattacacac ctggctgatg aggtgagggc cattcagagt 480

cgcaagaatg acctctacaa ggagtatgaa tacctaaacc ttgaacggaa ccgtatcaag 540

aacaagtttt ctttattgta tcggcacata ttccagagtc tccgggatcc tgatggaaat 600

ccatactcac cacatgaata ctcactgcag cagtcagcag atggcagtat cctccttgtg 660

ccacgttcct caccaggtca ctcagtggac cccaattctg gtaataaacc aagaggcaag 720

gatgatgcca agcagtga 738

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> 转录因子(cap'n'collar)

<400> 2

Met Ala Arg Met Gly Gly Ser Asp Asp Ser Pro Pro Ala Val Gly Gln

1 5 10 15

Ile Gln Val Arg Glu Ser Phe Ser Phe Phe Asn Thr Phe Ala Lys Leu

20 25 30

Val Pro Glu Val Ser Gly Ser Ser Val Glu His Val Gln His Asn His

35 40 45

Thr Tyr His Met Ser Pro Glu Gly Pro Ser Gly Leu Ser Arg Pro Thr

50 55 60

Ser Arg Asp Lys Gln Lys Asn Arg Lys Asn Asp Ser Glu Arg Thr Leu

65 70 75 80

Ser Arg Asp Glu Lys Arg Ala Arg Ala Met Asn Leu Pro Ile Ser Cys

85 90 95

Asp Asp Ile Ile Asn Leu Pro Met Asp Glu Phe Asn Glu Arg Ile Ser

100 105 110

Lys Tyr Asp Leu Thr Glu Ala Gln Leu Ser Leu Ile Arg Asp Ile Arg

115 120 125

Arg Arg Gly Lys Asn Lys Val Ala Ala Gln Asn Cys Arg Lys Arg Lys

130 135 140

Leu Asp Gln Ile Thr His Leu Ala Asp Glu Val Arg Ala Ile Gln Ser

145 150 155 160

Arg Lys Asn Asp Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Tyr Leu Asn Leu Glu Arg

165 170 175

Asn Arg Ile Lys Asn Lys Phe Ser Leu Leu Tyr Arg His Ile Phe Gln

180 185 190

Ser Leu Arg Asp Pro Asp Gly Asn Pro Tyr Ser Pro His Glu Tyr Ser

195 200 205

Leu Gln Gln Ser Ala Asp Gly Ser Ile Leu Leu Val Pro Arg Ser Ser

210 215 220

Pro Gly His Ser Val Asp Pro Asn Ser Gly Asn Lys Pro Arg Gly Lys

225 230 235 240

Asp Asp Ala Lys Gln

245

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtgtcaggg tcttctgtgg agc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cataggcagg ttgatgatgt cgt 23

Claims

1.一种拟穴青蟹cap'n'collar基因，其特征是：它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述拟穴青蟹cap'n'collar基因编码的蛋白，其特征是：它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.检测权利要求1所述拟穴青蟹cap'n'collar基因的引物在制备检测拟穴青蟹感染病原菌副溶血弧菌的诊断试剂中的应用。

4.一种检测权利要求1所述拟穴青蟹cap'n'collar基因的引物，其特征是：所述引物包括Spcap'n'collar-F和Spcap'n'collar-R，其中所述Spcap'n'collar-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Spcap'n'collar-R的序列如SEQ ID NO.4所示。

5.权利要求4所述的引物在制备检测拟穴青蟹cap'n'collar基因的表达量试剂中的应用。