CN103194435B

CN103194435B - 一种β-琼胶酶及其应用

Info

Publication number: CN103194435B
Application number: CN201310122384.XA
Authority: CN
Inventors: 史晓翀; 张晓华; 董素洁; 崔方元
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2033-04-09
Also published as: CN103194435A

Abstract

本发明涉及一种β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明的β-琼胶酶具有耐高温的特性，能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖，具有很好的工业应用前景。

Description

一种β-琼胶酶及其应用

技术领域

本发明属于基因筛选应用技术领域，具体涉及一种β-琼胶酶及其应用，即一种来源于嗜琼胶卵链菌（Catenivulum agarivorans gen.nov. sp. nov.）YM01的β-琼胶酶基因YM01-3及其应用。

背景技术

在自然环境中，琼胶酶的分布较广，很多微生物和一些海洋软体动物都能产生琼胶酶。现阶段，绝大多数被分离研究的琼胶酶都是来自微生物，而海洋细菌又是产琼胶酶最多的类群。琼胶降解菌在海洋生态系统中分布广泛，在海洋植物、动物、海水及海洋沉积物中均有分布。根据氨基酸序列的相似性，琼胶酶被归属为糖苷水解酶家族(Glycoside hydrolase family)中的GH- l6，GH- 50和GH- 86。根据琼胶酶降解琼脂糖作用方式不同，可以把琼胶酶分为两类：α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶裂解琼脂糖的α-1, 3糖苷键，生成以β- D- 半乳糖为非还原性末端和以3, 6- 内醚- α- L- 半乳糖为还原性末端的的琼寡糖系列；β- 琼胶酶裂解琼脂糖的β- 1, 4糖苷键，生成以β- D- 半乳糖为还原性末端和以3, 6- 内醚- α-L- 半乳糖为还原性末端的新琼寡糖系列。已有证据表明，这些琼胶寡糖尤其是新琼寡糖具有很多的生理和生物活性。例如新琼寡糖对黑色素瘤细胞具有保湿和美白效果，还具有抑制微生物生长，刺激巨噬细胞活性的作用；琼胶寡糖在体内体外都具有清除ROS(Reactive Oxygen Species，活性氧簇)造成的氧化损伤的作用，因此可以应用在化妆品和保健品领域。综上所述，可以看出琼寡糖在功能食品、药物、化妆品等领域都有非常广泛的应用前景。

目前常用的琼寡糖生产方法主要有化学法和酶解法两种。传统的化学制备方法反应条件比较剧烈，专一性差，很难得到单一大小的寡糖，而且水解产物容易破坏，不利于产物的分析和回收，这些都限制了琼寡糖的使用。而琼胶酶酶解法由于高度专一高效，反应条件温和，易于控制，产物不易被破坏，因此有利于特定寡糖的大量制备和回收，必将成为琼寡糖生产的主要方法。

虽然琼胶酶制备寡糖具有很多优势，但目前在工业上并没有得到广泛应用。这主要是因为目前发现和研究较多的是中温琼胶酶。由于提取纯化的费用高、酶产量低，贮藏和处理过程中酶活容易损失，贮存期短、运输费用高等缺点，导致这些酶的应用受到限制；而耐高温琼胶酶由于具有良好的高温稳定性，寿命一般长于中温酶，而且制备和使用过程中不需要冷却设备，可以显著降低成本，因此，在工业上具有更广泛的应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种β-琼胶酶基因及其应用，所提供的β-琼胶酶具有耐高温的特性，从而弥补现有技术的不足。

本发明的一个方面提供一种β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

用于编码本发明β-琼胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明的另一个方面提供一种用于表达上述β-琼胶酶的重组表达载体。

本发明的β-琼胶酶用于降解琼胶制备新琼寡糖。

本发明的β-琼胶酶具有耐高温的特性，能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1：本发明的β-琼胶酶的耐高温效果检测（显示降解圈），其中左边样品未煮过，右边样品沸水煮过5min；

图2：本发明的β-琼胶酶的应用效果。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1：β-琼胶酶基因YM01-3的分离

通过对嗜琼胶卵链菌YM01进行全基因组测序得到15个琼胶酶基因及其基因序列，包括13个β-琼胶酶基因和2个α-琼胶酶基因，YM01-3是其中的一个β-琼胶酶基因。利用生物学软件Primer5.0设计上游引物（5′- CCGGAATTCATGTATGCAGCAGACTGGGAT-3′）和下游引物（5′-CCGCTCGAGTTGGAACTTCCATTGCTGG-3′）以基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR反应组成如下（25μl反应体系）：ddH₂O 10.5μl、上游和下游引物各0.5μl，DNA模板1μl、2×MasterMix 12.5μl。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，72℃终延伸10min，共30个循环。反应结束后，将PCR产物回收得到β-琼胶酶基因YM01-3，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其翻译的酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。多个测序结果也获得了相同的结果。

实施例2：大肠杆菌克隆载体PUCm-T—YM01-3的构建

将β-琼胶酶基因YM01-3与载体PUCm-T的连接，采用DNA LigationKit连接，连接体系（10μl）如下：SolutionⅠ5μl，DNA片段4μl，PUCm-T载体1μl。16℃连接16h所得到的连接液即可获得大肠杆菌克隆载体PUCm-T—YM01-3，用于转化大肠杆菌JM109。

实施例3：大肠杆菌重组株JM109—PUCm-T—YM01-3的构建

加入200μl解冻的感受态E.coli JM109和10μl实施例2得到的连接液至2ml Eppendorf 管中，冰浴30min，42℃90s，冰浴2min，加入LB培养基800μl，37℃振荡培养1小时。菌液与4μl IPTG及40μl X-gal 混合后涂布于含有100μg/ml 氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-14h。挑取白色菌落做PCR及双酶切检测，酶切体系（20μl）如下：ddH₂O 8μl，PUCm-T—YM01-3质粒DNA 8μl，EcoRⅠ1μl，XholⅠ1μl，10×H Buffer 2μl，琼脂糖凝胶电泳中出现1260bp特异带者为阳性转化克隆，即含有PUCm-T—YM01-3的大肠杆菌JM109—PUCm-T—YM01-3。将1ml阳性克隆菌液送测，以M13测序通用引物测定外源插入序列YM01-3核苷酸序列。

实施例4：大肠杆菌表达载体pET24a(+)—YM01-3的构建

克隆载体PUCm-T—YM01-3和表达载体pET24a(+)分别用EcoRⅠ和XholⅠ双酶切，酶切体系（20μl）如下：

反应体系1：ddH₂O 8μl，PUCm-T—YM01-3质粒DNA 8μl，EcoRⅠ1μl，XholⅠ1μl， 10×H Buffer 2μl

反应体系2：ddH₂O 8μl，pET24a(+)质粒DNA 8μl，EcoRⅠ1μl，XholⅠ1μl，10×H Buffer 2μl37℃酶切2小时，电泳后分别回收两个目的片段1260bp和5.3Kb，二者分别与β-琼胶酶YM01基因全长片段与表达载体PET24a(+)片段大小相同，用DNA Ligation Kit 连接，连接体系（10μl）如下：SolutionⅠ5μl，DNA片段1.5μl，pET24a(+)载体1.1μl，ddH₂O 2.4μl。16℃连接16小时即可获得大肠杆菌表达载体pET24a(+)—YM01-3，用于转化大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例5:大肠杆菌重组株BL21(DE3)—pET24a(+)—YM01-3的构建

加入200μl解冻的感受态E.coli JM109和10μl实施例4得到的连接液至2ml Eppendorf 管中，冰浴30min，42℃90s，冰浴2min，加入LB培养基800μl，37℃振荡培养1小时。菌液涂布于含有100μg/ml 卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-14h。挑取白色菌落做双酶切检测，酶切体系（10μl）如下：ddH₂O 4μl，pET24a(+)—YM01-3质粒DNA4μl，EcoRⅠ0.5μl，XholⅠ0.5μl，10×H Buffer 1μl。琼脂糖凝胶电泳中出现1260bp特异带者为阳性转化克隆，即含有pET24a(+)—YM01-3的大肠杆菌重组株BL21(DE3)—pET24a(+)—YM01-3。

实施例6：重组β-琼胶酶的制备

挑取大肠杆菌重组株BL21(DE3)—pET24a(+)—YM01-3单克隆于含有浓度为100μg/ml 卡那霉素的LB的液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按1%接种量接种至200ml含有100μg/ml 卡那霉素的LB的液体培养基中，37℃150rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.5，加入终浓度为0.1mMIPTG，16℃诱导表达10-12h。诱导菌液4℃12000rpm离心10min，收集菌体，菌体用10ml1×Ni柱结合缓冲液（20mM Tris-HCl ，PH=8.0；10 mM 咪唑；0.5 mM NaCl）重悬并进行超声波破碎，破碎后4℃12000rpm离心10min，收集上清液，破碎沉淀用2ml结合缓冲液冲洗，离心收集上清，将两次上清液混合。上清液上至用平衡好的Ni柱，用10倍体积1×Ni柱洗涤缓冲液（20mM Tris-HCl ，PH=8.0；20 mM 咪唑；0.5 mM NaCl）洗脱，然后依次用不同浓度（50 mM，100 mM，150 mM，200 mM，250mM）咪唑的洗涤缓冲液洗涤亲和柱，最后用浓度为500mM咪唑的洗脱液洗涤亲和柱，收集洗脱液。洗脱液于透析液（20mM Tris-HCl ，PH=8.0；0.85（g/v）NaCl，10%甘油（v/v））中透析24h后SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的条带的洗脱液即可得到重组β-琼胶酶，其氨基酸序列见。用Bradford法测定目的蛋白的浓度，分装后将蛋白冻于-20℃保存以备用。

实施例7：重组β-琼胶酶活性检测及其酶学性质

将同样大小的圆滤纸片放在2%的琼脂糖平板上，分别取10微升未处理的纯化的重组酶和沸水中煮5min的纯化的重组酶滴在滤纸片上，37℃放置3h，然后用卢戈氏碘液染色，结果可在棕色背景上看到两个明显的透明圈（见附图1），说明纯化的重组酶有活性且煮5min后仍有活性。

用DNS试剂法测得此琼胶酶的酶学性质如下：

1、最适温度为60℃

2、温度稳定性：0℃-100℃下放置1h，其中0℃-50℃能保持90%的活性，60℃下还能保持30%的活性。

3、最适PH为6.0

4、PH稳定性：PH=4 ~PH=11缓冲液中放置12h，其中PH=4-9能保持87%的活性。

5、不同离子对酶活的影响：重金属离子如Fe³⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺对酶活有明显的抑制作用，其他金属离子如Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺以及β-巯基乙醇，尿素对酶活影响不大

6、酶比活：在底物浓度为0.25%琼脂糖，PH=6，60℃下测得酶比活为174.4U/mg

7、酶促动力学参数：Km=3.5mg/ml ；Vmax=1111.1U/mg

实施例8：表达产物用于制备新琼寡糖

制备新琼寡糖时，将琼脂糖溶于20mM Tris-HCl缓冲液（PH=8.0）中配成浓度为0.25%的溶液，按重组酶体积：反应体系体积=1-2:1000加入实施例6中所得的重组β-琼胶酶，混合均匀后，50℃温浴24h，反应不同时间（5min、10min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h），于-20℃终止反应，12000rpm离心10min，上清即作为薄层层析的样品。

薄层层析板使用前置于 110℃烘箱中干燥 1h。在层析板上距离底部1cm 处用铅笔划出底线，将样品 10μl 点于底线上，用风筒吹干，置于自制层析缸中展层。展开剂配方为正丁醇：冰乙酸：水=2:1:1（体积比）。待前沿线到达离层析板顶端 1cm 处时停止展层，烘箱中干燥。最后往层析板喷洒显色剂（2%二苯胺丙酮溶液5ml，2%苯胺丙酮溶液5ml，三氯乙酸5g），105℃烘箱中显色。显色结果显示了降解产物随时间的变化（见图2）。

根据以上结果，进行降解产物--新琼寡糖聚合度的分析，具体方法如下：同一块薄层层析板上点一个样品，展层结束后，遮住层析板的四分之三面积，只往剩下的四分之一上喷洒上述显色剂进行显色。显色后对照显色部分的条带，将未显色部位的对应条带刮下，加入一定体积的去离子水浸泡，12000rpm离心10min，取上清冻干后即作为做质谱的样品。质谱分析表明降解过程能产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖。

Claims

1.一种β-琼胶酶，其特征在于，所述的β-琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种用于编码权利要求1所述的β-琼胶酶的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种用于表达权利要求1所述的β-琼胶酶的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体插入有权利要求2所述的基因。

4.权利要求1所述的β-琼胶酶在降解琼胶制备新琼寡糖中的应用。