CN112812166B - 一种鱼类神经肽LPXRFa及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鱼类神经肽LPXRFa，属于基因工程领域。所述神经肽LPXRFa包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明还公开了该神经肽LPXRFa的编码基因及以该神经肽LPXRFa为前体的成熟多肽，以及它们的应用。利用本发明，可以对包括黄条鰤在内的鱼类进行人工催产，为推动渔业发展具有重要意义。

Description

一种鱼类神经肽LPXRFa及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地，涉及一种鱼类神经肽LPXRFa及其编码基因和应用。
背景技术
脊椎动物的生殖活动主要受到脑-垂体-性腺轴的调控。通常认为下丘脑分泌的神经肽作用于垂体，影响垂体分泌产生GTH(包括LH和FSH)进而影响生殖调控。因为GTH在脊椎动物的生殖调控中起了主导作用，所以对于GTH分泌的调节一直以来都是生殖生理学家们研究和探索的重点。
LPXRFa是一种新型下丘脑神经肽，目前仅在金鱼等几种鱼类中鉴定出了lpxrfa基因，但是LPXRFa多肽的功能作用研究极少，且存在较大争议。
黄条鰤(Seriola lalandi)是一种全球性分布的海洋中上层暖温性远洋洄游鱼类，具有生长速度快、肉质鲜嫩、适合网箱养殖和循环水养殖等优点，黄条鰤逐渐成为世界范围内水产养殖的一个新品种。目前，尚没有关于黄条鰤LPXRFa肽的研究和应用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种鱼类神经肽LPXRFa，包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述神经肽LPXRFa由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成。
本发明第二方面提供一种本发明第一方面所述神经肽LPXRFa的编码基因lpxrfa，包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述编码基因lpxrfa由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列组成。
本发明第三方面提供一种多肽，其是以本发明第一方面所述的神经肽LPXRFa为前体的成熟多肽。
在本发明的一些实施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5所示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5所示的氨基酸序列组成。
本发明第四方面提供本发明第一方面所述的神经肽LPXRFa或本发明第二方面所述的编码基因lpxrfa或本发明第三方面所述的多肽在制备用于调控鱼类生殖的制剂中的应用。
在本发明的一些实施方案中，所述调控鱼类生殖是指对鱼类进行催产。
在本发明的一些具体实施方案中，通过向鱼类腹腔注射所述多肽对鱼类进行催产。
在本发明中，所述鱼类包括但不限于黄条鰤。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种鱼类神经肽LPXRFa，其可以对包括黄条鰤在内的鱼类进行催产，为推动黄条鰤等鱼类产业养殖规模和技术创新具有重要意义。
利用本发明的以神经肽LPXRFa为前体的成熟多肽对黄条鰤进行催产，可以显著上调垂体中GH和GTH亚基(包括LH和FSH)表达水平，从而促进鱼类催产。
附图说明
图1示出了黄条鰤LPXRFa基因在黄条鰤各个组织的表达分析，A：lpxrfa基因mRNA水平，B：lpxrfa-r基因mRNA水平。
图2示出了LPXRFa成熟肽腹腔注射黄条鰤幼鱼后垂体gh、lhβ和fshβ表达的影响。A：gh基因mRNA水平，B：lhβ基因mRNA水平；C：fshβ基因mRNA水平。误差棒上不同字母表示差异显著。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1黄条鰤lpxrfa基因序列鉴定及雌雄组织表达分析
以黄条鰤脑cDNA为模板，根据其他物种lpxrfa序列设计兼并引物进行PCR扩增，从而获得黄条鰤lpxrfa cDNA序列。具体步骤如下：
1.黄条鰤lpxrfa基因克隆：
首先利用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂提取脑组织总RNA；其次，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书合成第一链cDNA；第三，按照TaKaRa Ex Taq所要求的反应条件进行黄条鰤lpxrfa cDNA片段PCR扩增。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃50s，36个循环；72℃10min。将PCR产物用1.5％的胶进行凝胶电泳检测，将符合目的基因大小的条带按照Gel DNA Recovery KitTM(ZYMO)胶回收试剂盒说明书进行胶回收，测序得到534bp的片段，经blast比对证实为黄条鰤lpxrfa cDNA序列。
序列如下(SEQ ID NO.1)：
Figure BDA0002877912270000031
Figure BDA0002877912270000041
其编码的多肽，即LPXRFa多肽的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.2)：
Figure BDA0002877912270000042
2.黄条鰤lpxrfa基因表达分析
为了阐明lpxrfa基因是否参与了黄条鰤生殖调控，发明人分别取雌雄黄条鰤脑(brain)、垂体(pituitary)和性腺组织(gonad)，进行RNA提取及反转录得到cDNA，通过荧光定量PCR进行组织表达分析。
qPCR反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃20s，40个循环。通过比较Ct法进行数据分析。
结果如图1所示，雄性黄条鰤lpxrfa基因和其受体lpxrfa-r基因在脑、垂体和性腺组织中表达水平均不同，在性腺组织中表达水平最高，其次为脑，垂体中表达水平最低。而雌性黄条鰤lpxrfa基因脑和性腺组织中表达水平相差不大，但在垂体中表达水平最低；lpxrfa-r基因在脑中表达与雄性相同，但在垂体和性腺组织中表达水平均比较低。
实施例2黄条鰤LPXRFa成熟多肽的生物学功能研究
发明人通过ProP 1.0Server预测黄条鰤三种LPXRFa成熟肽，LPXRFa-1、LPXRFa-2、和LPXRFa-3，氨基酸序列分别如下：
LPXRFa-1(SEQ ID NO.3)
SLDLESFNMHVTPTTSKISLPSIIKLYPPTAKPVHMHANMPMRF-NH2
LPXRFa-2(SEQ ID NO.4)
ESDPGDDRAPNSNPNMPQRF-NH2
LPXRFa-3(SEQ ID NO.5)
SWEVIRMCAECPDIREAPNPALPERL-NH2
上述成熟多肽序列由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度为95.0％。通过腹腔注射实验，发明人研究了LPXRFa成熟多肽LPXRFa-1、LPXRFa-2、和LPXRFa-3对黄条鰤垂体gh、lhβ和fshβ表达调控的影响。
将黄条鰤幼鱼驯养于循环海水养殖池中，水温介于23-24℃之间，12h光照，溶氧大于7.5mg/L，每天两次进行饱食投喂，驯养5天后用于实验。实验用黄条鰤5月龄，体重为116.22±2.87g。
黄条鰤经MS222麻醉后，称量体重，按照100ng/g体重和1000ng/g体重的剂量分别注射LPXRFa-1、LPXRFa-2和LPXRFa-3多肽，对照组注射PBS，每种处理组8条鱼。
注射6h后，将黄条鰤麻醉后断头处死，取垂体组织置于液氮中。随后进行RNA提取，反转录和荧光定量PCR。
结果如图2所示，结果表明，按1000ng/g体重的剂量注射三种LPXRFa多肽6h后均促进了黄条鰤垂体gh基因mRNA的表达。按两种剂量注射三种LPXRFa多肽后均增加了lhβ基因mRNA的表达水平。然而，只有LPXRFa-3显著性增加了fshβ基因mRNA的表达水平。
上述结果表明，LPXRFa可以作为一种鱼类生长促进剂和性成熟催产剂，广泛应用于黄条鰤养殖行业。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 一种鱼类神经肽LPXRFa及其编码基因和应用
<130> JIA-2020-1-W-040
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccacagcat ctgacctcca ggtctatggg aaattaatcc acagtgataa gacattgctg 60
agcagcgaag acggaagaca cactgtgagg aaacagccgc accaacaaac aaatagtgaa 120
atccgcagga gtttggatct cgagagcttc aacatgcatg tgaccccgac caccagcaag 180
atcagcctcc cgtccatcat caagctctac ccgcccacag ccaaacctgt ccacatgcac 240
gccaacatgc ccatgcgctt tggaagagag agcgatcctg gtgatgacag ggcaccaaac 300
tcaaacccca acatgcccca gaggttcgga cggtcctggg aggtgattcg aatgtgtgcc 360
gagtgtcctg atatcagaga agcaccaaac ccagcgctgc ctgagcgatt agggagaaat 420
agtcctttct ggatcctcct gagaactctg gccagtgaac agttatttaa cactggcttg 480
cgctgggctg aggatttcga ctttacaacc agctcagaag aggtggagat ggaa 534
<210> 2
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Thr Ala Ser Asp Leu Gln Val Tyr Gly Lys Leu Ile His Ser Asp
1 5 10 15
Lys Thr Leu Leu Ser Ser Glu Asp Gly Arg His Thr Val Arg Lys Gln
20 25 30
Pro His Gln Gln Thr Asn Ser Glu Ile Arg Arg Ser Leu Asp Leu Glu
35 40 45
Ser Phe Asn Met His Val Thr Pro Thr Thr Ser Lys Ile Ser Leu Pro
50 55 60
Ser Ile Ile Lys Leu Tyr Pro Pro Thr Ala Lys Pro Val His Met His
65 70 75 80
Ala Asn Met Pro Met Arg Phe Gly Arg Glu Ser Asp Pro Gly Asp Asp
85 90 95
Arg Ala Pro Asn Ser Asn Pro Asn Met Pro Gln Arg Phe Gly Arg Ser
100 105 110
Trp Glu Val Ile Arg Met Cys Ala Glu Cys Pro Asp Ile Arg Glu Ala
115 120 125
Pro Asn Pro Ala Leu Pro Glu Arg Leu Gly Arg Asn Ser Pro Phe Trp
130 135 140
Ile Leu Leu Arg Thr Leu Ala Ser Glu Gln Leu Phe Asn Thr Gly Leu
145 150 155 160
Arg Trp Ala Glu Asp Phe Asp Phe Thr Thr Ser Ser Glu Glu Val Glu
165 170 175
Met Glu
<210> 3
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Leu Asp Leu Glu Ser Phe Asn Met His Val Thr Pro Thr Thr Ser
1 5 10 15
Lys Ile Ser Leu Pro Ser Ile Ile Lys Leu Tyr Pro Pro Thr Ala Lys
20 25 30
Pro Val His Met His Ala Asn Met Pro Met Arg Phe
35 40
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ser Asp Pro Gly Asp Asp Arg Ala Pro Asn Ser Asn Pro Asn Met
1 5 10 15
Pro Gln Arg Phe
20
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Trp Glu Val Ile Arg Met Cys Ala Glu Cys Pro Asp Ile Arg Glu
1 5 10 15
Ala Pro Asn Pro Ala Leu Pro Glu Arg Leu
20 25

Claims (3)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽为以SEQ ID NO. 2所示的神经肽LPXRFa为前体的成熟多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3~SEQ ID NO. 5任一一项所示。
2.权利要求1所述的多肽在制备用于调控黄条鰤生殖的制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调控黄条鰤生殖是指对黄条鰤进行人工催产。
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Application publication date: 20210518

Assignee: Guangzhou Shunde Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: YELLOW SEA FISHERIES Research Institute CHINESE ACADEMY OF FISHERY SCIENCES

Contract record no.: X2022980018306

Denomination of invention: A fish neuropeptide LPXRFa and its coding gene and application

Granted publication date: 20220729

License type: Common License

Record date: 20221020