CN115925862A - 一种鱼类神经肽nkb和nkbrp及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鱼类神经肽NKB和NKBRP及其编码基因和应用，该鱼类神经肽NKB和NKBRP，分别包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，编码鱼类神经肽NKB和NKBRP的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，多肽以SEQ ID NO.3的基因编码的前体的成熟多肽，多肽在制备用于调控鱼类生殖的制剂中得以应用，本发明以神经肽NKB和NKBRP对半滑舌鳎进行催产，可以显著上调垂体中lhβ和fshβ的表达水平，从而促进包括半滑舌鳎在内的鱼类进行催产，为推动半滑舌鳎等鱼类产业养殖规模和技术创新具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鱼类神经肽NKB和NKBRP及其编码基因和应用。
背景技术
脊椎动物生殖活动主要受到脑-垂体-性腺轴的调控。通常认为下丘脑分泌的神经肽作用于垂体，影响垂体分泌产生LH和FSH，进而影响生殖调控。NKB和NKBRP是一种新型下丘脑神经肽，目前仅在斑马鱼等几种鱼类中鉴定出了其编码基因tac3序列，但是NKB和NKBRP多肽的功能作用研究极少，需要进一步深入研究。
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是一种重要的海水养殖经济鱼类，属鲽形目(Pleuronectiformes)、舌鳎科(Cynoglossidae)、舌鳎属(Cynoglossus)，其生长速度快，经济价值高，洄游距离短，是理想的增殖放流和人工养殖种类，近年来在全国沿海形成了较大规模的养殖产业。半滑舌鳎雌雄个体差异较大，雌性个体的平均体长约523mm，雄性个体的平均体长为280mm；雄性性早熟是导致半滑舌鳎雌雄生长差异的主要原因。NKB和NKBRP作为一种新型下丘脑神经肽，研究二者对半滑舌鳎垂体LH和FSH表达的调控作用，这可为研制半滑舌鳎等鱼类新型生殖调控制剂提供理论依据。目前，尚没有关于半滑舌鳎NKB和NKBRP多肽的研究和应用。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，目的是提供一种鱼类神经肽NKB和NKBRP及其编码基因和应用。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
第一方面，本发明提供了一种鱼类神经肽NKB和NKBRP，分别包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供了一种编码鱼类神经肽NKB和NKBRP的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第三方面，本发明提供了一种多肽，该多肽以SEQ ID NO.3的基因编码的前体的成熟多肽。
进一步地，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
第四方面，本发明提供了一种如上述的多肽在制备用于调控鱼类生殖的制剂中的应用。
进一步地，调控鱼类生殖是指对鱼类进行人工催产，具体通过向鱼类腹腔注射多肽对鱼类进行催产。
其中，鱼类包括但不限于半滑舌鳎。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明以神经肽NKB和NKBRP对半滑舌鳎进行催产，可以显著上调垂体中lhβ和fshβ的表达水平，从而促进包括半滑舌鳎在内的鱼类进行催产，为推动半滑舌鳎等鱼类产业养殖规模和技术创新具有重要意义。
附图说明
图1为本发明的实施例2中NKB和NKBRP成熟肽腹腔注射半滑舌鳎后垂体lhβ基因mRNA水平表达影响示意图(误差棒上不同字母表示差异显著)。
图2为本发明的实施例2中NKB和NKBRP成熟肽腹腔注射半滑舌鳎后垂体fshβ基因mRNA水平表达影响示意图(误差棒上不同字母表示差异显著)。
具体实施方式
本发明提供了一种鱼类神经肽NKB和NKBRP及其编码基因和应用。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1半滑舌鳎tac3基因序列鉴定
以半滑舌鳎全脑cDNA为模板，根据其基因组中预测序列设计特异性引物进行PCR扩增，从而获得半滑舌鳎tac3 cDNA序列。具体步骤如下：
1.半滑舌鳎tac3基因克隆：
首先利用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂提取脑组织总RNA；其次，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书合成第一链cDNA；第三，按照TaKaRa Ex Taq所要求的反应条件进行半滑舌鳎tac3 cDNA片段PCR扩增。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，50℃30s，72℃30s，38个循环；72℃5min。将PCR产物用1.5％的胶进行凝胶电泳检测，将符合目的基因大小的条带按照Zymoclean Gel DNARecovery Kit(Zymo Research)胶回收试剂盒说明书进行胶回收，测序得到187bp的片段，经blast比对证实为半滑舌鳎tac3部分cds序列。根据此序列设计特异性引物，通过3’/5’RACE进一步获得半滑舌鳎tac3全长cds序列。
序列如下(SEQ ID NO.1)：EMHDIFVGLM-NH2
序列如下(SEQ ID NO.2)：YNDWDYDSFVGLM-NH2
编码NKB和NKBRP多肽的基因，即tac3的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.3)：
ATGAGGAGAGGTTTTCTGCTGGTGACTCTGGTCCTCGTCGTCAAACTTCGCTGCGGCCAGTCCAGATGCGAGGAGGCAGAGTCGAGCAGATCGACTTCAGATCACAGCACTGGTTTGGAGAAAATCAAGAGGAGTATTTTGAAGAGGTATAACGATTGGGATTATGACAGCTTTGTGGGTCTGATGGGCAGAAGGAACACGGATGAAAACAATCTTCAGTCACAACAAAAAAGGGAAATGCACGACATTTTTGTTGGACTTATGGGAAGGAGAAGTTCAGAGTCAGATAATGGTCCCTGGAGGAGAGCGTATCCAGAGAGGAGAGGTATTTCTCTGCACAAGTGCAAACTGAGGTTTCTTCAAGGTCTGTAG。
实施例2半滑舌鳎NKB和NKBRP成熟多肽的生物学功能研究
发明人通过ProP 1.0 Server软件分析和序列比对预测半滑舌鳎NKB和NKBRP成熟肽，氨基酸序列分别如下：
NKB序列如下(SEQ ID NO.1)：EMHDIFVGLM-NH2
NKBRP序列如下(SEQ ID NO.2)：YNDWDYDSFVGLM-NH2
上述成熟多肽序列由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度为95.0％。通过腹腔注射实验，发明人研究了NKB和NKBRP成熟多肽对半滑舌鳎垂体lhβ和fshβ表达调控的影响。
将2龄半滑舌鳎雌鱼(平均体重为750.24g)驯养于循环海水养殖池中，水温介于21-23℃之间，12h光照，溶氧大于6mg/L，每天两次进行饱食投喂，驯养7天后用于实验。半滑舌鳎经MS222麻醉后，称量体重，按照100ng/g体重和1000ng/g体重的剂量分别注射NKB和NKBRP多肽，对照组注射PBS，每种处理组8条鱼。注射6h后，将半滑舌鳎麻醉后断头处死，取垂体组织置于液氮中。随后进行RNA提取，反转录和荧光定量PCR。
如图1和图2所示，结果表明，按100ng/g体重的剂量注射NKB多肽6h后促进了半滑舌鳎垂体lhβ和fshβ基因mRNA的表达；按1000ng/g体重的剂量注射NKBRP多肽6h后增加了fshβ基因mRNA的表达水平，但对lhβ基因mRNA的表达水平无影响。
上述结果表明，NKB和NKBRP可以作为一种鱼类性成熟催产剂，广泛应用于半滑舌鳎等水产养殖行业。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (6)
1.一种鱼类神经肽NKB和NKBRP，其特征在于，分别包括SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2.一种编码鱼类神经肽NKB和NKBRP的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种多肽，其特征在于，所述多肽以SEQ ID NO. 3的基因编码的前体的成熟多肽。
4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。
5.一种如权利要求3所述的多肽在制备用于调控鱼类生殖的制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述调控鱼类生殖是指对鱼类进行人工催产。
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| CN202211391554.XA CN115925862A (zh) | 2022-11-07 | 2022-11-07 | 一种鱼类神经肽nkb和nkbrp及其编码基因和应用 |
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- 2022-11-07 CN CN202211391554.XA patent/CN115925862A/zh active Pending
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