CN103194420B - 一种β-琼胶酶及重组表达菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种β-琼胶酶及重组表达菌株，所提供的β-琼胶酶的重组菌株能够高效的表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的β-琼胶酶，表达出的β-琼胶酶具有耐高温的特性。本发明的重组菌株能搞高效的表达β-琼胶酶，表达的β-琼胶酶具有耐高温的特性，能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖，具有很好工业应用前景。

Description

一种β-琼胶酶及重组表达菌株

技术领域

本发明属于基因筛选应用技术领域，具体涉及一种β-琼胶酶及重组表达菌株，即一种来源于嗜琼胶卵链菌（Catenivulum agarivoransgen. nov. sp. nov.）YM01的β-琼胶酶基因YM01-3及用于重组表达该酶的重组菌株。

背景技术

在自然环境中，琼胶酶的分布较广，很多微生物和一些海洋软体动物都能产生琼胶酶。现阶段，绝大多数被分离研究的琼胶酶都是来自微生物，而海洋细菌又是产琼胶酶最多的类群。琼胶降解菌在海洋生态系统中分布广泛，在海洋植物、动物、海水及海洋沉积物中均有分布。根据氨基酸序列的相似性，琼胶酶被归属为糖苷水解酶家族(Glycoside hydrolase family)中的GH- l6，GH- 50和GH- 86。根据琼胶酶降解琼脂糖作用方式不同，可以把琼胶酶分为两类：α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶裂解琼脂糖的α-1, 3糖苷键，生成以β- D- 半乳糖为非还原性末端和以3, 6- 内醚- α- L- 半乳糖为还原性末端的的琼寡糖系列；β- 琼胶酶裂解琼脂糖的β- 1, 4糖苷键，生成以β- D- 半乳糖为还原性末端和以3, 6- 内醚- α-L- 半乳糖为还原性末端的新琼寡糖系列。已有证据表明，这些琼胶寡糖尤其是新琼寡糖具有很多的生理和生物活性。例如新琼寡糖对黑色素瘤细胞具有保湿和美白效果，还具有抑制微生物生长，刺激巨噬细胞活性的作用；琼胶寡糖在体内体外都具有清除ROS(Reactive Oxygen Species，活性氧簇)造成的氧化损伤的作用，因此可以应用在化妆品和保健品领域。综上所述，可以看出琼寡糖在功能食品、药物、化妆品等领域都有非常广泛的应用前景。

目前常用的琼寡糖生产方法主要有化学法和酶解法两种。传统的化学制备方法反应条件比较剧烈，专一性差，很难得到单一大小的寡糖，而且水解产物容易破坏，不利于产物的分析和回收，这些都限制了琼寡糖的使用。而琼胶酶酶解法由于高度专一高效，反应条件温和，易于控制，产物不易被破坏，因此有利于特定寡糖的大量制备和回收，必将成为琼寡糖生产的主要方法 。

虽然琼胶酶制备寡糖具有很多优势，但目前在工业上并没有得到广泛应用。这主要是因为目前发现和研究较多的是中温琼胶酶。由于提取纯化的费用高、酶产量低，贮藏和处理过程中酶活容易损失，贮存期短、运输费用高等缺点，导致这些酶的应用受到限制；而耐高温琼胶酶由于具有良好的高温稳定性，寿命一般长于中温酶，而且制备和使用过程中不需要冷却设备，可以显著降低成本，因此，在工业上具有更广泛的应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种β-琼胶酶及重组表达菌株，所提供的β-琼胶酶的重组菌株能够高效的表达，表达出的β-琼胶酶具有耐高温的特性，从而弥补现有技术的不足。

本发明的一个方面提供一种β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

用于编码本发明β-琼胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明的另一个方面提供一种用于表达上述β-琼胶酶的重组表达载体。

本发明的β-琼胶酶用于降解琼胶制备新琼寡糖。

本发明另一方面提供用于重组表达上述β-琼胶酶的重组菌株，为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21(DE3)/Pet24a(＋)/YM01-3，已于2013年3月1日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.7268。

本发明的重组菌株能搞高效的表达β-琼胶酶，表达的β-琼胶酶具有耐高温的特性，能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1：本发明的β-琼胶酶的耐高温效果检测（显示降解圈），其中左边样品未煮过，右边样品沸水煮过5min；

图2：本发明的β-琼胶酶的应用效果。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1：β-琼胶酶基因YM01-3的分离

通过对嗜琼胶卵链菌YM01进行全基因组测序得到15个琼胶酶基因及其基因序列，包括13个β-琼胶酶基因和2个α-琼胶酶基因，YM01-3是其中的一个β-琼胶酶基因。利用生物学软件Primer5.0设计上游引物（5′- CCGGAATTCATGTATGCAGCAGACTGGGAT-3′）和下游引物（5′-CCGCTCGAGTTGGAACTTCCATTGCTGG-3′）以基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR反应组成如下（25μl反应体系）：ddH₂O 10.5μl、上游和下游引物各0.5μl，DNA模板1μl、2×MasterMix 12.5μl。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，72℃终延伸10min，共30个循环。反应结束后，将PCR产物回收得到β-琼胶酶基因YM01-3，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其翻译的酶的氨基酸序列为SEQID NO:2。多个测序结果也获得了相同的结果。

实施例2：大肠杆菌克隆载体PUCm-T—YM01-3的构建

 将β-琼胶酶基因YM01-3与载体PUCm-T的连接，采用DNA LigationKit 连接，连接体系（10μl）如下：SolutionⅠ5μl，DNA片段4μl，PUCm-T载体1μl。16℃连接16h所得到的连接液即可获得大肠杆菌克隆载体PUCm-T—YM01-3，用于转化大肠杆菌JM109。

实施例3：大肠杆菌重组株JM109—PUCm-T—YM01-3的构建

加入200μl解冻的感受态E.coli JM109和10μl实施例2得到的连接液至2ml Eppendorf 管中，冰浴30min，42℃90s，冰浴2min，加入LB培养基800μl，37℃振荡培养1小时。菌液与4μl IPTG及40μl X-gal 混合后涂布于含有100μg/ml 氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-14h。挑取白色菌落做PCR及双酶切检测，酶切体系（20μl）如下：ddH₂O 8μl，PUCm-T—YM01-3质粒DNA 8μl，EcoRⅠ1μl，XholⅠ1μl，10×H Buffer 2μl，琼脂糖凝胶电泳中出现1260bp特异带者为阳性转化克隆，即含有PUCm-T—YM01-3的大肠杆菌JM109—PUCm-T—YM01-3。将1ml阳性克隆菌液送测，以M13测序通用引物测定外源插入序列YM01-3核苷酸序列。

实施例4：大肠杆菌表达载体pET24a(+)—YM01-3的构建

克隆载体PUCm-T—YM01-3和表达载体pET24a(+)分别用EcoRⅠ和XholⅠ双酶切，酶切体系（20μl）如下：

反应体系1：ddH₂O 8μl，PUCm-T—YM01-3质粒DNA 8μl，EcoRⅠ1μl，XholⅠ1μl， 10×H Buffer 2μl

反应体系2：ddH₂O 8μl，pET24a(+)质粒DNA 8μl，EcoRⅠ1μl，XholⅠ1μl，10×H Buffer 2μl

37℃酶切2小时，电泳后分别回收两个目的片段1260bp和5.3Kb，二者分别与β-琼胶酶YM01基因全长片段与表达载体PET24a(+)片段大小相同，用DNA Ligation Kit 连接，连接体系（10μl）如下：SolutionⅠ5μl，DNA片段1.5μl，pET24a(+)载体1.1μl，ddH₂O 2.4μl。16℃连接16小时即可获得大肠杆菌表达载体pET24a(+)—YM01-3，用于转化大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例5:大肠杆菌重组株BL21(DE3)—pET24a(+)—YM01-3的构建

加入200μl解冻的感受态E.coli JM109和10μl实施例4得到的连接液至2ml Eppendorf 管中，冰浴30min，42℃90s，冰浴2min，加入LB培养基800μl，37℃振荡培养1小时。菌液涂布于含有100μg/ml 卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-14h。挑取白色菌落做双酶切检测，酶切体系（10μl）如下：ddH₂O 4μl，pET24a(+)—YM01-3质粒DNA4μl，EcoRⅠ0.5μl，XholⅠ0.5μl，10×H Buffer 1μl。琼脂糖凝胶电泳中出现1260bp特异带者为阳性转化克隆，即含有pET24a(+)—YM01-3的大肠杆菌重组株BL21(DE3)—pET24a(+)—YM01-3。

重组表达结果表明，本实施例构建的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21(DE3)/Pet24a(＋)/YM01-3菌株能够高效的重组表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的β-琼胶酶。该菌株已于2013年3月1日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.7268。

实施例6：重组β-琼胶酶的制备

将实施例5制备的大肠杆菌重组株BL21(DE3)—pET24a(+)—YM01-3单克隆于含有浓度为100μg/ml 卡那霉素的LB的液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按1%接种量接种至200ml含有100μg/ml 卡那霉素的LB的液体培养基中，37℃150rpm振荡培养至OD₆₀₀ 为0.4-0.5，加入终浓度为0.1mMIPTG，16℃诱导表达10-12h。诱导菌液4℃12000rpm离心10min，收集菌体，菌体用10ml1×Ni柱结合缓冲液（20mM Tris-HCl ，PH=8.0；10 mM 咪唑；0.5 mM NaCl）重悬并进行超声波破碎，破碎后4℃12000rpm离心10min，收集上清液，破碎沉淀用2ml结合缓冲液冲洗，离心收集上清，将两次上清液混合。上清液上至用平衡好的Ni柱，用10倍体积1×Ni柱洗涤缓冲液（20mM Tris-HCl ，PH=8.0；20mM 咪唑；0.5 mM NaCl）洗脱，然后依次用不同浓度（50 mM，100 mM，150 mM，200 mM，250mM）咪唑的洗涤缓冲液洗涤亲和柱，最后用浓度为500mM咪唑的洗脱液洗涤亲和柱，收集洗脱液。洗脱液于透析液（20mM Tris-HCl ，PH=8.0；0.85（g/v）NaCl，10%甘油（v/v））中透析24h后SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的条带的洗脱液即可得到重组β-琼胶酶，其氨基酸序列见。用Bradford法测定目的蛋白的浓度，分装后将蛋白冻于-20℃保存以备用。

实施例7：重组β-琼胶酶活性检测及其酶学性质

将同样大小的圆滤纸片放在2%的琼脂糖平板上，分别取10微升未处理的纯化的实施例6制备的重组酶和沸水中煮5min的纯化的重组酶滴在滤纸片上，37℃放置3h，然后用卢戈氏碘液染色，结果可在棕色背景上看到两个明显的透明圈（见附图1），说明纯化的重组酶有活性且煮5min后仍有活性。

用DNS试剂法测得此琼胶酶的酶学性质如下：

1、最适温度为60℃

2、温度稳定性：0℃-100℃下放置1h，其中0℃-50℃能保持90%的活性，60℃下还能保持30%的活性。

3、最适PH为6.0

4、PH稳定性：PH=4 ~PH=11缓冲液中放置12h，其中PH=4-9能保持87%的活性。

5、不同离子对酶活的影响：重金属离子如Fe³⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺对酶活有明显的抑制作用，其他金属离子如Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺以及β-巯基乙醇，尿素对酶活影响不大

6、酶比活：在底物浓度为0.25%琼脂糖，PH=6，60℃下测得酶比活为174.4U/mg

7、酶促动力学参数：Km=3.5mg/ml；Vmax=1111.1U/mg

实施例8：表达产物用于制备新琼寡糖

制备新琼寡糖时，将琼脂糖溶于20mM Tris-HCl缓冲液（PH=8.0）中配成浓度为0.25%的溶液，按重组酶体积：反应体系体积=1-2:1000加入实施例6中所得的重组β-琼胶酶，混合均匀后，50℃温浴24h，反应不同时间（5min、10min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h），于-20℃终止反应，12000rpm离心10min，上清即作为薄层层析的样品。

薄层层析板使用前置于 110℃烘箱中干燥 1h。在层析板上距离底部1cm 处用铅笔划出底线，将样品 10μl 点于底线上，用风筒吹干，置于自制层析缸中展层。展开剂配方为正丁醇：冰乙酸：水=2:1:1（体积比）。待前沿线到达离层析板顶端 1cm 处时停止展层，烘箱中干燥。最后往层析板喷洒显色剂（2%二苯胺丙酮溶液5ml，2%苯胺丙酮溶液5ml，三氯乙酸5g），105℃烘箱中显色。显色结果显示了降解产物随时间的变化（见图2）。

根据以上结果，进行降解产物--新琼寡糖聚合度的分析，具体方法如下：同一块薄层层析板上点一个样品，展层结束后，遮住层析板的四分之三面积，只往剩下的四分之一上喷洒上述显色剂进行显色。显色后对照显色部分的条带，将未显色部位的对应条带刮下，加入一定体积的去离子水浸泡，12000rpm离心10min，取上清冻干后即作为做质谱的样品。质谱分析表明降解过程能产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖。

Claims (2)

1.一种重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)/Pet24a(+)/YM01-3，所述的菌株用于重组表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的β-琼胶酶，其保藏编号为CGMCC NO.7268。

2.权利要求1所述的重组菌株在降解琼胶制备新琼四糖和新琼六糖中的应用。