CN113234132A

CN113234132A - 一种拟穴青蟹c型凝集素及其制备方法和应用

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Publication number: CN113234132A
Application number: CN202110388937.0A
Authority: CN
Inventors: 夏艳婷; 黄萌萌; 董太伟; 曾博新; 郑小媛
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2041-04-12
Also published as: CN113234132B

Abstract

本发明公开了一种拟穴青蟹C型凝集素Spctl‑2，所述拟穴青蟹C型凝集素Spctl‑2的氨基酸序列为SEQ ID No:1；本发明还公开了一种编码拟穴青蟹C型凝集素Spctl‑2的基因，所述抑菌蛋白Spctl‑2基因的核苷酸序列为SEQ ID No:2；本发明还公开一种基于所述拟穴青蟹C型凝集素Spctl‑2的重组抑菌蛋白rSpctl‑2；本发明还公开了所述重组抑菌蛋白rSpctl‑2在制备防控河弧菌侵染中的应用；本发明还公开了所述重组抑菌蛋白rSpctl‑2在制备防控藤黄微球菌中的应用；本发明还公开了该重组抑菌蛋白rSpctl‑2的制备方法。本发明利用大肠杆菌生产重组蛋白，具有分泌型表达的优势，易于工业化生产以及为设计免疫增强剂的剂型提供更多选择。

Description

一种拟穴青蟹C型凝集素及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及水产品病害生物防治领域，尤其涉及一种拟穴青蟹C型凝集素及其制备方法和应用。

背景技术

细菌感染引起的相关病害，导致养殖过程中拟穴青蟹存活率低，从而给相关养殖产业造成巨大的损失。目前对拟穴青蟹病害的防治主要采用抗生素和人工合成抗菌药来防治由于规模化、集约化养殖所引起的病害。细菌性疾病是青蟹养殖中普遍发生的一种水产疾病，主要由河弧菌和藤黄微球菌等引起，使拟穴青蟹存活率低。防治该病的药剂以抗生素为主，但长期使用也造成抗药性增强，药效减弱的问题。因此，寻找通过提高拟穴青蟹自身的免疫力来抵抗日益严重的病害具有重大意义。

Spctl-2蛋白存在于拟穴青蟹体内，可以给拟穴青蟹提供对细菌的广谱抗性，主要通过特征性糖识别域，该结合位点带有一个Ca²⁺以与糖接触，参与无脊椎动物的发育及其先天免疫反应的调控、吞噬作用，微生物凝集等。迄今为止，已从拟穴青蟹中，分离纯化出了多种C型凝集素，如Spctl-1、Spctl-2等。目前，还尚未见采用拟穴青蟹C型凝集素作为动物源免疫增强剂在防控拟穴青蟹养殖病害上的报导。

发明内容

为了解决上述相关领域的不足，本发明提供一种拟穴青蟹C型凝集素及其制备方法和应用。

本发明提供一种拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2，所述蛋白Spctl-2的氨基酸序列为SEQ ID No：1。

本发明还提供编码上述拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No：2。

本发明还提供一种含有上述拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2基因的表达载体。

本发明还提供一种重组抑菌蛋白r Spctl-2在制备关于细菌的感染防治免疫增强剂中的应用，所述重组蛋白r Spctl-2抑制河弧菌和藤黄微球菌。

一种重组抑菌蛋白r Spctl-2的制备方法.包括以下步骤:

步骤1，对所示的核昔酸序列两瑞添加Ncol/Xhol酶切位点和His标签序列后，进行全基因合成，得到基因片段:

步骤2，用Ncol/Xhol双酶切载体pET32a和步骤1所得的基因片段，回收纯化，将双酶切后的基因片段与载体pET32a连接，得连接产物并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，挑取阳性克隆进行培养，得含有r Spctl-2基因的重组质粒，即重组表达载体；

步骤3，将步骤2所述的含有重组质粒的大肠杆菌菌株，于0.01mM的IPTG，30℃，4h的诱导条件下，制备得到上清表达的重组蛋白r Spctl-2.

步骤4，将步骤3的上清纯化后，得到重组蛋白r Spctl-2。

本发明与现有技术相比而言，具有以下有益效果:

1)本发明提供一种制备拟穴青蟹C型凝集素重组蛋白r Spctl-2的方法以及利用该方法制备的蛋白的抑菌活性，填补了动物源抗菌蛋白在防治这拟穴青蟹病害中的空白。

2)本发明合成了拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2适合大肠杆菌表达的核苷酸序列；并且为了保证外源基因的可溶性表达，切除了Spctl-2蛋白的信号肽区域，得到了适合外源表达的氨基酸序列；建立了Spctl-2蛋白的大肠杆菌表达载体，能快速稳定的获得r Spctl-2蛋白。

3)本发明提供的r Spctl-2对河弧菌和藤黄微球菌具有明显的抑菌效果。

4)本发明提供的拟穴青蟹C型凝集素重组蛋白rSpctl-2可作为大规模生产的动物源抑菌剂，能减少抗生素的危害，对病害的生物防治和水产品安全具有积极意义。

5)本发明在全基因合成过程中加入了HIS标签蛋白，具有分子量小，带点少，免疫原性差的特点，并能特异性的结合镍离子，为后续的蛋白纯化提供条件。利用大肠杆菌生产重组蛋白，具有分泌型表达的优势，易于工业化生产以及为设计免疫增强剂的剂型提供更多选择。

6)本发明构建了原核表达载体pET32a-Spctl-2，转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功诱导表达了分子量约为33KD的蛋白，该蛋白主要在胞外表达。经镍琼脂糖亲和层析法纯化的蛋白经SDS-PAGE鉴定，纯化的重组蛋白r Spctl-2纯度高。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1是本发明纯化后的Spctl-2蛋白；

图2是本发明实施例2的r Spctl-2蛋白对河弧菌的抑制作用:

图3是本发明实施例2的r Spctl-2蛋白对藤黄微球菌的抑制作用。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。本发明中未详细说明的结构或工作原理属于现有技术和本领域的公知常识，本技术领域的技术人员应当知晓。

实施例1

1)合成如下所示的基因(SEQ ID NO.2)：

ACGGACGTCAACTCATCAAATACCGAGTGCCACAGCCCTTTCACGGAGGTTGCAGGTCGCTGCTTGCACATTGAAGTCGCCACCACTGGCTCGTGGCACAATATGCGAAAGCTCTGTCAGGACCTTGGGGGTGACCTGGTCAATCTTTCTGATCTGCAATTCTACGGTGACCTCATTTTGTACATTAAAAGTTTACATTTGCCATACGTTCATTTGTGGATCGGTGCCACGGACGAGGCGACGGAGGGCATCTGGATGTGGACAGATGGGACACCCGTCAGGATGGGCACTCCTTACTGGGCCAACTATAAGGACAACGTTCAAATGCCTGCTGGAGGAGAGAATCAAAACTGTGCTATGCTTGATATAAACATGCATTATTATTTCAATGATTATGGCTGTTCGTCACCAGATATAAGTCCGATTTGTGAG

2)在上述SEQ ID No:2所示的基因的两端添加酶切位点Ncol/Xhol以及His标签后，对其进行全基因合成，得到基因片段:本实施例的全基因合成是委托生工生物工程(上海)股份有限公司(以下简称为生工)完成的；

用Ncol/Xhol双酶切载体pET32a和上述步骤所得的基因片段.回收纯化，将双酶切后的基因片段与载体pET32a连接，得连接产物并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，挑取其阳性克隆进行培养，得含有Spctl-2基因的重组质粒，即为构建的重组表达载体。

其中，上述pET32a载体通用引物为:

T7：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；

T7t:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。

实施例2

本实施例提供一种重组蛋白rSpctl-2的制备方法:

将实施例1所述的重组表达载体经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，挑选含有重组质粒的大肠杆菌菌株，挑选经抗生素筛选后的含有重组质粒的大肠杆菌单菌落，将其放入LB液体培养基中，并于37℃，220rpm摇培12h；吸取菌液于LB培养基中，于37℃，220rpm培养3.5h，加入0.01mM的IPTG进行诱导，诱导条件为30℃，4h，220rpm，制备得到上清表达的重组蛋白。

收集诱导后的上清，经SDS-PAGE检测为约33kD的单一条带。

目的蛋白经镍柱亲和层析进行纯化，经SDS-PAGE检测为约33kD的单一条带，结果如图1所示。

其中，上述pET32a载体通用引物为:

5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；

T7t:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。

测序得到的多肽链如下所示(SEQ ID NO.1)

TDVNSSNTECHSPFTEVAGRCLHIEVATTGSWHNMRKLCQDLGGDLVNLSDLQFYGDLILYIKSLHLPYVHLWIGATDEATEGIWMWTDGTPVRMGTPYWANYKDNVQMPAGGENQNCAMLDINMHYYFNDYGCSSPDISPICE

(1)采用本实施例制备的纯化后的重组蛋白进行防控河弧菌感染测试，具体如下:

设置TBS与rTrx为空白对照和阴性对照

具体步骤为:

①将河弧菌培养至对数生长期，离心后TBS-Ca²⁺洗3次后重悬至10⁴CFU。

②将50μL rSpCTL-2与菌液1:1混匀后室温下孵育1h

③孵育后取20μL混合液加入96孔细胞培养板，每孔加入200μL液体培养基。

④置于恒温摇床中培养12-16h至到达平台期，每半小时读一次OD₆₀₀。用Origin8.0软件和Excel分析并绘制微生物生长曲线。

河弧菌的生长曲线如图2所示，通过与阴性对照和空白对照对比得出，rSpCTL-2对河弧菌有一定的生长抑制作用。

(2)采用本实施例制备的纯化后的重组蛋白进行防控藤黄微球菌感染测试，具体如下:

设置TBS与rTrx为空白对照和阴性对照

具体步骤为:

①将藤黄微球菌培养至对数生长期，离心后TBS-Ca²⁺洗3次后重悬至10⁴CFU。

②将50μL rSpCTL-2与菌液1:1混匀后室温下孵育1h

藤黄微球菌的生长曲线如图3所示，通过与阴性对照和空白对照对比得出，rSpCTL-2对藤黄微球菌有一定的生长抑制作用。

综上，本发明提供一种制备拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2的方法以及利用该方法制备的蛋白对河弧菌和藤黄微球菌的抑菌活性，填补了动物源免疫增强剂在防控拟穴青蟹养殖病害中的空白。本发明不仅检索了拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2基因，还为了保证外源基因的可溶性表达，切除了Spctl-2蛋白的信号肽区域，得到了适合外源表达的氨基酸序列:建立了SpCTL-2蛋白的大肠杆菌表达体系，能快速稳定的获得rSpCTL-2蛋白。本发明提供的rSpCTL-2对河弧菌和藤黄微球菌具有明显的抑菌效果。本发明提供的拟穴青蟹C型凝集素重组蛋白rSpctl-2是一种能够大规模生产的动物源抑菌剂，能减少抗生素的危害，对病害的生物防治和水产品安全具有积极意义。

本发明在全基因合成过程中加入了HIS标签蛋白，具有分子量小，带点少，免疫原性差的特点，并能特异性的结合镍离子，为后续蛋白纯化提供条件。利用大肠杆菌生产重组蛋白，具有分泌型表达的优势，易于工业化生产以及为设计免疫增强剂的剂型提供更多选择。本发明构建了原核表达载体pET32a-Spctl-2，转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功诱导表达了分子量约为33KD的蛋白，该蛋白主要在胞外表达。经镍琼脂糖亲和层析法纯化的蛋白经SDS-PAGE鉴定，纯化的重组蛋白r Spctl-2纯度高。

序列表

<110> 浙江理工大学

<120> 一种拟穴青蟹C型凝集素及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 144

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Thr Asp Val Asn Ser Ser Asn Thr Glu Cys His Ser Pro Phe Thr Glu

1 5 10 15

Val Ala Gly Arg Cys Leu His Ile Glu Val Ala Thr Thr Gly Ser Trp

20 25 30

His Asn Met Arg Lys Leu Cys Gln Asp Leu Gly Gly Asp Leu Val Asn

35 40 45

Leu Ser Asp Leu Gln Phe Tyr Gly Asp Leu Ile Leu Tyr Ile Lys Ser

50 55 60

Leu His Leu Pro Tyr Val His Leu Trp Ile Gly Ala Thr Asp Glu Ala

65 70 75 80

Thr Glu Gly Ile Trp Met Trp Thr Asp Gly Thr Pro Val Arg Met Gly

85 90 95

Thr Pro Tyr Trp Ala Asn Tyr Lys Asp Asn Val Gln Met Pro Ala Gly

100 105 110

Gly Glu Asn Gln Asn Cys Ala Met Leu Asp Ile Asn Met His Tyr Tyr

115 120 125

Phe Asn Asp Tyr Gly Cys Ser Ser Pro Asp Ile Ser Pro Ile Cys Glu

130 135 140

<210> 2

<211> 432

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

acggacgtca actcatcaaa taccgagtgc cacagccctt tcacggaggt tgcaggtcgc 60

tgcttgcaca ttgaagtcgc caccactggc tcgtggcaca atatgcgaaa gctctgtcag 120

gaccttgggg gtgacctggt caatctttct gatctgcaat tctacggtga cctcattttg 180

tacattaaaa gtttacattt gccatacgtt catttgtgga tcggtgccac ggacgaggcg 240

acggagggca tctggatgtg gacagatggg acacccgtca ggatgggcac tccttactgg 300

gccaactata aggacaacgt tcaaatgcct gctggaggag agaatcaaaa ctgtgctatg 360

cttgatataa acatgcatta ttatttcaat gattatggct gttcgtcacc agatataagt 420

ccgatttgtg ag 432

Claims

1.一种拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2，其特征在于，所述拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2的氨基酸序列为SEQ ID No:1。

2.编码权利要求1所述的拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No:2。

3.一种含有如权利要求2所述基因的表达载体。

4.一种如权利要求1所述的拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2在制备抑菌制剂中的应用，包括河弧菌抑菌制剂和藤黄微球菌抑菌制剂。

5.一种如权利要求1所述的拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

步骤1，对SEQ ID No:2所示的核苷酸序列两端添加Ncol/Xhol酶切位点和His标签序列后，进行全基因合成，得到基因片段；

步骤2，用Ncol/Xhol双酶切载体pET32a和步骤1所得的基因片段，回收纯化，将双酶切后的基因片段与载体pET32a连接，得连接产物并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，挑取阳性克隆进行培养，得含有Spctl-2基因的重组质粒，即重组表达载体；

步骤3，将所得到的重组表达载体经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，挑选含有重组质粒的大肠杆菌菌株。

步骤4，将步骤3所述的含有重组质粒的大肠杆菌菌株，于0.01mM的IPTG，30℃，4h的诱导条件下，制备得到上清表达的重组蛋白rSpctl-2；

步骤5，将步骤4的上清纯化后，得到重组蛋白rSpctl-2。