CN102399802A - 一种新型耐热β-琼胶酶AgaXa及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种β-琼胶酶AgaXa，是由Catenivulumsp.X3的一个琼胶酶基因agaXa编码的一种新型琼胶酶。本发明的β-琼胶酶AgaXa及独特之处是在47℃（琼脂糖凝固的温度为40℃）时，酶活性稳定且酶活力高，因此本发明可以应用于从琼脂糖凝胶中回收DNA，且具有优势。本发明β-琼胶酶AgaXa能够特异的降解琼脂糖产生聚合度为6-14的新琼寡糖，能够应用于生产多聚寡糖。本发明的大肠杆菌重组菌株BL21-pET32-agaXa能够大量的表达β-琼胶酶AgaXa，易于纯化，可应用于生产β-琼胶酶AgaXa，且成本低。

Description

一种新型耐热β-琼胶酶AgaXa及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种β-琼胶酶AgaXa。具体的说，涉及一种来源于Catenivulum sp. X3的一个琼胶酶基因agaXa编码的一种新型琼胶酶AgaXa及其基因克隆、原核表达、产物的制备及重组琼胶酶agaXa的应用。

背景技术

琼胶酶可以降解琼脂糖，其主要来源是海洋微生物。根据作用方式的不同，可以分为两类：(l)α-琼胶酶，专一降解琼胶中的α-1,3糖苷键，生成以 3,6-内醚-α-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖系列；(2)β-琼胶酶，专一降解琼胶中的 β-1,4糖苷键，生成以 β-D-半乳糖为还原性末端和以 3,6-内醚-β-L-半乳糖为非还原性末端的新琼低聚糖系列。目前所报道的琼胶酶中绝大多数属于β-琼胶酶，很少有α-琼胶酶。多年的研究和实践证明，琼胶降解产物不同聚合度的琼胶寡糖具有多种生理活性，在医药、化妆品、食品工业及农业等方面具有重要的应用价值。比如新琼寡糖具有抗氧化性、抑制癌细胞的发生、抗病毒等特殊功能，可以作为食品添加剂；具有细胞增白和保湿功能，可作为化妆品的添加剂等等。传统的酸法降解琼胶法生产琼胶寡糖反应剧烈、工艺条件难以控制，专一性差，水解产物容易被破坏，因此逐渐被反应调件温和、专一度高和高效的酶解法所代替。此外，由于琼胶是某些红藻细胞壁的重要组成成分，琼胶酶亦可用作大型海藻酶解的工具酶来获得单细胞或原生质体。在分子生物学实验中，可利用琼胶酶从琼脂糖凝胶中回收 DNA和RNA。因此高活性、高稳定性的琼胶酶在具有很大的工业应用价值。

发明内容

本发明得到β-琼胶酶基因agaXa，并通过基因工程技术获得其重组蛋白，该序列编码的蛋白质在回收琼脂糖凝胶中的DNA、制备低聚琼胶寡糖、海藻工具酶及海藻多糖结构的研究等方面有广泛的应用。

本发明的目的是提供一种来源于Catenivulum sp. X3的一个琼胶酶基因agaXa编码的一种新型琼胶酶AgaXa及其制备方法和应用。

本发明通过构建细菌Catenivulum sp. X3的部分基因组文库的方法获得了一种β-琼胶酶基因agaXa，其编码了Catenivulum sp. X3的一个琼胶酶AgaXa。其核苷酸序列为：ATGAAACTATTGAATAAGTTTTCTCGTGCTCAGCTTTTCGGATTACTCGCGGGCGTATGTTGTTCAACCACAGCCGTTCAAGCAGCAACTTTTACCGTATACAACGAAACCCAATTAAATAACGCATTAACTTCTGCGCAAAATAATGGCCTAGATACTTTAGATACAATAAAGATCAGCGGTACTATTAACATTTACGGACAAATAGATATTAAGTCATCTGTAAAAATTACTGGTGCTCAAACAAACAGAGCGTCAAAATTAACTAGACGCAACACAGGCTTTTACAACCCGCTCATTAACGTACAATACAAAAACGTAACGGTTGAAAATATTACGCTTGAAGGTATTGGTGCGAACACTAATCAGCAATTATTATCTTTAGCTGGTGATGATACCAGCAACAGTGCATTGATTAACTTACCCGCAACTGCTTATGCTACTAACCCGAAAGGTTTTACTGCAACAAATGTTAACTTTTTTGATAGTGCAATAGGTGTTGCATCTGTAGGCATATTGCCACAAGACTTAAACGTTTCTTACAATACTTTTAGAAATATTAACCGTGCAGTGGAGCTTTTACGTGACGTTGACCGTGTAGATGATGCACTTTTAAATAACGCTCAAATTAAAGTAAACGGCAATATTATTGGTTTGTATGGCGGGAAGTTAAATATTTCAAATAACTTAATTAACGCTGAAAACATGCGTTTGGCGATATCTTTAGACGGCGGCAACGATGGTGCTGGTTTTATTGGCTCAGGCTTTTTAAACCCTTGGTCTGAAAAACGCCAAACCTATACCGACAAGCCCGTTTATTATTCAAGCGTAATTGGTGAAGCGGTTATCAATAACAACCGTATTGGTTATTATCAACACACAGACGGCGCAGTATGGACTGTTGGTCAAACTCGTGAATTTGGTATCGCACTTGCAACAGTTGCGAATATTTATGTAGTCGGTAACCATGTAAGAACTGGTTTAAACTTTGTAACGCAAGGTGACGGTGTCACGCCAGTAAACAATGCAAGTTTCGGCTTTGGCTCTGCAATTAATGTTGAACACAATGGCGAAAACATTGTAATTCAAAGCAACCATATTCATGTTGGTGCAAAAGGCAATGGTGCAAATGCTTTTACTATTTTGGCGTTTAACGACCACGGCGCATATTGGAATTTAGCTCAAACCTCTAAAAACCTAACATATGCAAACAACGTGATTAGTGGCAGTGGTGCAAATGTGTTTTATGCGATTGGCTACAGAAACTTAAACATGCTTAATAACGATGTACGTAACTTTAGCTCAAGTGGTGCAGTATTCGGCTGTGGTGGTGTGGTATCCCCTATCAATAACTTTTTAGCGAATGTCCCTGGTGGTTATAGCAATAGCTATATTGAACAAAACCCAGCTACCCATGGTCGTTTATGGTTTGATGCTGTGCGAAATAATGGCCAAGTAGTCGGCGCATTTACCGGTCAAGGTTCAAGAGCGCCACGCTCGTTTTATTACTTGTCAGGAGACGATCCGAAAAATCCAAGATTTGGCGATGCCCAAGTAGTGGATTCAGTCAGTATTATGGGTTGTAATTAA。

将本发明的β-琼胶酶基因agaXa用于制备大肠杆菌克隆载体pBSK-agaXa。

将本发明的β-琼胶酶基因agaXa用于制备大肠杆菌重组菌DH5α-pBSK-agaXa。

将本发明的β-琼胶酶基因agaXa用于制备大肠杆菌表达载体pET32-agaXa。

将本发明的β-琼胶酶基因agaXa用于制备大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa。

将本发明的β-琼胶酶基因agaXa用于制备重组β-琼胶酶AgaXa。本发明的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa能够大量的表达重组β-琼胶酶AgaXa。并可以通过亲和层析纯化。可以得到大量纯度高的重组β-琼胶酶AgaXa。

将本发明的重组β-琼胶酶AgaXa用制备不同聚合度的新琼寡糖。本发明中的β-琼胶酶AgaXa可以降解琼脂糖产生聚合度为6-14的新琼寡糖。

将本发明的重组β-琼胶酶AgaXa用于回收琼脂糖凝胶中的DNA。

附图说明

下面通过实例对本发明进行说明，以帮助普通技术人员进一步理解本发明。

图1是β-琼胶酶基因agaXa的核苷酸序列。

图2是根据β-琼胶酶基因agaXa的核苷酸序列推测的氨基酸序列。

图3是大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa。

图4是纯化的重组β-琼胶酶AgaXa的SDS-PAGE分析，图中为M: Marker， P: 纯化后的琼胶酶AgaXa，其分子量为52kDa。

具体实施方式

实验通过构建部分基因组文库的方法从产琼胶酶细菌Catenivulum sp. X3中克隆其琼胶酶基因，利用生物学软件对基因进行分析；利用基因工程手段构建琼胶酶基因的原核表达工程菌，再通过亲和层析技术纯化得到重组酶；并对该琼胶酶的酶学特性、降解产物、该重组琼胶酶的应用进行研究。

菌株Catenivulum sp. X3从汕头市沿海分离得到，并通过其16S rRNA鉴定（GenBank登录号：GU975828）。

实施例1：β-琼胶酶AgaXa的克隆

通过EcoRⅠ和HindⅢ这两种酶双酶切Catenivulum sp. X3的总DNA，回收细菌基因组酶切后长度为3-7kb大小的基因片段，与经过同样酶切的pBluescriptⅡSK(+)载体连接，构建细菌的部分基因组文库。筛选在平板上具有琼胶酶活性的阳性克隆子，送北京华大公司测序。通过生物软件DNASTAR分析得到一个基因完整的开放阅读框。通过生物软件Primer5.0设计正向引物(5'-GCGCGGATCCATCAAACTATTGAAT-3')和反向引物（5'-GGCCTCGAG  AATTACAACCCAT-3'），以基因组DNA为模板，进行PCR。

反应体系（25μL）：1μLDNA模板，1μL正向引物，1μL反向引物，9.5μL双蒸水，12.5μL高保真PCR mix。

反应条件：95℃预变性5min，然后95℃ 30s，50℃ 30s， 72℃ 1min30s，32个循环。反应结束后整体延伸10min。

将PCR产物通过试剂盒回收得到β-琼胶酶基因agaXa（图1）。

该琼胶酶基因agaXa包含1590bp，编码529个氨基酸（图2），等电点为7.79, 含有一个28个氨基酸残基的信号肽序列，信号肽的切割为点为了第28和29位的两个丙氨酸之间。除去信号肽后该琼胶酶的推测分子量大小为53.7 KDa。

实施例2：大肠杆菌表达载体pET32-agaXa的构建，由实施例1所得到的β-琼胶酶基因agaXa以及表达载体pET32a（+）分别用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切条件如下：

反应体系（20μL）：双蒸水10μL，10×K Buffer 2μL，基因agaXa DNA [pET32a（+）质粒DNA]6μL，BamH 1μL，XhoⅠ1μL，在37℃下酶切2小时。电泳后分别回收大小约为1.5kb和5.9kb的目的片段。二者分别为β-琼胶酶基因agaXa以及表达载体pET32a（+）。

然后用T₄连接酶将二者连接，反应条件如下：

反应体系（20μL）：双蒸水 9μL，1.5kb片段 2μL，5.9kb片段 6μL，10×T₄连接酶Buffer 2μL ，T₄连接酶 1μL，在16℃下酶连8小时以上，得到大肠杆菌表达载体pET32-agaXa。

实施例3：大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa的构建。

取由实施例2得到的重组载体pET32-agaXa 10μL加入到100μL BL21感受态细胞中，冰上放置30min；然后放入42℃热激90秒；快速将EP管转移到冰浴中15min；然后每管加入700μL LB培养基，将管转移至37℃摇床，缓慢振摇60min使细菌复苏；取50μL复苏后的菌液涂布于含Amp以及X-Gal和IPTG的固体LB平板上；倒置平皿，于37℃恒温培养24h；最后挑取白色单菌落用于PCR检测。在琼脂糖电泳中显示1.5kb大小的特异条带的即为含有pET32-agaXa的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa（图3）。

实施例4：重组β-琼胶酶AgaXa的制备。

在液体LB（含100μg /mL的氨苄青霉素）培养基中按1%比例接入培养过夜的由实施例3得到的大肠杆菌重组菌E. coli BL21(DE3)-pET32-agaXa菌液，在37℃培养至OD₆₀₀=0.6后加入0.1mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及0.01% 脱氧胆酸钠(DOC)，于25℃温度进行诱导发酵20h。发酵后,得到的初酶液直接用30～75%的硫酸铵梯度沉淀蛋白质,分离得到的蛋白质在2mmol/L的磷酸缓冲液中透析去离子，透析后的酶液用聚乙二醇20000浓缩。由于重组蛋白含有6×HIS标签，浓缩液直接过 镍NTA琼脂糖凝胶 FF柱，亲和层析纯化重组酶，咪唑梯度竞争洗脱，纯化过程参照HIS纯化Kit说明书。纯化后的琼胶酶利用BCA法测定蛋白浓度，通过用12% SDS-PAGE检测酶液的纯度及分子量(图4),在分子量大小为53KDa处有单一条带，和推测分子量大小相符，纯化蛋白达到电泳纯。纯化的重组β-琼胶酶AgaXa保存于-40℃以备用。

实施例5：利用重组β-琼胶酶AgaXa制备不同聚合度的新琼寡糖。

将琼脂糖溶于10mmol/L Tris-HCl（pH7.4）缓冲液中，配成3%的琼脂糖溶液，冷却至45℃；按1U/mL加入由实施例4得到的重组β-琼胶酶AgaXa；在45℃条件下反应2-24小时既可以得到聚合度为6-14的新琼寡糖。

1个酶活力单位（U）定义为：每分钟产生1μmol还原糖（以半乳糖计）所需要的酶量。

实施例6：利用重组β-琼胶酶AgaXa从琼脂糖凝胶中纯化DNA

从琼脂糖凝胶中纯化DNA的步骤如下。

1. PCR产物在低熔点琼脂糖凝胶中进行电泳。

2. 将含有目的片段的凝胶从切胶后加入已经称重的EP管中确认凝胶的重量。

3. 按100mg凝胶加入200μL的10mM Tris-HCl。

4. 琼脂糖在65℃下温浴至溶化，冷却至52℃。

5. 按100mg凝胶加入0.5U的重组琼胶酶AgaXa，同时加入终浓度为10 mM的DDT，在52℃下酶切40min。

6. 冰浴10min后，12000r/min离心10min，取上清液加入DNA硅胶模结合液。

7. 步骤6所得的混合液加入具有硅胶膜的DNA纯化柱中，12000r/min离心1min。

8. 加入75%的乙醇12000r/min离心1min洗柱，重复一次；12000r/min离心3min除去残余的乙醇。

9. 加入30μLTE缓冲液，12000r/min离心1min，收集洗脱液，即得到纯化的DNA片段。 

琼胶酶AgaXa的基因序列：

ATGAAACTATTGAATAAGTTTTCTCGTGCTCAGCTTTTCGGATTACTCGCGGGCGTATGTTGTTCAACCACAGCCGTTCAAGCAGCAACTTTTACCGTATACAACGAAACCCAATTAAATAACGCATTAACTTCTGCGCAAAATAATGGCCTAGATACTTTAGATACAATAAAGATCAGCGGTACTATTAACATTTACGGACAAATAGATATTAAGTCATCTGTAAAAATTACTGGTGCTCAAACAAACAGAGCGTCAAAATTAACTAGACGCAACACAGGCTTTTACAACCCGCTCATTAACGTACAATACAAAAACGTAACGGTTGAAAATATTACGCTTGAAGGTATTGGTGCGAACACTAATCAGCAATTATTATCTTTAGCTGGTGATGATACCAGCAACAGTGCATTGATTAACTTACCCGCAACTGCTTATGCTACTAACCCGAAAGGTTTTACTGCAACAAATGTTAACTTTTTTGATAGTGCAATAGGTGTTGCATCTGTAGGCATATTGCCACAAGACTTAAACGTTTCTTACAATACTTTTAGAAATATTAACCGTGCAGTGGAGCTTTTACGTGACGTTGACCGTGTAGATGATGCACTTTTAAATAACGCTCAAATTAAAGTAAACGGCAATATTATTGGTTTGTATGGCGGGAAGTTAAATATTTCAAATAACTTAATTAACGCTGAAAACATGCGTTTGGCGATATCTTTAGACGGCGGCAACGATGGTGCTGGTTTTATTGGCTCAGGCTTTTTAAACCCTTGGTCTGAAAAACGCCAAACCTATACCGACAAGCCCGTTTATTATTCAAGCGTAATTGGTGAAGCGGTTATCAATAACAACCGTATTGGTTATTATCAACACACAGACGGCGCAGTATGGACTGTTGGTCAAACTCGTGAATTTGGTATCGCACTTGCAACAGTTGCGAATATTTATGTAGTCGGTAACCATGTAAGAACTGGTTTAAACTTTGTAACGCAAGGTGACGGTGTCACGCCAGTAAACAATGCAAGTTTCGGCTTTGGCTCTGCAATTAATGTTGAACACAATGGCGAAAACATTGTAATTCAAAGCAACCATATTCATGTTGGTGCAAAAGGCAATGGTGCAAATGCTTTTACTATTTTGGCGTTTAACGACCACGGCGCATATTGGAATTTAGCTCAAACCTCTAAAAACCTAACATATGCAAACAACGTGATTAGTGGCAGTGGTGCAAATGTGTTTTATGCGATTGGCTACAGAAACTTAAACATGCTTAATAACGATGTACGTAACTTTAGCTCAAGTGGTGCAGTATTCGGCTGTGGTGGTGTGGTATCCCCTATCAATAACTTTTTAGCGAATGTCCCTGGTGGTTATAGCAATAGCTATATTGAACAAAACCCAGCTACCCATGGTCGTTTATGGTTTGATGCTGTGCGAAATAATGGCCAAGTAGTCGGCGCATTTACCGGTCAAGGTTCAAGAGCGCCACGCTCGTTTTATTACTTGTCAGGAGACGATCCGAAAAATCCAAGATTTGGCGATGCCCAAGTAGTGGATTCAGTCAGTATTATGGGTTGTAATTAA

琼胶酶AgaXa的氨基酸序列：

MKLLNKFSRAQLFGLLAGVCCSTTAVQAATFTVYNETQLNNALTSAQNNGLDTLDTIKISGTINIYGQIDIKSSVKITGAQTNRASKLTRRNTGFYNPLINVQYKNVTVENITLEGIGANTNQQLLSLAGDDTSNSALINLPATAYATNPKGFTATNVNFFDSAIGVASVGILPQDLNVSYNTFRNINRAVELLRDVDRVDDALLNNAQIKVNGNIIGLYGGKLNISNNLINAENMRLAISLDGGNDGAGFIGSGFLNPWSEKRQTYTDKPVYYSSVIGEAVINNNRIGYYQHTDGAVWTVGQTREFGIALATVANIYVVGNHVRTGLNFVTQGDGVTPVNNASFGFGSAINVEHNGENIVIQSNHIHVGAKGNGANAFTILAFNDHGAYWNLAQTSKNLTYANNVISGSGANVFYAIGYRNLNMLNNDVRNFSSSGAVFGCGGVVSPINNFLANVPGGYSNSYIEQNPATHGRLWFDAVRNNGQVVGAFTGQGSRAPRSFYYLSGDDPKNPRFGDAQVVDSVSIMGCN

 

Claims (8)

1.一种β-琼胶酶基因agaXa，其特征在于编码了Catenivulum sp. X3的一个琼胶酶AgaXa，并且具有以下核苷酸序列：ATGAAACTATTGAATAAGTTTTCTCGTGCTCAGCTTTTCGGATTACTCGCGGGCGTATGTTGTTCAACCACAGCCGTTCAAGCAGCAACTTTTACCGTATACAACGAAACCCAATTAAATAACGCATTAACTTCTGCGCAAAATAATGGCCTAGATACTTTAGATACAATAAAGATCAGCGGTACTATTAACATTTACGGACAAATAGATATTAAGTCATCTGTAAAAATTACTGGTGCTCAAACAAACAGAGCGTCAAAATTAACTAGACGCAACACAGGCTTTTACAACCCGCTCATTAACGTACAATACAAAAACGTAACGGTTGAAAATATTACGCTTGAAGGTATTGGTGCGAACACTAATCAGCAATTATTATCTTTAGCTGGTGATGATACCAGCAACAGTGCATTGATTAACTTACCCGCAACTGCTTATGCTACTAACCCGAAAGGTTTTACTGCAACAAATGTTAACTTTTTTGATAGTGCAATAGGTGTTGCATCTGTAGGCATATTGCCACAAGACTTAAACGTTTCTTACAATACTTTTAGAAATATTAACCGTGCAGTGGAGCTTTTACGTGACGTTGACCGTGTAGATGATGCACTTTTAAATAACGCTCAAATTAAAGTAAACGGCAATATTATTGGTTTGTATGGCGGGAAGTTAAATATTTCAAATAACTTAATTAACGCTGAAAACATGCGTTTGGCGATATCTTTAGACGGCGGCAACGATGGTGCTGGTTTTATTGGCTCAGGCTTTTTAAACCCTTGGTCTGAAAAACGCCAAACCTATACCGACAAGCCCGTTTATTATTCAAGCGTAATTGGTGAAGCGGTTATCAATAACAACCGTATTGGTTATTATCAACACACAGACGGCGCAGTATGGACTGTTGGTCAAACTCGTGAATTTGGTATCGCACTTGCAACAGTTGCGAATATTTATGTAGTCGGTAACCATGTAAGAACTGGTTTAAACTTTGTAACGCAAGGTGACGGTGTCACGCCAGTAAACAATGCAAGTTTCGGCTTTGGCTCTGCAATTAATGTTGAACACAATGGCGAAAACATTGTAATTCAAAGCAACCATATTCATGTTGGTGCAAAAGGCAATGGTGCAAATGCTTTTACTATTTTGGCGTTTAACGACCACGGCGCATATTGGAATTTAGCTCAAACCTCTAAAAACCTAACATATGCAAACAACGTGATTAGTGGCAGTGGTGCAAATGTGTTTTATGCGATTGGCTACAGAAACTTAAACATGCTTAATAACGATGTACGTAACTTTAGCTCAAGTGGTGCAGTATTCGGCTGTGGTGGTGTGGTATCCCCTATCAATAACTTTTTAGCGAATGTCCCTGGTGGTTATAGCAATAGCTATATTGAACAAAACCCAGCTACCCATGGTCGTTTATGGTTTGATGCTGTGCGAAATAATGGCCAAGTAGTCGGCGCATTTACCGGTCAAGGTTCAAGAGCGCCACGCTCGTTTTATTACTTGTCAGGAGACGATCCGAAAAATCCAAGATTTGGCGATGCCCAAGTAGTGGATTCAGTCAGTATTATGGGTTGTAATTAA。

2.大肠杆菌克隆载体pBSK-agaXa，其含有权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaXa。

3.大肠杆菌重组菌DH5α-pBSK-agaXa，其含有权利要求2所述的大肠杆菌克隆载体。

4.大肠杆菌表达载体pET32-agaXa，其含有权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaXa。

5.大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa，其含有权利要求4所述的大肠杆菌表达载体。

6.重组β-琼胶酶AgaXa，其由权利要求5所述的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa发酵生产。

7.权利要求6所述的重组β-琼胶酶在从琼脂糖凝胶中回收DNA的应用。

8.权利要求6所述的重组β-琼胶酶在降解琼脂糖制备新琼寡糖中的应用。

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