TWI611023B - 鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑定方法、用於該方法之引子對及套組 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑定方法、用於該方法之引子對及套組，其係使用新穎微衛星標幟引子對組。具體而言，該微衛星標幟引子對組所篩選出的微衛星標幟具有高度多態性、高品種分辨性、高個體鑑別率及高親子排除率，適合用於遺傳性鑑定與個別鑑別。
Description
本發明係關於一種鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別的方法，特別係一種使用微衛星標幟引子對組(microsatellite marker primer set)用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別的方法。
台灣菜鴨是先民自華南所引進，主要分有白色菜鴨、褐色菜鴨、北京鴨及番鴨等。其中，白色菜鴨自民國55年開始，在長期育種分離後，體型與各種性狀已固定，由農林廳歸為新品種並正式命名為宜蘭白鴨-台畜一號。而褐色菜鴨經畜產試驗所不同育種分化後，已登記有新命名品系為褐色菜鴨畜試一號、褐色菜鴨畜試二號及褐色菜鴨畜試三號，其中褐色菜鴨一號主要係培育作為蛋鴨，其產蛋多、蛋大且重及蛋殼堅固，為本國主要蛋鴨。
在鴨的育種工作中，若鴨的品系不一，將使其後代品質不一；反之，若能以純品系的鴨進行育種，則其後代性狀穩定；因此，有必要發展合適的方法以進行鴨隻個體傳分析或族群遺傳結構分析，提升鴨育種的技術。
目前，臺灣經濟動物的基因檢測，多著重在對特定功能性基因的檢測，鴨隻(包括蛋鴨及種肉鴨)的基因檢測亦是如此，且尚無合適的鴨隻微衛星標幟商業套組，可用於進行鴨隻繁殖場之個體遺傳分析或族群遺傳結構分析。因此，本發明欲提供一種能夠檢測鴨隻微衛星基因座的基因型判定的技術，藉由個體的微衛星基因座的基因型檢測結果，可用於鴨隻的親子鑑別、品種鑑別、系譜資料分析及遺傳性狀相關性分析等選種之分子標記，且本發明提供一個鴨隻微衛星基因座的基因型檢測套組。
是以，本發明之目的為一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之方法，包括：(i)提供一待測鴨隻樣本，並萃取該樣本之基因體DNA(gDNA)；(ii)檢測該鴨隻樣本之gDNA中之至少10個微衛星標幟，其中該微衛星標幟係選自由下列基因座所組成之群組：TYD-002、TYD-003、TYD-005、TYD-006、TYD-012、TYD-014、TYD-015、TYD-021、TYD-024、TYD-025、TYD-029、TYD-035、TYD-037、TYD038、TYD-042、T3P1003、T1P2013、T1P4017、T1P2034、T3P1027、T3P2090、T3P4021、T1P1075、T3P2080、T3P2065；以及(iii)依照步驟(ii)之檢測結果分析該鴨隻之品系以評估其遺傳性與個體鑑別。
進一步地，該微衛星標幟係由下列引子對所檢測：(1)針對基因座TYD-002之第一引子對SEQ ID NO：1及EQ ID NO：2；(2)針對基因座TYD-003第二引子對SEQ ID NO：3及EQ ID NO：4；(3)針對基因座TYD-005之第三引子對SEQ ID NO：5及EQ ID NO：6；(4)針對基因座TYD-006之第四引子對SEQ ID NO：7及EQ ID NO：8；(5)針對基因座TYD-012之第五引子對SEQ ID NO：9及EQ ID NO：10；
(6)針對基因座TYD-014之第六引子對SEQ ID NO：11及EQ ID NO：12；(7)針對基因座TYD-015之第七引子對SEQ ID NO：13及EQ ID NO：14；(8)針對基因座TYD-021之第八引子對SEQ ID NO：15及EQ ID NO：16；(9)針對基因座TYD-024之第九引子對SEQ ID NO：17及EQ ID NO：18；(10)針對基因座TYD-025之第十引子對SEQ ID NO：19及EQ ID NO：20；(11)針對基因座TYD-029之第十一引子對SEQ ID NO：21及EQ ID NO：22；(12)針對基因座TYD-035之第十二引子對SEQ ID NO：23及EQ ID NO：24；(13)針對基因座TYD-037之第十三引子對SEQ ID NO：25及EQ ID NO：26；(14)針對基因座TYD-038之第十四引子對SEQ ID NO：27及EQ ID NO：28；(15)針對基因座TYD-042之第十五引子對SEQ ID NO：29及EQ ID NO：30；(16)針對基因座T3P1003之第十六引子對SEQ ID NO：31及EQ ID NO：32；(17)針對基因座T1P2013之第十七引子對SEQ ID NO：33及EQ ID NO：34；(18)針對基因座T1P4017之第十八引子對SEQ ID NO：35及EQ ID NO：36；(19)針對基因座T1P2034之第十九引子對SEQ ID NO：37及EQ ID NO：38；(20)針對基因座T3P1027之第二十引子對SEQ ID NO：39及EQ ID NO：40；(21)針對基因座T2P2090之第二十一引子對SEQ ID NO：41及EQ ID NO：42；(22)針對基因座T3P4021之第二十二引子對SEQ ID NO：43及EQ ID NO：44；(23)針對基因座T1P1075之第二十三引子對SEQ ID NO：45及EQ ID NO：46；(24)針對基因座T3P2080之第二十四引子對SEQ ID NO：47及EQ ID NO：48；(25)針對基因座T3P2065之第二十五引子對SEQ ID NO：49及EQ ID NO：50。
進一步地，該至少10個微衛星標幟係TYD-002、TYD-005、TYD-006、TYD-012、TYD-014、TYD-015、TYD-024、TYD-025、TYD-029
及T1P2013。
本發明另一目的為提供一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之微衛星標幟引子對，該引子對係由上述所定義之第一引子對至第二十五引子對。
本發明另一目的為提供一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之微衛星標幟引子對，該引子對係如上述所所定義之第一引子、第三引子對、第四引子對、第五引子對、第六引子對、第七引子對、第九引子對、第十引子對、第十一引子對及第十七引子對。
進一步地，該引子對包括一微衛星標幟正向引子以及一微衛星標幟反向引子，且其中該微衛星標幟正向引子或該微衛星標幟反向引子之5’端係連接一螢光標幟。
本發明另一目的在於提供一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之套組，其包括至少10個選自由上述所定義之第一引子對至第二十五引子對。
進一步地，該套組之該引子對係如上所定義之第一引子、第三引子對、第四引子對、第五引子對、第六引子對、第七引子對、第九引子對、第十引子對、第十一引子對及第十七引子對。
進一步地，該套組之該引子對包括一微衛星標幟正向引子以及一微衛星標幟反向引子，且其中該微衛星標幟正向引子或該微衛星標幟反向引子之5’端係連接一螢光標幟。
進一步地，該套組包括一萃取樣品gDNA之試劑。
圖1為各鴨隻族群利用本發明之25個鴨隻微衛星標幟所得鄰位連接法(NJ)之親緣關係樹(GBT：褐色菜鴨；BI：褐色菜鴨畜試一號；BII：褐色菜鴨畜試二號；BIII：褐色菜鴨畜試三號；GWT：白色菜鴨；WI：宜蘭白鴨台畜一號；P：北京鴨；H：雜交鴨(GWT×BI))。
圖2為各鴨隻個體利用本發明之25個鴨隻微衛星標幟所繪製之結構群集分析圖(K=2~9)；K值為結構分析中預設之群集數，不同顏色表示不同群集，縱軸為個體的基因來源於該群集之比例，且每個圖條表示一個個體；1：褐色菜鴨；2：褐色菜鴨畜試一號；3：褐色菜鴨畜試二號；4：褐色菜鴨畜試三號；5：白色菜鴨；6：宜蘭白鴨台畜一號；7：北京鴨；8：雜交鴨(GWT×BI)。
圖3為各鴨隻個體利用本發明之25個鴨隻微衛星標幟所得鄰位連接法(NJ)之親緣關係樹(GBT：褐色菜鴨；BI：褐色菜鴨畜試一號；BII：褐色菜鴨畜試二號；BIII：褐色菜鴨畜試三號；GWT：白色菜鴨；WI：宜蘭白鴨台畜一號；P：北京鴨；H：雜交鴨(GWT×BI))。
圖4各品系鴨隻之個體鑑別率(P(ID))對新微衛星標幟數目之折線圖。
圖5為各品系鴨隻之近親個體鑑別率(P(ID)sib)對鴨隻衛星標幟數目之折線圖。
圖6為各鴨隻個體利用7個鴨隻微衛星標幟(TYD002、TYD005、TYD014、TYD024、TYD025、TYD029、T1P2013)所得鄰位連接法(NJ)之親緣關係樹。
圖7為各鴨隻個體利用8個鴨隻微衛星標幟(TYD002、
TYD005、TYD006、TYD014、TYD024、TYD025、TYD029、T1P2013)所得鄰位連接法(NJ)之親緣關係樹。
圖8為各鴨隻個體利用9個鴨隻微衛星標幟(TYD002、TYD005、TYD006、TYD012、TYD014、TYD024、TYD025、TYD029、T1P2013)所得鄰位連接法(NJ)之親緣關係樹。
圖9為各鴨隻個體利用10個鴨隻微衛星標幟(TYD002、TYD005、TYD006、TYD012、TYD014、TYD015、TYD024、TYD025、TYD029、T1P2013)所得鄰位連接法(NJ)之親緣關係樹
除非另有定義，所有本文所用之技術性及科學性術語，對於屬於本發明領域之具有通常知識者而言，皆具有與其所習知者相同意義。
除非文中有清楚指明者，於本文中所使用之單數形式「一」、「一種」、及「該」之涵義均為包括「至少一種」的複數形式。因此，例如，當提及「一成分」時，包括複數個該等成分及對該領域具有通常知識者所知之同等物。
台灣鴨隻之個體遺傳分析或族群遺傳結構分析的微衛星標幟尚未完全闡明，在本發明中，鴨隻微衛星標幟被用於分析鴨隻之基因型多態性，包含但不限於褐色菜鴨(Brown Tsaiya)、褐色菜鴨畜試一號(Brown Tsaiya LRI 1)、褐色菜鴨畜試二號(Brown Tsaiya LRI 2)、褐色菜鴨畜試三號(Brown Tsaiya LRI 3)、白色菜鴨(White Tsaiya)、宜蘭白鴨台畜一號(Ilan White Tsaiya TLRI No.1)、北京鴨(Pekin Duck)及雜交鴨(Hybrid)之遺傳變異性、遺傳距離與分群、個體鑑別率等遺傳特性；其中，雜交鴨為褐色菜鴨及褐色
菜鴨畜試一號之雜交鴨。
本發明之具體實施例中，該等微衛星標幟遺傳變異性分析結果之平均期望異質度、觀測異質度與多態性訊息含量，皆屬於高多態性範圍，顯示該等微衛星標幟於分析鴨隻族群具高度適用性。而在本發明另一具體實施例中，該等微衛星標幟遺傳距離分析結果明確將鴨品種進行分群，顯示該等微衛星標幟於鴨品種差異檢測具有良好分辨性。此外，本發明所提供之微衛星標幟亦具有高個體鑑別率。
是以，本發明提供一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之方法，包括：(i)提供一待測鴨隻樣本，並萃取該樣本之基因體DNA(gDNA)；(ii)檢測該鴨隻之gDNA中之至少10個微衛星標幟，其中該微衛星標幟係選自由下列基因座所組成之群組：TYD-002、TYD-003、TYD-005、TYD-006、TYD-012、TYD-014、TYD-015、TYD-021、TYD-024、TYD-025、TYD-029、TYD-035、TYD-037、TYD038、TYD-042、T3P1003、T1P2013、T1P4017、T1P2034、T3P1027、T3P2090、T3P4021、T1P1075、T3P2080、T3P2065；以及(iii)依照步驟(ii)之檢測結果分析該鴨隻之品系以評估其遺傳性與個體鑑別。
其中，該微衛星標幟係由下列引子對所檢測：(1)針對基因座TYD-002之第一引子對SEQ ID NO：1及EQ ID NO：2；(2)針對基因座TYD-003第二引子對SEQ ID NO：3及EQ ID NO：4；(3)針對基因座TYD-005之第三引子對SEQ ID NO：5及EQ ID NO：6；(4)針對基因座TYD-006之第四引子對SEQ ID NO：7及EQ ID NO：8；(5)針對基因座TYD-012之第五引子對SEQ ID NO：9及EQ ID NO：10；
(6)針對基因座TYD-014之第六引子對SEQ ID NO：11及EQ ID NO：12；(7)針對基因座TYD-015之第七引子對SEQ ID NO：13及EQ ID NO：14；(8)針對基因座TYD-021之第八引子對SEQ ID NO：15及EQ ID NO：16；(9)針對基因座TYD-024之第九引子對SEQ ID NO：17及EQ ID NO：18；(10)針對基因座TYD-025之第十引子對SEQ ID NO：19及EQ ID NO：20；(11)針對基因座TYD-029之第十一引子對SEQ ID NO：21及EQ ID NO：22；(12)針對基因座TYD-035之第十二引子對SEQ ID NO：23及EQ ID NO：24；(13)針對基因座TYD-037之第十三引子對SEQ ID NO：25及EQ ID NO：26；(14)針對基因座TYD-038之第十四引子對SEQ ID NO：27及EQ ID NO：28；(15)針對基因座TYD-042之第十五引子對SEQ ID NO：29及EQ ID NO：30；(16)針對基因座T3P1003之第十六引子對SEQ ID NO：31及EQ ID NO：32；(17)針對基因座T1P2013之第十七引子對SEQ ID NO：33及EQ ID NO：34；(18)針對基因座T1P4017之第十八引子對SEQ ID NO：35及EQ ID NO：36；(19)針對基因座TIP2034之第十九引子對SEQ ID NO：37及EQ ID NO：38；(20)針對基因座T3P1027之第二十引子對SEQ ID NO：39及EQ ID NO：40；(21)針對基因座T2P2090之第二十一引子對SEQ ID NO：41及EQ ID NO：42；(22)針對基因座T3P4021之第二十二引子對SEQ ID NO：43及EQ ID NO：44；(23)針對基因座T1P1075之第二十三引子對SEQ ID NO：45及EQ ID NO：46；(24)針對基因座T3P2080之第二十四引子對SEQ ID NO：47及EQ ID NO：48；(25)針對基因座T3P2065之第二十五引子對SEQ ID NO：49及EQ ID NO：50。
其中，該至少10個微衛星標幟較佳係TYD-002、TYD-005、TYD-006、TYD-012、TYD-014、TYD-015、TYD-024、TYD-025、TYD-029
及T1P2013。
另外，本發明提供一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之微衛星標幟引子對，該引子對係如上述所定義之第一引子對至第二十五引子對。
另外，本發明提供一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之微衛星標幟引子對，該引子對係如上述所所定義之第一引子、第三引子對、第四引子對、第五引子對、第六引子對、第七引子對、第九引子對、第十引子對、第十一引子對及第十七引子對。其中，較佳之該引子對包括一微衛星標幟正向引子以及一微衛星標幟反向引子，且其中較佳之該微衛星標幟正向引子或該微衛星標幟反向引子之5’端係連接一螢光標幟。
另外，本發明提供一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之套組，其包括至少10個選自由上述所定義之第一引子對至第二十五引子對。其中，較佳之該套組之該引子對係如上所定義之第一引子、第三引子對、第四引子對、第五引子對、第六引子對、第七引子對、第九引子對、第十引子對、第十一引子對及第十七引子對；又，較佳之該套組之該引子對包括一微衛星標幟正向引子以及一微衛星標幟反向引子，且其中較佳之該微衛星標幟正向引子或該微衛星標幟反向引子之5’端係連接一螢光標幟；較佳之該套組包括一萃取樣品gDNA之試劑。
本發明之上述螢光標幟為通用可標示於之基因體5’端的螢光標幟，例如6-羧基螢光(6-FAM或FAM)、四氯螢光(TET)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基螢光(JOE)、亞基馬黃螢光(Yakima Yellow)、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯螢光(HEX)、花青螢光3(Cy3)、花青螢光3(Cy5)、或5-
羧基四甲基羅丹明螢光(TAMRA)等，其中以FAM為佳。
在下文中，將利用具體實施例特別描寫本發明所揭示之內容。然而，本發明所揭示之內容不限制於下列範例。
[實施例1]微衛星標幟之篩選及其引子對設計
I.菜鴨隻微衛星標幟之篩選及其引子對設計
使用探針篩選基因體(gDNA)內之微衛星標幟，將不同標定生物素之重複序列探針(biotinylated-oligos)之種類組合加以調整，以選擇性雜合法進行鴨隻微衛星標幟之開發。
1.試驗動物
挑選自畜試所宜蘭分所菜鴨品種，取2鴨隻(1公鴨；1母鴨)個體採集其血液樣本，並用基因體分離試劑套組(GenePure Tech.Co.,LTD.,Taiwan)依照套組使用說明，自全血抽取基因體(gDNA)；所得之基因體(gDNA)濃度則利用超微量分光光度計(NanoDrop 2000c,Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)檢測，確認吸光值OD260/280值均達到1.8至2.0後，保存於-20℃冰箱備用。
2.鴨隻微衛星標幟篩選及其引子對設計
步驟1. 限制性內切酶切割
取該2鴨隻(1公鴨；1母鴨)的基因體(gDNA)各10μL(100ng/μL)，利用限制性內切酶Rsa I(catalog #R0167S,NEB,USA)及Xmn I(catalog #R0194S,NEB,USA)進行基因體(gDNA)切割，反應總體積為25μL，包含1X NEB接合酶緩衝液、1X牛血清白蛋白(BSA)、50mM氯化鈉、及各1μL Xmn I與Rsa I，於37℃水浴槽反應1小時。取2μL酶
切產物，以1%瓊脂醣凝膠電泳確認反應是否成功，判斷依據為產物是否出現在介於300至1000bp之間最適DNA片段長度帶狀區域。
步驟2. 連接DNA片段與連接子
取等體積正向引子(SuperSNX24 Forward,5’-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3’)及反向引子(SuperSNX24+4P Reverse,5’-pGATTCTGCTAGCTAG GCCTTAAACAAAA-3’)引子，加入氯化鈉溶液至最終濃度為100mM；將此混合物預先加熱至95℃後慢慢冷卻至室溫以形成雙股之連接子(ds SuperSNX linkers)；利用該連接子(ds SuperSNX linkers)製備接合反應溶液，包含7μM連接子(ds SuperSNX linkers)、1X連接酶緩衝液、800單位T4 DNA連接酶(catalog #M0202S,NEB,USA)，反應總體積為10μLm
將該10μL的接合反應溶液加入先前全部的酶切產物(約22μL)，置於16℃反應12小時以上，並以單股之正向引子(SuperSNX24 Forward)做為引子進行PCR反應，確認接合反應是否成功。PCR反應總體積為25μL，包括1X PCR緩衝液、25μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、0.5μM正向引子(SuperSNX24 Forward)、2.0mM氯化鎂溶液、0.15mM dNTP、1U Taq DNA聚合酶(TAKARA Co.,Japan)及接合酶反應產物2μL。利用熱循環儀(Veriti® 96-well Thermal Cycler,ABI PRISM,USA)進行PCR反應，反應溫度條件為95℃變性2分鐘；95℃變性20秒、60℃鏈合20秒、72℃延伸1.5分鐘，重覆循環20次，最後冷卻至15℃。利用熱循環儀(Veriti® 96-well Thermal Cycler,ABI PRISM,USA)進行PCR反應後，取2μL PCR產物以1%瓊脂醣膠體進行電泳，檢測PCR產物是否
成功增幅。
步驟3. 利用磁珠豐富化微衛星DNA片段
豐富化乃利用標定生物素之重複序列探針(biotinylated-oligos)與基因庫中DNA片段進行雜合；再利用卵白素(streptavidin)與生物素間具有親和性之特性，以帶有卵白素的磁珠分離出與標定生物素之重複序列探針雜合之DNA片段，便可利用磁力分離出含重複序列的片段，建立富含2至4核苷酸重複序列DNA片段之基因庫(library)；本發明研究根據格倫及施耐德文獻(Glenn and Schable,2005)所推薦之重複序列種類設計探針，依據相似鏈合溫度調整成三種組合，內各含四種探針，分別為
探針組合一：(TG)12、(ACT)12、(ACTG)6、(ACAG)6。
探針組合二：(AG)12、(ACAT)8、(AACT)8、(AAGT)8。
探針組合三：(AAG)8、(AAAC)6、(AATC)6、(AGAT)6。
豐富化之步驟依序為探針雜合、清洗精緻磁珠及含重複序列之基因體(gDNA)片段純化，各步驟過程如下：
(1)探針雜合
取10μL帶有接合子之基因體(gDNA)片段，加入反應溶液使總體積變成50μL，反應溶液中包括25μL 2X Hyb溶液(12X SSC,0.2% SDS)及上述任一探針組合，每種探針1μM。使用熱循環儀(Veriti® 96-well Thermal Cycler,ABI PRISM,USA)進行雜合反應，先加熱至95℃ 5分鐘，隨後自70℃起每5秒調降0.2℃直至50℃，再於50℃停留反應10分鐘，接著每5秒調降0.5℃直至40℃，最後冷卻至15℃。
(2)清洗精緻磁珠
在進行雜合反應的同時，準備清洗並精製磁珠(Dynabeads® M-280 Streptavidin,catalog #11205D,InvitrogenTM,CA,USA)。取50μL磁珠加入250μL TE緩衝液(10mM Tris pH8,2mM EDTA)混勻，以磁鐵隔著微量離心管吸附磁珠並去除上清液，以此法再以一次250μL TE緩衝液、兩次250μL 1X Hyb溶液(6X SSC,0.1% SDS)清洗精製磁珠，最後以150μL 1X Hyb溶液重新懸浮磁珠。
(3)含重複序列之基因體(gDNA)片段
將全部雜合產物加入精製後之磁珠，以振盪器慢速於室溫中混勻45分鐘，令磁珠與帶有探針之基因體(gDNA)片段結合。之後，利用磁鐵吸附磁珠，再去除上清液。再度加入2次400μL清洗溶液(2X SSC,0.1% SDS)與兩次400μL清洗溶液1(1X SSC,0.1% SDS)清洗磁珠，將未與探針進行雜合的基引體(gDNA)片段及多餘的探針移除。最後加入200μL TLE緩衝液(0.01M Tris-HCl,0.2mM EDTA)，以95℃加熱5分鐘後，盡快取出上清液，並於上清液中加入22μL NaOAc/EDTA溶液(1.5M NaOAc,0.25M EDTA)，再加入444μL 95%乙醇後上下倒置混勻，置於-20℃ 15分鐘，再以16,000 xg離心10分鐘後去除上清液，以500μL 70%乙醇清洗產物兩次，待雜合產物完全風乾後，以25μL去離子水回溶，再以上述確認接合反應之PCR條件進行PCR，增幅含有重複序列之基因體(gDNA)片段以進行後續試驗。
步驟4. 連接豐富化DNA片段與質體
為選殖含重複序列之DNA片段，將經豐富化及增幅的
DNA片段嵌入載體系統(pGEM®-T Easy Vector system,Promega,USA)，產物大小估算為300至1,000bp，以3：1之DNA片段：載體系統比例進行接合反應，反應總體積為10μL，包含載體系統(pGEM-T Easy Vector)50ng、3單位T4 DNA連接酶、1X快速連接酶緩衝溶液及DNA片段，於4℃反應12小時以上。
步驟5. 質體DNA之轉形
取出100μL勝任細胞(HIT Competent CellsTM-DH5α,Real Biotech Co.,Taiwan)加入10μL重組載體，於冰上反應1至10分鐘。將菌液均分成4等份，每等份皆混合8μL IPTG與40μL 2% X-Gal塗於含氨芐青黴素(100μg/mL)之LB固體培養基，於37℃培養16至18小時後，使用滅菌牙籤挑取白色菌落，並以上述確認接合反應之PCR條件，進行PCR確認片段是否成功插入載體。
步驟6. 陽性菌落選殖
配製反應總體積為20μL反應溶液，包括1X PCR緩衝液、25μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、0.5μM正向引子(SuperSNX24 Forward)、2.0mM x氯化鎂溶液、0.15mM dNTP及1U Taq DNA聚合酶(TAKARA Co.,Japan)。使用滅菌牙籤沾取白色菌落，在該反應溶液中攪動即可加入菌落之載體DNA。根據PCR之結果挑出只含單一片段之陽性菌落共230個，轉培養至裝有3mL含氨芣青黴素(100μg/mL)之LB培養液的15mL離心管，再於37℃搖晃培養16至18小時。
步驟7. 質體定序與引子設計
以鹼處理法(alkaline lysis)抽取質體DNA(Green and
Sambrook,2012)，並利用T7引子以分析儀(ABI 3730XL DNA Analyzer,ABI PRISM,USA)進行核酸定序。篩選序列片段中二重複序列重複數8次以上或四重複序列重複數6次以上者，做為可能存在多態性之最低標準。利用Primer 3 Plus程式(Rozen and Skaletsky,2000)針對其重複單位兩側之序列進行引子設計，並在正向引子之5’端加上CAG核苷酸標幟(CAGtag,5’-CAGTCGGGCGTATCA-3’)，再利用已標定FAM螢光標幟(ABI PRISM,USA)於CAG核苷酸標幟，做為所有引子對的第二正向引子，以避免所有引子皆有螢光標定的情況。
II.北京鴨隻微衛星標幟之篩選及其引子對設計
從已建立之北京鴨全基因體序列草圖搜尋微衛星標幟，設計一組有3鹼基或4鹼基之15重複序列。
進入美國國家生技資訊中心網站(NCBI)比對收尋相似序列。搜尋出具有多個重複序列之片段後，利用Primer 3 Plus程式(Rozen and Skaletsky,2000)針對其重複單位兩側之序列進行引子設計，並在正向引子之5’端加上CAG核苷酸標幟(CAGtag,5’-CAGTCGGGCGTATCA-3’)，再利用已標定FAM螢光標幟(ABI PRISM,USA)於CAG核苷酸標幟，做為所有引子對的第二正向引子，以避免所有引子皆有螢光標定的情況。以褐色菜鴨畜試一號DNA樣本微模板，測試其最適PCR條件。
[實施例2]微衛星標幟之PCR增幅及各品種族群多態性檢測
1.試驗動物
為測試上述之微衛星標幟是否可成功應用於鴨隻族群分
析，首先挑選共30隻菜鴨進行PCR檢測，挑選具多態性之微衛星標幟。隨後，將畜試所宜蘭分所八品系鴨隻，使用挑選出的多態性之微衛星標幟進行基因型分析，總共655隻鴨，其中43隻褐色菜鴨、152隻褐色菜鴨畜試一號、95隻褐色菜鴨畜試二號、71隻褐色菜鴨畜試三號、88隻白色菜鴨、72隻宜蘭白鴨台畜一號、39隻北京鴨及95隻雜交鴨(表1)。所有鴨隻血液樣本，皆依前述萃取及純化基因體(gDNA)之方法，進行基因體(gDNA)萃取。
2.PCR增幅與各品種族群多態性檢測
將30隻菜鴨挑選具多態性之微衛星標幟，利用PCR檢測是否可成功增幅，反應總體積為20μL，其中包含30ng基因體(gDNA)、0.04μM正向引子、0.2μM反向引子、0.16μM CAG核苷酸標幟(CAGtag)、1X PCR緩衝液、0.2mM dNTP及0.025U Taq DNA聚合酶。反應條件為95℃變性4分鐘；95℃變性30秒、60℃鏈合30秒、72℃延伸40秒，循環35次；最後再以72℃延伸7分鐘。PCR反應後，
取2μL PCR產物，以1%瓊脂醣膠體進行電泳，確認PCR是否成功增幅。樣品盤的配製使用高密度甲氨(Hi-Di formamide)及600Liz分子量標準品(GeneScan Size Standard GeneScan-600 LIZ,Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)以120：1比例混合，取10μL加入96孔樣品盤，再加入稀釋之PCR產物1μL，隨後再將成功增幅產物，送到國家基因體醫學研究中心，以DNA分析儀(ABI 3730 DNA Analyzer,ABI PRISM,USA)進行毛細管電泳分析，測定其增幅產物的片段大小，所得片段大小結果以波峰掃描器(Peak scanner 1.0,ABI PRISM,USA)軟體進行基因型分析。方法A共篩出37個具淺力之微衛星片段，經多態性測試後，選出10個有多態性之鴨隻微衛星標幟；方法B共選出45個具淺力之微衛星片段，經多態性測試後，有15個具多態性之鴨隻微衛星標幟。共25個鴨隻微衛星標幟，其重複序列之基序與PCR引子之序列如表2。
3.遺傳分析
基因型分析方法包含鴨隻微衛星標幟適用性之評估、遺傳距離之估算與親緣關係樹之繪製及個體鑑別率與親子排除率，過程如下所述：
(1)鴨隻微衛星標幟適用性之評估
試驗所得結果利用微軟工具套組(Microsoft Toolkit,Park,2001)計算交替基因數(Na)、交替基因頻率、期望異質度(HE)、觀測異質度(Ho)及多態性訊息含量(PIC)；另用軟體GENEPOP 4.0(Rousset,2007)分析賴特固定指數(Wright’s F-statistics)及哈溫平衡檢定(HWE test)；另以POPGENE 1.32(Yeh et al.,1999)分析有效交替基因數(Ne)。
(2)遺傳距離之估算與親緣關係樹之繪製
使用微衛星分析(Microsatellite Analyser,Dieringer and Schlötterer,2003)計算個體間遺傳距離(Saitou and Nei,1987)，並且利用PHYLIP套裝軟體(Felsenstein,2002)以鄰位連接法(NJ)和繪製親緣關係樹。以STRUCTURE2.3.1(Pritchard et al.,2000)進行模擬，利用Markov chain Monte carlo(Guo and Thompson,1992)分析分群數機率，依計算50,000次後的50,000次模擬可能分群(K=2~7)，每個K值重複20次再繪製群集分析圖；並計算△K值(Evanno et al.,2005)與L(K)值(Rosenberg et al.,2001)。
(3)個體鑑別率與親子排除率
利用前述於文獻檢討之族群遺傳多態性，所列出之數學公式計算個體鑑別率(P(ID))(Paetkau and Strobeck,1994)與近親個體鑑別率(P(ID)sib)(Evett and Weir,1998)，並依據結合不同數目之微衛星基因座所產生之綜合個體鑑別率繪製折線圖。
4.多態性檢測結果
本發明使用之25個所開發之鴨隻微衛星標幟，針對畜試所宜蘭分所八個鴨族群：褐色菜鴨、褐色菜鴨畜試一號、褐色菜鴨畜試二號、褐色菜鴨畜試三號、白色菜鴨、宜蘭白鴨台畜一號、北京鴨、雜交鴨，共655隻鴨隻樣本，所進行基因型分析結果如下：
(1)微衛星標幟及遺傳性
全體鴨族群之遺傳性檢測如表3所示，交替基因數(Na)範圍在2(T1P2034及T3P1027)至37(TYD029)之間，平均值為10.60。有效交替基因數(Ne)之範圍在1.450(T3P1003)至16.86(TYD029)之間，平均值為4.911。觀測異質度(Ho)範圍在0.215(TYD035)至0.789(TYD024)之間，平均值為0.472。期望異質度(HE)範圍在0.312(T3P1003)至0.941(TYD029)之間，平均值為0.682。多態性訊息含量(PIC)範圍在0.289(T3P1003)至0.938(TYD029)之間，平均值為0.637。
關於族群遺傳結構分析方面，賴特固定指數(FIS)之範圍在-0.085(TYD021)至0.661(TYD002)之間，平均值為0.143，此FIS平均值為正值可知整體鴨隻族群中之次族群(subpopulation)，亦即品系內雜合子比例少於預期。哈溫平衡檢定(HWE test)中，共有13個基因座顯著地偏離哈溫平衡(P<0.01)，分別為基因座TYD002、TYD003、TYD005、TYD006、TYD012、TYD014、TYD015、TYD025、TYD029、TYD035、T1P2013、T3P4021及T3P2080。
(2)各品系鴨隻族群內遺傳變異性之評估結果
各品系鴨隻族群遺傳變異性分別列於表4至11。其中，有效交替基因數(Ne)最高是出現在北京鴨的TYD24基因座，如表10所示，該有
效交替基因數(Ne)為11.020。然而，有4個基因座在各品系鴨隻族群內之間並不具多態性(即變異性檢測結果為1)，分別是表8的白色菜鴨的T3P2065、表9的宜蘭白鴨台畜一號的T3P2065與T1P2034、及表10的北京鴨的T1P2034。
八個品系鴨隻之各項遺傳變異性之平均值如表12所示，各項數值以北京鴨較高，宜蘭白鴨台畜一號之數值較低，雜交鴨則接近其母系褐色菜鴨畜試一號，高於父系白色菜鴨。各品種的交替基因數(Na)平均值範圍在3.60至5.75之間，有效交替基因數(Ne)平均值範圍在2.128到3.504之間(表12)。期望異質度(HE)及多態性訊息含量(PIC)之最高平均值皆出現在褐色菜鴨畜試三號，分別為0.641與0.580，顯示具有較高遺傳變異性。觀測異質度(Ho)及多態性訊息含量(PIC)之最低平均值則是在宜蘭白鴨台畜一號，分別為0.359及0.408，因此遺傳變異性程度較低。賴特固定指數(FIS)之平均值則係宜蘭白鴨台畜一號最高為0.202，而雜交鴨最低為0.105。八個品系鴨隻皆為正值，屬於雜合子偏少的情形，推測可能是近親的結果。褐色菜鴨偏離哈溫平衡的基因座最少，只有5個，而褐色菜鴨畜試一號與北京鴨偏離哈溫平衡的基因座最多，有9個。
(3)遺傳距離與分群
由25個微衛星基因座所檢測之所有鴨隻各基因座的交替基因頻率結果，進一步計算族群之間的遺傳距離與族群間之Fst值，如表13所示，宜蘭白鴨台畜一號族群與褐色菜鴨畜試二號族群有最大的遺傳距離(Fst為0.490)，而褐色菜鴨畜試一號族群與雜交鴨族群有最小的遺傳距離(Fst為0.104)，與族群分化指標Fst值結果相似，分別對應到最大值(0.325)與最小值(0.086)。
進一步，以遺傳距離利用鄰位連接法(NJ)繪製鴨隻族群親緣關係樹中，如圖1所示，同源的褐色菜鴨族群(褐色菜鴨(GBT)、褐色菜
鴨畜試一號(BI)、褐色菜鴨畜試二號(BII)、褐色菜鴨畜試三號(BIII))與白色菜鴨族群(白色菜鴨(GWT)、宜蘭白鴨台畜一號(WI))各形成一個集團，而雜交鴨(H)與北京鴨(P)族群則介於之間，而分化的百分比除了褐色菜鴨畜試一號(BI)與褐色菜鴨(GBT)、褐色菜鴨畜試三號(BIII)之間為49，其餘皆大於50；由此顯示，本發明之25個微衛星標幟基因型的訊息可清楚地建構各族群間的關係，且大致與預期相符。
另外，使用STRUCTURE軟體分析族群結構。如圖2所示，在各個假設可能分群的K值(K=2~9)中，當K=2時，主要分成白色鴨族群與褐色鴨族群，雜交鴨此時可明顯由兩成分構成；當K=3時，白色菜鴨族群被分離，當K=4時，褐色菜鴨畜試二號被分開；當K=6時，只有褐色菜鴨與褐色菜鴨畜試三號被定為一族群，顯示此二族群關係密切。K=7時，正好被分為個別的七族群，而雜交鴨由其親代兩族群組成。當K=8時，雜交鴨被定成一族群，剛好是試驗的八族群；當K=9時，只有雜交鴨再被細分。
又，將25鴨隻微衛星標幟之基因型利用Nei(1972)之估算式計算出個體間的遺傳距離，再利用鄰位連接法(NJ)繪製鴨隻個體之親緣關係樹，如圖3所示，八個族群的個體可完全被分開成八個群聚，將來在檢驗其他族群時，族群群聚的落點即可判定此族群的個體是否有經過雜交。
(4)鴨隻個體鑑別率之估算
個體鑑別之分析分成各別八個鴨隻品系，分別計算25個鴨
隻微衛星標幟之個體鑑別率(P(ID))、近親個體鑑別率(P(ID)sib)及綜合全部25個鴨隻微衛星標幟之P(ID)與P(ID)sib，其試驗結果如表14及表15所示。
如表14所示，褐色菜鴨之P(ID)範圍在0.043(TYD005)至0.640(T3P4021)，綜合P(ID)為1.09×10-19。褐色菜鴨畜試一號之P(ID)範圍在0.035(TYD025)至0.744(T3P1003)，綜合P(ID)為4.51×10-20。褐色菜鴨畜試二號之P(ID)範圍則在0.039(TYD029)至0.781(T3P2080)，綜合P(ID)為3.05×10-15。褐色菜鴨畜試三號之P(ID)範圍則在0.027(TYD029)至0.554(T3P2090)，綜合P(ID)為8.36×10-21。白色菜鴨之P(ID)範圍則在0.078(TYD029)至1.0(T3P2065)，綜合P(ID)為4.44×10-15。宜蘭白鴨台畜一號之P(ID)範圍則在0.126(TYD006)至1.0(T3P2065及T1P2034)，綜合P(ID)為4.89×10-13。北京鴨之P(ID)範圍則在0.015(TYD024)至1.0(T1P2034)，綜合P(ID)為3.43×10-19。雜交鴨之P(ID)範圍則在0.018(TYD029)至0.634(T3P1003)，綜合P(ID)為7.52×10-20。
另，欲探討之族群個體有近親關係，如全同胞(full-sib)或半同胞(half-sib)，則在計算個體鑑別率時，需修正以P(ID)sib進行評估較為適當，因此本發明亦同時計算當假設所檢測族群具有近親關係時之P(ID)sib。如表15所示，褐色菜鴨之P(ID)sib範圍在0.340(TYD005)至0.803(T3P4021)，且綜合P(ID)sib為1.73×10-8。褐色菜鴨畜試一號之P(IDsib)範圍在0.328(TYD025)至0.864(T3P1003)，綜合P(ID)sib為1.77×10-8。褐色菜鴨畜試二號之P(ID)sib範圍則在0.334(TYD029)至0.886(T3P2080)，綜合P(ID)sib為5.43×10-7。褐色菜鴨畜試三號之P(ID)sib範圍則在0.318(TYD029)至0.753(T3P2090)，綜合P(ID)sib為6.72×10-9。白色菜鴨之P(ID)sib範圍則在0.385(TYD029)至1.0(T3P2065)，綜合P(ID)sib為4.61×10-7。宜蘭白鴨台畜一號之P(ID)sib範圍則在0.418(TYD006)至1.0(T3P2065及T1P2034)，綜合P(ID)sib
為2.24×10-6。北京鴨之P(ID)sib範圍則在0.299(TYD024)至1.0(T1P2034)，綜合P(ID)sib為3.98×10-8。雜交鴨之P(ID)sib範圍則在0.304(TYD029)至0.799(T3P1003)，綜合P(ID)為2.77×10-8。
此外，各品種鴨隻及全體族群中，不同數目鴨隻微衛星標幟之綜合P(ID)與綜合P(ID)sib也分別被計算並繪製成折線圖，如圖4及5所示，從不同
數目鴨隻微衛星標幟之綜合P(ID)與綜合P(ID)sib所繪製成的折線圖中，也可推估在確知鴨隻族群數量的情況下，若恰好涵蓋所有族群個體數，其所需鴨隻微衛星標幟之最低數量。
(5)有效分群與個體鑑別之最低微衛星標幟數
由以上結果知，新篩選之25個微衛星標幟成功地在個體親緣關係樹中對台灣主要菜鴨品系分群，並在個體鑑別率上遠遠超過台灣每年在養鴨數2.26×106或屠宰數1.54×106(行政院農委會農業統計年報，2015)。因此理論上少於此25個微衛星標幟即可獲得效果，為了找出最少的有效微衛星標幟數，分別挑出7個、8個、9個、10個微衛星標幟，計算出個體親緣關係樹，分別如圖6、7、8及9所示。
如圖6及7所示，使用7或8個微衛星標幟時，只有褐色菜鴨畜試二號、白色菜鴨與宜蘭白鴨台畜一號三個族群可完全獨立分出來。如圖8所示，使用9個微衛星標幟時，每個族群均可初步分出，然而幾個族群間交界處有少數個體互相交錯。但到10個微衛星標幟，如圖9所示，其分群即可達到良好的效果。因此，本發明之鴨隻微衛星標幟對台灣主要鴨群做種原鑑別最低有效數為10個，其基因座分別為TYD002、TYD005、TYD006、TYD012、TYD014、TYD015、TYD024、TYD025、TYD029、T1P2013。以此10個微衛星標幟為基礎，每加1個微衛星標幟做檢測，則越準確。
另外，將上述之10個微衛星標幟(TYD002、TYD005、TYD006、TYD012、TYD014、TYD015、TYD024、TYD025、TYD029、T1P2013)分別計算個體鑑別率P(ID))、近親個體鑑別率(P(ID)sib)及綜合全部10個微衛星標幟之P(ID)與P(ID)sib，結果如表16及表17所示。如表16所示，褐色菜鴨於此10個
鴨隻微衛星基因座之綜P(ID)為3.36×10-12。褐色菜鴨畜試一號之綜P(ID)為3.11×10-12，褐色菜鴨畜試二號之綜P(ID)為4.72×10-9，褐色菜鴨畜試三號之綜合P(ID)為1.61×10-12，白色菜鴨之綜合P(ID)為1.97×10-9，宜蘭白鴨台畜一號之綜合P(ID)為1.11×10-7，北京鴨之綜合P(ID)為4.79×10-12，雜交鴨之綜合P(ID)為4.07×10-13。每鴨隻品種綜和個體鑑別率均超過上述台灣2015年在養蛋鴨數2.26×106或屠宰數1.54×106，因此，此10個鴨隻微衛星標幟可應用於台灣鴨隻之個體鑑別，每加1個微衛星標幟做檢測，則效果越好。
是以，由遺傳分析結果顯示，本發明之鴨隻微衛星標幟於分析台灣鴨隻族群時，可有效鑑別出台灣不同品系之鴨隻族群，且不同於以往僅針對特定功能之鴨隻遺傳性鑑定，適合用於遺傳性鑑定與個別鑑別。
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<223> 引子
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<212> DNA
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<223> 引子
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<223> 引子
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<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> 引子_結合
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<212> DNA
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<223> 引子
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<400> 47
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<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
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<221> 引子_結合
<222> (1)..(20)
<400> 49
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<220>
<221> 引子_結合
<222> (1)..(22)
<400> 50
Claims (10)
- 一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之方法，包括：(i)提供一待測鴨隻樣本，並萃取該鴨隻樣本之基因體DNA(gDNA)；(ii)檢測該鴨隻樣本之gDNA中之至少10個微衛星標幟，其中該微衛星標幟係選自由下列基因座所組成之群組：TYD-002、TYD-003、TYD-005、TYD-006、TYD-012、TYD-014、TYD-015、TYD-021、TYD-024、TYD-025、TYD-029、TYD-035、TYD-037、TYD038、TYD-042、T3P1003、T1P2013、T1P4017、T1P2034、T3P1027、T3P2090、T3P4021、T1P1075、T3P2080、T3P2065；以及(iii)依照步驟(ii)之檢測結果分析該鴨隻之品系以評估其遺傳性與個體鑑別。
- 如請求項1之方法，其中該微衛星標幟係由下列引子對所檢測：(1)針對基因座TYD-002之第一引子對SEQ ID NO：1及EQ ID NO：2；(2)針對基因座TYD-003第二引子對SEQ ID NO：3及EQ ID NO：4；(3)針對基因座TYD-005之第三引子對SEQ ID NO：5及EQ ID NO：6(4)針對基因座TYD-006之第四引子對SEQ ID NO：7及EQ ID NO：8；(5)針對基因座TYD-012之第五引子對SEQ ID NO：9及EQ ID NO：10；(6)針對基因座TYD-014之第六引子對SEQ ID NO：11及EQ ID NO：12；(7)針對基因座TYD-015之第七引子對SEQ ID NO：13及EQ ID NO：14；(8)針對基因座TYD-021之第八引子對SEQ ID NO：15及EQ ID NO：16；(9)針對基因座TYD-024之第九引子對SEQ ID NO：17及EQ ID NO：18；(10)針對基因座TYD-025之第十引子對SEQ ID NO：19及EQ ID NO：20； (11)針對基因座TYD-029之第十一引子對SEQ ID NO：21及EQ ID NO：22；(12)針對基因座TYD-035之第十二引子對SEQ ID NO：23及EQ ID NO：24；(13)針對基因座TYD-037之第十三引子對SEQ ID NO：25及EQ ID NO：26；(14)針對基因座TYD-038之第十四引子對SEQ ID NO：27及EQ ID NO：28；(15)針對基因座TYD-042之第十五引子對SEQ ID NO：29及EQ ID NO：30；(16)針對基因座T3P1003之第十六引子對SEQ ID NO：31及EQ ID NO：32；(17)針對基因座T1P2013之第十七引子對SEQ ID NO：33及EQ ID NO：34；(18)針對基因座T1P4017之第十八引子對SEQ ID NO：35及EQ ID NO：36；(19)針對基因座T1P2034之第十九引子對SEQ ID NO：37及EQ ID NO：38；(20)針對基因座T3P1027之第二十引子對SEQ ID NO：39及EQ ID NO：40；(21)針對基因座T2P2090之第二十一引子對SEQ ID NO：41及EQ ID NO：42； (22)針對基因座T3P4021之第二十二引子對SEQ ID NO：43及EQ ID NO：44；(23)針對基因座T1P1075之第二十三引子對SEQ ID NO：45及EQ ID NO：46；(24)針對基因座T3P2080之第二十四引子對SEQ ID NO：47及EQ ID NO：48；(25)針對基因座T3P2065之第二十五引子對SEQ ID NO：49及EQ ID NO：50。
- 如請求項1或2之方法，其中該至少10個微衛星標幟係TYD-002、TYD-005、TYD-006、TYD-012、TYD-014、TYD-015、TYD-024、TYD-025、TYD-029及T1P2013。
- 一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之微衛星標幟引子對，該引子對係請求項2所定義之第一引子對至第二十五引子對。
- 一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之微衛星標幟引子對，該引子對係請求項2所定義之第一引子、第三引子對、第四引子對、第五引子對、第六引子對、第七引子對、第九引子對、第十引子對、第十一引子對及第十七引子對。
- 如請求項4或5之微衛星標幟引子對，其中該引子對包括一微衛星標幟正向引子以及一微衛星標幟反向引子，且其中該微衛星標幟正向引子或該微衛星標幟反向引子之5’端係連接一螢光標幟。
- 一種用於鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑別之套組，其包括至少10個選自由請求項2所定義之第一引子對至第二十五引子對。
- 如請求項7之套組，其中該引子對係請求項2所定義之第一引子、第三引子對、第四引子對、第五引子對、第六引子對、第七引子對、第九引子對、第十引子對、第十一引子對及第十七引子對。
- 如請求項7之套組，其中該引子對包括一微衛星標幟正向引子以及一微衛星標幟反向引子，且其中該微衛星標幟正向引子或該微衛星標幟反向引子之5’端係連接一螢光標幟。
- 如請求項7至9任一項之套組，其包括一萃取樣品gDNA之試劑。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| TW106124584A TWI611023B (zh) | 2017-07-21 | 2017-07-21 | 鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑定方法、用於該方法之引子對及套組 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| TW106124584A TWI611023B (zh) | 2017-07-21 | 2017-07-21 | 鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑定方法、用於該方法之引子對及套組 |
Publications (2)
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|---|---|
| TWI611023B true TWI611023B (zh) | 2018-01-11 |
| TW201908490A TW201908490A (zh) | 2019-03-01 |
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ID=61728576
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| TW106124584A TWI611023B (zh) | 2017-07-21 | 2017-07-21 | 鴨隻遺傳性鑑定與個體鑑定方法、用於該方法之引子對及套組 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI611023B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921749A (zh) * | 2010-07-23 | 2010-12-22 | 李宁 | 与鸭颈长性状连锁的微卫星标记、其检测试剂盒及应用 |
-
2017
- 2017-07-21 TW TW106124584A patent/TWI611023B/zh active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921749A (zh) * | 2010-07-23 | 2010-12-22 | 李宁 | 与鸭颈长性状连锁的微卫星标记、其检测试剂盒及应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 張怡穎等人，微衛星標記應用於白色菜鴨保種族群與宜蘭白鴨臺畜一號遺傳結構之探討，畜產研究49(2)：138-147, 2016 * |
| 張怡穎等人，微衛星標記應用於白色菜鴨保種族群與宜蘭白鴨臺畜一號遺傳結構之探討，畜產研究49(2)：138-147, 2016。 |
| 賴芳裕等人，利用新微衛星標幟分析不同選育群菜鴨與北京鴨之族群遺傳結構，中國畜牧學會會誌44期(增期)2015 * |
| 賴芳裕等人，利用新微衛星標幟分析不同選育群菜鴨與北京鴨之族群遺傳結構，中國畜牧學會會誌44期(增期)2015。 |
| 黄守婷等人，鴨微衛星標記的篩選及其遺傳多樣性分析，基因組學與應用生物學，2014年，第33卷，第5期，第986-991頁 * |
| 黄守婷等人，鴨微衛星標記的篩選及其遺傳多樣性分析，基因組學與應用生物學，2014年，第33卷，第5期，第986-991頁。 |
Also Published As
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|---|---|
| TW201908490A (zh) | 2019-03-01 |
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