CN110257395B

CN110257395B - 草鱼adiponectin A基因、编码蛋白及其应用

Info

Publication number: CN110257395B
Application number: CN201910522917.0A
Authority: CN
Inventors: 秦超彬; 赵文丽; 杨国坤; 聂国兴; 杨丽萍; 孟晓林; 卢荣华
Original assignee: Henan Normal University
Current assignee: Henan Normal University
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2039-06-17
Also published as: CN110257395A

Abstract

本发明公开了一种草鱼adiponectin A基因、编码蛋白及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的技术方案要点为：草鱼adiponectin A基因，该草鱼adiponectin A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，还公开了含有上述草鱼adiponectin A基因的重组表达载体、重组菌株及其在制备草鱼促生长剂或添加剂中的应用。本发明首次扩增编码草鱼adiponectin A蛋白的基因，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌种在体外获得大量表达的草鱼adiponectin A蛋白，该蛋白可以用于制备适合草鱼使用的促生长剂或添加剂。

Description

草鱼adiponectin A基因、编码蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种草鱼adiponectin A基因、编码蛋白及其应用。

背景技术

脂肪组织不仅能够储存能量，还是一个功能活跃的内分泌器官。由脂肪细胞合成和分泌，并释放到循环系统中的内分泌因子，被统称为脂肪细胞因子，它们对糖类和脂质代谢的调控发挥着重要作用。脂联素(adiponectin)是哺乳类血液中蛋白水平最高的脂肪细胞因子，它与其受体(AdipoR1和AdipoR2)结合后，能够通过激活AMPK和PPARα等信号通路，改善胰岛素抵抗，提高葡萄糖的摄入量，促进脂肪酸的β氧化作用。因此，脂联素具有促进葡萄糖摄取、降血糖、抗脂肪肝病等生理功能。

草鱼属鲤形目，鲤科，雅罗鱼亚科，草鱼属。草鱼以其肉质细嫩、个体大、肌间刺少而备受消费者喜爱。在我国大宗淡水鱼中，草鱼养殖产量常年位居第一。目前草鱼饲料还需要添加大量的动植物蛋白，但蛋白质成本高昂，而糖类和脂肪则价格较为低廉。糖类和脂肪可以减少用于供能所消耗的蛋白质，具有节约蛋白质的作用。饲料中适当提高糖类和脂质的含量，可以替代部分作为能源消耗的蛋白质，从而提高蛋白质的利用率。饲料中糖的含量过高也会引起生长缓慢，鱼对糖的利用能力有限；脂类含量太高会导致脂肪肝，使肝功能减弱，解毒力下降。但目前在草鱼人工养殖中还没有一种能有效促进糖类和脂质利用的饲料添加剂。

发明内容

本发明的目的是提供了一种草鱼adiponectin A基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌株及其在制备草鱼促生长剂或添加剂中的应用。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案，草鱼adiponectin A基因，该草鱼adiponectin A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明扩增了编码草鱼adiponectin A蛋白的基因，克隆的方法是常规的基因克隆方法，通过设计引物，利用草鱼肾脏cDNA为模板，经过PCR后得到目的基因片段，对PCR产物进行回收后，将得到的目的基因片段连接到pMD19-T载体为pMD19-T-adiponectin A。

本发明提供了上述草鱼adiponectin A基因编码的草鱼adiponectin A蛋白，该草鱼adiponectin A蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明构建了含有编码草鱼adiponectin A蛋白的大肠杆菌表达载体，该表达载体的构建方法是按常规同源重组的方法。利用原核表达质粒pET22b为模板，通过PCR方法进行线性化；利用自己构建的pMD19-T-adiponectin A载体为模板，通过PCR方法在编码草鱼adiponectin A蛋白基因的两侧引入与载体克隆位点两端完全一致的15bp同源序列，得到带有酶切接头的编码草鱼adiponectin A蛋白的基因。分别经分离纯化后，将两者进行同源重组连接，即构建成含有编码草鱼adiponectin A蛋白基因的表达载体pET22b-adiponectin A。

本发明还用上述含有编码草鱼adiponectin A蛋白的相应表达载体pET22b-adiponectin A构建了能够高效表达草鱼adiponectin A蛋白的大肠杆菌重组菌株。该重组菌株由含有编码草鱼adiponectin A蛋白基因的表达载体pET22b-adiponectin A转化大肠杆菌BL21而得到的菌株，命名为pET22b-adiponectin A-BL21。

本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组菌株生产草鱼adiponectin A蛋白的方法。将上述重组菌株接种在LB液体培养基中，37℃，20rpm培养14-16h，按照体积比1:100接种在500mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600达到0.5-0.8，然后加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200rpm培养3h后6000g离心10min收集菌体，超声破碎后6500g离心15min收集沉淀，沉淀用含有6M尿素的Binding buffer溶解后，经分离纯化得到重组草鱼adiponectin A蛋白。

本发明还提供了重组草鱼adiponectin A蛋白的复性、浓缩和脱盐的方法。将纯化得到的重组草鱼adiponectin A蛋白加入到透析袋中，依次放入含有4M、2M、尿素的PBS中，4℃分别透析12h，然后放入含尿素的PBS继续4℃透析24h，每12h更换1次PBS。将透析后的重组草鱼adiponectin A蛋白加入到超滤管，4℃5000g离心2-3h，使超滤管中蛋白溶液至1mL左右，弃滤出液，向超滤管中加入10mL的PBS，反复重复4次得到去除咪唑的重组草鱼adiponectin A蛋白。

草鱼具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的草鱼adiponectin A基因重组株pET22b-adiponectin A-BL21，生产重组草鱼adiponectin A蛋白，并可进一步用作制备适合草鱼使用的促生长剂或添加剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首次扩增编码草鱼adiponectin A蛋白的基因，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌种在体外获得大量表达的草鱼adiponectin A蛋白，该蛋白可以用于制备适合草鱼使用的促生长剂或添加剂。

附图说明

图1是以草鱼肾脏的反转录cDNA为模板进行PCR扩增adiponectin A的凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：PCR扩增产物；

图2是pET22b载体线性化PCR扩增及带有载体同源序列的编码草鱼adiponectin A蛋白基因片段PCR扩增凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1-4：pET22b载体线性化PCR扩增产物；5：带有载体同源序列的编码草鱼adiponectin A蛋白的基因片段PCR扩增产物；

图3是重组质粒pET22b-adiponectin A的凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：pET22b-adiponectin A；

图4中A是重组株pET22b-adiponectin A-BL21表达产物adiponectin A的SDS-PAGE电泳分析图，其中：M：蛋白Marker；1：空载体对照；2：未诱导；3、4、5、6是分别用IPTG诱导1、2、3、4小时。B和C是重组株pET22b-adiponectin A-BL21表达产物adiponectin A纯化产物的SDS-PAGE电泳分析图和Western blot鉴定，其中，M：蛋白Marker；1-6：纯化后adiponectin A蛋白；

图5是重组草鱼adiponectin A蛋白对草鱼血糖、血清甘油三酯和血清游离脂肪酸含量的影响；A是血糖(glucose)；B是血清甘油三酯(TG)；C是血清游离脂肪酸(FFA)。其中，柱子上的不同英文字母表示差异性显著。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

编码草鱼adiponectin A蛋白基因片段的克隆

设计两对引物，第1对引物的正向引物序列为5'TCTCAAAAGGCAAAAGGACA3'，反向引物序列为5'AACAAGCACCCCACCAGTA 3'；第2对引物的正向引物序列为5'GCTCAAACTACAACTCCACACAA 3'，反向引物序列为5'TAGCAGGGTGGCAGGAAGAC3'；以草鱼肾脏RNA反转录后的cDNA为模板，采用第1对引物进行第1轮PCR；将第1轮PCR产物稀释50倍后作为模板，采用第2对引物进行第2轮PCR后，获得目的条带。两轮PCR的反应条件均为：94℃3min；98℃10s，53℃15s，72℃1min 30s，30个循环；72℃5min；12℃∞，第二轮PCR反应后的凝胶电泳图见图1。

实施例2

pET22b载体线性化PCR扩增及带有载体同源序列的编码草鱼adiponectin A蛋白的基因片段PCR扩增

根据pET22b载体序列设计一对特异性引物，正向引物序列为5'GATCCGGCTGCTAACAAAGCC 3'，反向引物序列为5'GGCCATCGCCGGCTGGGCAGC 3'，以pET22b载体为模板进行PCR反应，扩增线性化的pET22b载体。根据克隆到的编码草鱼adiponectin A基因的序列及线性化pET22b载体的两端序列，设计合成一对特异性引物，正向引物F的序列为5'CAGCCGGCGATGGCCCATCATCATCATCATCATCAGGAGGAGAACACAGAGCT 3'，该引物在编码adiponectin A蛋白成熟肽的序列前，添加与线性化pET22b载体同源的15bp序列和6×HIS标签；反向引物R的序列为5'GTTAGCAGCCGGATCTCATCGTCTGCGGTTGTCAA 3'，该引物在编码adiponectin A蛋白成熟肽的序列后添加终止密码子和线性化pET22b载体另一端同源的15bp序列。利用自己构建的pMD19-T-adiponectin A载体为模板进行PCR反应合成带有酶切接头的编码草鱼adiponectin A蛋白的基因。上述PCR反应的条件均为：94℃3min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，35个循环；72℃5min；12℃∞，PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2。

实施例3

含编码草鱼adiponectin A基因的大肠杆菌表达载体pET22b-adiponectin A的构建

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒分离纯化pET22b线性化载体、编码草鱼adiponectin A的基因片段。将两者混合后用T4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5α中，用LB平板筛选具Ampicillin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，并进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图3，然后将质粒进行测序验证。

实施例4

能高效表达草鱼adiponectin A的大肠杆菌重组株pET22b-adiponectin A-BL21的构建

制备好的重组质粒pET22b-adiponectin A用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在含Ampicillin的LB平板上37℃进行培养。过夜后长出单克隆，挑取大肠杆菌工程菌pET22b-adiponectin A-BL21单菌落接种在5mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，然后按照体积比1:100的比例接种于10mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600到0.5-0.8，然后加入IPTG使其终浓度为1mM，37℃，200rpm分别培养1h、2h、3h、4h后，取1mL菌液5000g离心10min收集菌体，加入30μL PBS重悬菌体。取3μL菌液加等体积2×电泳上样缓冲液，煮沸10min后按标准方法进行SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pET22b转化BL21后长出的单克隆培养后的菌液，结果见图4中的A。

实施例5

利用大肠杆菌基因工程菌pET22b-adiponectin A-BL21生产重组草鱼adiponectin A

挑取大肠杆菌工程菌pET22b-adiponectin A-BL21单菌落接种在5mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，然后按照体积比1:100的比例接种于500mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600到0.5-0.8，然后加入IPTG使其终浓度为1mM，37℃，200rpm培养3h后6000g离心10min收集菌体，超声破碎后6500g离心15min收集沉淀，沉淀用含有6M尿素的Binding buffer溶解后，使用GE公司的HisTrap excel进行纯化。取10μL蛋白溶液加入等体积2×电泳上样缓冲液，煮沸10min后按标准方法进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果见图4中的B。采用免疫印迹(Western blot)方法对重组草鱼adiponectin A蛋白进行鉴定。一抗为鼠抗His单克隆抗体(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，二抗为羊抗鼠IgG-HRP(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，结果见图4中的C。将纯化得到的重组草鱼adiponectin A蛋白加入到透析袋中，依次放入含有4M、2M、尿素的PBS中，4℃分别透析12h，然后放入含尿素的PBS继续4℃透析24h，每12h更换1次PBS。将透析后的重组草鱼adiponectin A蛋白加入到超滤管，4℃5000g离心2-3h，使超滤管中蛋白溶液至1mL左右，弃滤出液，向超滤管中加入10mL的PBS，反复重复4次得到去除咪唑的重组草鱼adiponectin A蛋白。

实施例6

重组草鱼adiponectin A蛋白的功能研究即对草鱼血清中葡萄糖、甘油三酯和游离脂肪酸含量的影响

草鱼(体重100g左右)驯养2周后，饥饿24h，空白对照组灌喂纯水并立即腹腔注射PBS，剂量均为200μL/100g BW。其它组均灌喂0.835mg/μL的葡萄糖(200μL/100g BW，即167mg/100g BW)，并分别按照200μL/100g BW立即腹腔注射PBS、25ng/μL和250ng/μL重组草鱼adiponectin A蛋白溶液(即50ng/g BW、500ng/g BW)。腹腔注射3h后抽血，4℃3000g离心10min吸取上清液获得血清。用全自动生化分析仪测定血清中葡萄糖、甘油三酯的含量；用游离脂肪酸检测试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)测定血清中游离脂肪酸含量。结果显示，重组草鱼adiponectin A蛋白能够抑制葡萄糖引起的血清甘油三酯和血糖水平的升高，并降低血清中游离脂肪酸的含量，结果如图5。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

序列表

<110> 河南师范大学

<120> 草鱼adiponectin A基因、编码蛋白及其应用

<130> 2019

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Gln Glu Glu Asn Thr Glu Leu Ala Glu Gln Asp Ser Arg Glu Pro Cys

1 5 10 15

Ala Arg Trp Met Arg Gly Val Ser Gly Thr Pro Gly Phe Asn Gly Ile

20 25 30

Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Arg Glu Gly Glu Lys Gly Asp Ile

35 40 45

Gly Asp Pro Gly Pro Lys Gly Pro Asn Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly

50 55 60

Asp Glu Gly Pro Ala Gly Lys Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Leu

65 70 75 80

Lys Gly Glu Ser Gly Glu Gly Ser Phe Pro Tyr His Ser Ala Phe Ser

85 90 95

Met Gly Leu Thr Ser Lys Ile Ser Ser Ala Ser Gly Ala Pro Ile Arg

100 105 110

Phe Thr Lys Thr Phe Tyr Asn Glu Gln His His Tyr Asp Glu Ile Ser

115 120 125

Gly Lys Phe Arg Cys Ala Ile Ser Gly Ile Tyr Tyr Phe Thr Tyr His

130 135 140

Leu Thr Ile Asn Gly Lys Glu Thr Lys Val Ala Met Phe Arg Asn Gly

145 150 155 160

Arg Thr Val Ala Phe Thr Leu Asp Gln Phe His Asn Gly Asn Leu Asp

165 170 175

Gln Ala Ser Gly Gly Ala Ile Leu Asn Leu Ser Ala Gly Asp Glu Val

180 185 190

Trp Leu Gln Leu Tyr Asp Asp Phe Phe Asp Ala Gly Ile Tyr Ala Asp

195 200 205

Asn Ser Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Thr Pro Lys Ile

210 215 220

Leu Ser Asn Pro Phe Asp Asn Arg Arg Arg

225 230

<210> 2

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

caggaggaga acacagagct ggctgagcag gacagcaggg aaccttgtgc ccgctggatg 60

aggggtgttt ctggaacccc aggtttcaat ggaatccccg ggcgggatgg acgtgatggg 120

cgtgaggggg agaagggtga tatcggagat ccaggtccca agggaccaaa tggagagcca 180

ggtgaaccag gggacgaggg acctgcaggc aaaagaggat ttcctggaaa cccaggtctg 240

aaaggagaga gtggagaggg ttccttcccc taccactcag cttttagcat gggacttaca 300

agtaaaatca gctctgccag tggagctccc atccgcttca caaagacctt ctacaatgag 360

cagcaccact acgatgaaat ctccggaaag tttcgctgtg caatctctgg gatctactac 420

ttcacatatc acctcactat caacgggaag gagaccaagg tagctatgtt ccgaaatggc 480

cggactgtgg ccttcactct tgaccagttc cacaacggaa atctggatca ggcctccgga 540

ggggcgattt taaatctgtc tgctggagat gaggtttggc tacagttgta tgatgacttt 600

tttgatgcag ggatttatgc tgataacagc aacgactcca ctttcactgg ctttcttttg 660

actcctaaaa tcttaagcaa cccatttgac aaccgcagac gatga 705

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

tctcaaaagg caaaaggaca 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

aacaagcacc ccaccagta 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

gctcaaacta caactccaca caa 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

tagcagggtg gcaggaagac 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gatccggctg ctaacaaagc c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

ggccatcgcc ggctgggcag c 21

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagccggcga tggcccatca tcatcatcat catcaggagg agaacacaga gct 53

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gttagcagcc ggatctcatc gtctgcggtt gtcaa 35

Claims

1.草鱼adiponectin A基因，其特征在于：该草鱼adiponectin A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的草鱼adiponectin A基因编码的草鱼adiponectin A蛋白，其特征在于：该草鱼adiponectin A蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3. 一种含有权利要求1所述的草鱼adiponectin A基因的重组表达载体。

4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体利用原核表达质粒pET22b为模板，通过PCR方法进行线性化；再利用自己构建的pMD19-T-adiponectin A载体为模板，通过PCR方法在编码草鱼adiponectin A蛋白基因的两侧引入与pMD19-T-adiponectin A载体克隆位点两端完全一致的15 bp同源序列，得到带有酶切接头的编码草鱼adiponectin A蛋白的基因，分别经分离纯化后，将pET22b线性化载体和带有酶切接头的编码草鱼adiponectin A蛋白的基因混合后用T4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5α中，用LB平板筛选具Ampicillin抗性的转化子，即构建成含有编码草鱼adiponectin A蛋白基因的表达载体pET22b-adiponectin A。

5. 权利要求3或4所述的重组表达载体转化的大肠杆菌重组菌株，其特征在于：该重组菌株是由含有编码草鱼adiponectin A蛋白基因的表达载体pET22b-adiponectin A转化大肠杆菌BL21而得到的重组菌株pET22b-adiponectin A-BL21。

6. 权利要求5所述的大肠杆菌重组菌株在制备重组草鱼adiponectin A蛋白中的应用。

7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于重组草鱼adiponectin A蛋白的具体制备过程为：将重组菌株接种在LB液体培养基中，37℃，20 rpm培养14-16 h，按照体积比1:100接种在500 mL LB液体培养基中，37℃，200 rpm培养至OD600达到0.5-0.8，然后加入IPTG至终浓度为1 mM，37℃，200 rpm培养3 h后6000 g离心10 min收集菌体，超声破碎后6500 g离心15 min收集沉淀，沉淀用含有6 M尿素的Binding buffer溶解后，经分离纯化得到重组草鱼adiponectin A蛋白。

8. 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述重组草鱼adiponectin A蛋白的浓缩和脱盐方法的具体过程为：将纯化得到的重组草鱼adiponectin A蛋白加入到透析袋中，依次放入含有4 M、2 M尿素的PBS中，4℃分别透析12 h，然后放入含尿素的PBS继续4℃透析24 h，每12 h更换1次PBS，将透析后的重组草鱼adiponectin A蛋白加入到超滤管，4℃，5000 g离心2-3 h，使超滤管中蛋白溶液至1 mL，弃滤出液，向超滤管中加入10 mL的PBS，反复重复4次得到去除咪唑的重组草鱼adiponectin A蛋白。

9. 权利要求2所述的草鱼adiponectin A蛋白或权利要求6所述应用中的重组草鱼adiponectin A蛋白在制备草鱼促生长剂或添加剂中的应用，所述重组草鱼adiponectin A蛋白能够抑制葡萄糖引起的血清甘油三酯和血糖水平的升高，并降低血清中游离脂肪酸的含量。