CN107760789A - 一种用于牦牛亲子鉴定和个体识别的基因分型检测试剂盒 - Google Patents

一种用于牦牛亲子鉴定和个体识别的基因分型检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于牦牛亲子鉴定和个体识别的STR标记检测系统基因分型的复合PCR扩增系统和检测试剂盒，所述引物带有荧光标记，可以扩增牦牛14个STR标记位点，这些标记多态性高、标记间不连锁、片段大小适当；所述STR检测系统通过所述14对引物的扩增和电泳检测，获得14个STR位点的基因分型结果；根据STR的分型结果和牦牛各STR的基因频率对牦牛进行亲子鉴定和个体识别。本发明的方案通过综合分析STR基因座分型结果能有效的进行牦牛的亲子鉴定和个体识别，进而可提高牦牛育种工作中系谱的准确性，加快育种进程，具有良好的应用前景和经济价值。

Description

一种用于牦牛亲子鉴定和个体识别的基因分型检测试剂盒
技术领域
本发明涉及动物核酸体外检测技术领域，具体涉及用于牦牛亲子鉴定和个体识别的STR标记检测系统基因分型的复合PCR扩增系统和检测试剂盒。
背景技术
系谱信息在牦牛育种中起着重要的作用。错误的系谱会大大降低遗传评定的准确性，影响选种选配的效果，降低群体的遗传进展，给牦牛产业带来巨大经济损失。然而，在实际养殖生产中，系谱记录错误是难免的，它受多种因素影响，如配种记录、产犊记录、系谱录入及整理中的人为错误，尤其在饲养粗放的散养式放牧状态下，犊牛出生后很难确定其父亲，甚至母亲。
短串联重复序列(Short Tandem Repeat,STR)，是广泛存在于生物基因组中的一类具有高度多态性的遗传学标记。由于其具有片段小、易扩增、灵敏性好、准确度高、检测速度快、信息含量大，适宜于微量或降解样品检测，各基因座的扩增条件相似而能够实现复合扩增等特点，将STR复合扩增技术应用于动物的亲子鉴定和个体识别方面具有极大的优越性。
在普通牛上，将STR标记应用于亲子鉴定的报道较多，而尚未见应用STR标记技术对牦牛进行亲子鉴定的报道。关于牦牛STR标记的研究只限于群体结构和进化分析，并且所用的引物都直接取自文献报道中普通牛的引物序列，如徐公瑾(2004年)从FAO指定的30个普通牛的STR标记中选择出26个标记用于天祝白牦牛的聚类分析；李齐发(2004年)利用链亲和素磁珠亲和捕获的方法构建了牦牛基因组STR富集文库，并通过20个重复次数较多的STR标记对牦牛进行了分子进化分析；曾玉峰(2013年)利用15个STR位点标记信息对6个牦牛品种进行了遗传多样性和进化树分析；赵芳芳(2015年)通过对野牦牛部分基因组序列进行STR序列搜索，找到43409个STR位点，并且利用其中的77个STR位点对麦洼牦牛进行群体遗传分化特征分析。
虽然利用部分普通牛的STR标记引物可以对牦牛的相应位点进行扩增，但是毕竟牦牛与普通牛在基因序列上存在一定的差异，直接利用普通牛的引物往往达不到对牦牛STR位点检测的最佳效果。本发明选择多态性较高且不存在连锁关系的36个普通牛的STR位点，在牦牛基因组上找到相应的DNA序列，对文献中引物和牦牛基因组序列进行分析，选择可以直接应用于牦牛STR扩增的引物，其他STR位点则重新设计引物；另外，在牦牛基因组上找到4个新的STR位点，设计合适的引物；对以上40个引物进行合成，以牦牛基因组DNA为模板对所选的40个STR标记位点进行扩增，挑选到21个条带清晰、得率较高、特异性好的引物；对这21个引物进行荧光引物合成，对牦牛基因组DNA混合池进行扩增，挑选荧光信号强、好判型、杂合度高、多态信息含量丰富的14个STR位点。最终，确定普通牛BM2113和ILSTS008位点的引物可直接用于牦牛相应STR的扩增；针对11个STR位点(BM720、CSSM036、CSSME070、HAUT24、HEL6、ILSTS006、INRA037、SPS115、TGLA227、YAK07、YAK08)设计的新引物可用于牦牛STR检测；在牦牛的基因组上找到一个新的STR位点CH28AC，可用于牦牛该位点的检测。
对所设计的引物进行组合和扩增条件摸索。多重PCR的不同引物进行组合主要根据以下一些原则：尽可能避免各引物间的互补结构、发夹结构等一结和二级构象；要求退火温度尽可能接近；考虑不同引物的扩增片段长度和荧光标记颜色；每种引物在选定的退火温度梯度范围内作PCR反应时能得到有效扩增。最终，确定了本发明中的STR扩增引物和检测系统。
发明内容
本发明的目的是针对牦牛亲子鉴定和个体识别中对STR基因座分型的需求，提供用于牦牛亲子鉴定和个体识别的STR标记检测系统基因分型的复合PCR扩增系统和检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种用于牦牛亲子鉴定和个体识别的STR标记检测系统，所述STR标记检测系统中包括有以下14个STR基因座：BM720、BM2113、CH28AC、CSSM036、CSSME070、HAUT24、HEL6、ILSTS006、ILSTS008、INRA037、SPS115、TGLA227、YAK07和YAK08。
本发明的第二个目的是提供了对上述STR标记检测系统上14个STR基因座同时进行基因分型的复合PCR扩增系统，所述14个STR基因座分为五组，其组合方式与相应的PCR扩增引物如下：
第一组的3个基因座为CSSM036、HEL6、CSSME070，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示；CSSM036、HEL6和CSSME070分别采用FAM、HEX和TAMRA荧光素进行标记；
第二组的3个基因座为BM720、YAK07、SPS115，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.7至SEQ ID No.12所示；BM720、YAK07和SPS115分别采用FAM、HEX和TAMRA荧光素进行标记；
第三组的3个基因座为CH28AC、INRA037、HAUT24，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.13至SEQ ID No.18所示；CH28AC、INRA037和HAUT24分别采用FAM、HEX和TAMRA荧光素进行标记；
第四组的3个基因座为ILSTS006、YAK08、TGLA227，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.19至SEQ ID No.24所示；ILSTS006、YAK08和TGLA227分别采用FAM、HEX和TAMRA荧光素进行标记；
第五组的2个基因座为BM2113、ILSTS008，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.25至SEQ ID No.28所示；BM2113和ILSTS008分别采用FAM和HEX荧光素进行标记。
进一步的，上述的复合PCR扩增系统，
第一组STR基因座CSSM036、HEL6、CSSME070的PCR扩增引物组成第一组引物混合液，其各自的浓度依次为5.6μmol/L、7.9μmol/L和9.2μmol/L；
第二组STR基因座BM720、YAK07、SPS115的PCR扩增引物组成第二组引物混合液，其各自的浓度依次为6.3μmol/L、6.8μmol/L和9.1μmol/L；
第三组STR基因座CH28AC、INRA037、HAUT24的PCR扩增引物组成第三组引物混合液，其各自的浓度依次为5.7μmol/L、7.3μmol/L和9.4μmol/L；
第四组STR基因座ILSTS006、YAK08、TGLA227的PCR扩增引物组成第四组引物混合液，其各自的浓度依次为6.2μmol/L、7.5μmol/L和9.7μmol/L；
第五组STR基因座BM2113、ILSTS008的PCR扩增引物组成第五组引物混合液，其各自的浓度依次为5.9μmol/L和7.6μmol/L。
本发明的第三个目的是提供了一种用于分析DNA样品14个STR基因座基因分型的非诊断方法，使用上述的复合PCR扩增系统检测牦牛DNA样本，所述牦牛DNA样本选自牦牛血液、组织样品或精液样品中的一种或多种。
本发明的第四个目的是提供了一种用于对牦牛亲子鉴定和个体识别的STR标记检测系统上14个STR基因座进行基因分型检测的试剂盒，所述14个STR基因座分别为：BM720、BM2113、CH28AC、CSSM036、CSSME070、HAUT24、HEL6、ILSTS006、ILSTS008、INRA037、SPS115、TGLA227、YAK07和YAK08。
进一步的，上述的检测试剂盒，包含有80ng/μL的STR标准品50μL，10×PCR反应缓冲液200μL，如权利要求3所述5组引物混合液各10μL，ddH2O 1000μL×2管；其中，所述引物混合液包括引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.28的组合物；10×PCR反应缓冲液包括Taq DNA聚合酶0.5U/μL，Tris 150mmol/L，MgCl2 25mmol/L，KCl 350mmol/L，dNTP 12mmol/L，Nonidet P40 0.9％(v/v)，pH值为8.6(25℃)。
本发明的第五个目的是提供了一种上述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)提取牦牛基因组DNA，基因组DNA浓度为20-500ng/μL；
2)多重荧光PCR扩增：总反应体系为20μL，反应体系组成如下：
模板DNA0.5μL，10×PCR反应缓冲液2.0μL，引物混合液0.5μL，ddH2O17μL；
3)PCR反应条件如下：
第一组，95℃预变性5分钟，95℃30秒、56.3℃30秒、72℃30秒，共35个循环，72℃保温6分钟；
第二组，95℃预变性5分钟，95℃30秒、55.6℃30秒、72℃30秒，共35个循环，72℃保温6分钟；
第三组，95℃预变性5分钟，95℃30秒、56.5℃30秒、72℃30秒，共35个循环，72℃保温6分钟；
第四组，95℃预变性5分钟，95℃30秒、56.0℃30秒、72℃30秒，共35个循环，72℃保温6分钟；
第五组，95℃预变性5分钟，95℃30秒、55.5℃30秒、72℃30秒，共35个循环，72℃保温6分钟；
4)将得到的每组PCR产物加入样品板，再将样品板装入遗传分析仪进行毛细管电泳；
5)利用GeneMapperTM 4.0软件分析电泳数据，得到实际样品的基因分型数据；
所述方法为非诊断用途。
本发明的技术要点包括以下部分：
1.发明中用于STR位点检测的引物：
本发明针对牦牛牛群特点和基因组特性，通过获得14个常染色体STR基因座(BM720、BM2113、CH28AC、CSSM036、CSSME070、HAUT24、HEL6、ILSTS006、ILSTS008、INRA037、SPS115、TGLA227、YAK07、YAK08)的分型结果，提供了一种用于对牦牛进行亲子鉴定和个体识别的STR标记检测系统，进而为牦牛的育种工作提供有力的技术支撑。
本发明方案中使用的这些基因座是申请人通过对牦牛群体的物种起源和STR基因频率等进行综合分析，针对这些差异进行文献和网络数据库调研，在已有研究的基础上经过生物信息学分析和大量实验，筛选出的在牦牛群体中复合扩增效率好、特异性较高、多态信息丰富的14个常染色体STR引物。扩增引物及其相对应的基因座信息如表1所示。
表1 用于牦牛亲子鉴定和个体识别的14对荧光引物信息
注：“U”代表上游引物，“S”代表下游引物。
2.发明中的STR位点的分组和荧光标记：
为实现本发明的目的，本发明还提供了一种STR基因座复合检测方法，可以准确获得从待检测个体的14个常染色体STR基因座的分型结果，通过该体系能根据分型结果进行牦牛的亲子鉴定和个体识别。所述PCR扩增引物可以为标记有荧光的PCR扩增引物。申请人通过大量反复实验，考虑生产成本、各个引物间互作、扩增效率等方面，对上述基因座采用表2中所述的方式进行分组和荧光标记。
表2 用于牦牛亲子鉴定和个体识别的14对荧光引物的分组情况
在本发明的实施方案中，通过所述遗传分析仪，将实际扩增出的产物长度和颜色与表2中记载的预期的产物长度和颜色进行对比。实际扩增出的产物长度只要与表2记载的扩增长度相等或相近即可，二者可以存在一定的偏差，只要在本领域技术人员可以接受的范围内，或者通过测序确认是所要扩增的片段即可。
3.发明中用于STR检测的试剂盒及使用方法：
本发明通过优化扩增条件和调整反应体系中各组分的浓度，筛选出最佳检测体系组成、扩增条件，提供了用于牦牛亲子鉴定和个体识别的检测试剂盒。所述试剂盒含有用于扩增所述STR标记的PCR荧光引物，以待测牦牛的基因组DNA为模板，利用多重荧光PCR和毛细管电泳技术相结合进行基因型检测，试剂盒组成如下表。
表3 牦牛STR位点鉴定试剂盒组成
注：该试剂盒的试剂量可用于100次20μL体系的STR检测实验，即20头牦牛的STR检测。
由于每个引物的扩增效率和所带荧光标记的不同，他们的扩增产物的荧光信号强度往往不同，为了使各个引物的扩增产物的荧光强度尽量相同，便于共同扩增和基因分型，发明对各引物进行了浓度调节，具体见表4。
表4 各组荧光引物混合物的浓度和退火温度
注：1各位点的上、下游引物浓度相同，并且在各组中成对出现；2退火温度为复合PCR扩增实验中各组效果最佳的温度。
本试剂盒的具体操作过程如下：
(1)按照常规方法进行牦牛血液、组织样品或者精液样品的基因组DNA提取，可以选择商业化的试剂盒和自己配制的实验溶液。
(2)利用试剂盒中各组分扩增所述14个STR标记的特异性目的片段，获得STR基因座的扩增产物。根据提取出的待测DNA样品的数量，将待测DNA样品和试剂盒中的溶液按照表5中的说明进行混合。
表5 牦牛STR位点检测的多重荧光PCR反应体系
组成成份 用量(μL)
模板DNA(建议浓度20-500ng/μL) 0.5
10×PCR反应缓冲液 2.0
引物混合液 0.5
ddH2O 17.0
把混合好的反应液放入PCR仪中，设定好PCR的反应程序，对待测样品进行PCR扩增，PCR反应条件见表6。
表6 牦牛STR位点检测的多重PCR反应条件
(3)荧光标记毛细管电泳技术分析所述标记的基因型。
将上一步的每组PCR产物样品板装入遗传分析仪进行电泳。由于PCR产物根据不同荧光颜色进行了标记，因而通过毛细管电泳即可获得不同STR标记的基因型。在本申请的分型结果中，下面标注有方框的峰为有效峰，方框中数字代表扩增产物的片段长度，峰的高度代表产物的丰度，峰的颜色为荧光经激发后产生的颜色，其中，蓝色的峰代表经FAM染料标记的扩增产物，绿色的峰代表经HEX染料标记的扩增产物，黑色的峰代表经TAMRA染料标记的扩增产物(图1-5)。在不同的分析仪中，荧光染料经激发后产生的光可能与其本身带有的颜色不同，这对本领域技术人员来说是可以理解的。
利用GeneMapperTM 4.0软件，设定分子量标准条带后，根据遗传分析仪所收集电泳荧光信号的颜色和位置，自动计算各标记座位的基因型，得到实际样品的基因分型数据。最后，人为校对电泳结果与基因型是否匹配。
(4)根据分型结果进行个体识别和亲子鉴定。
本发明是根据牦牛个体的基因型以及累积排除概率(Combined exclusionprobabilities)确定待测牦牛亲子关系，即根据待测牦牛个体和候选亲本的基因型是否一致以及计算待测个体与候选亲本的累积排除概率来确定待测个体和候选亲本是否有亲缘关系。其原理及计算过程如下：
亲子鉴定基于孟德尔遗传的分离和自由组合规律。通过基因型的匹配分析，如果符合孟德尔遗传定律，则不能排除具有亲子关系，否则可排除其亲子关系。因此在应用STR基因座进行亲子鉴定时，如果肯定子代的某个标记基因型来自亲生父亲，而候选父亲并不携带此标记基因型，候选父亲与子代违背了孟德尔遗传定律，可以排除子代与候选父亲之间的亲缘关系；如果肯定子代的某个标记基因型来自亲生父亲，而候选父亲也携带此标记基因型，候选父亲与子代符合孟德尔遗传定律，据此不能排除子代与候选父亲之间的亲缘关系，但是可以利用似然函数计算它们之间亲缘关系的相似程度。
计算所检测标记的非父排除概率及累积排除概率。非父排除概率(Probabilityof Paternity Exclusion，PE)是评价遗传标记在亲子鉴定中实用价值大小的一个重要指标；是利用各位点的等位基因频率来计算候选父亲某标记的等位基因不是来自亲生父亲的排除概率。非父排除概率的计算一般分以下三种情况计算：
(1)已知一候选亲本信息，另一亲本信息未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率为：
(2)已知一候选亲本信息，另一亲本信息已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率为：
(3)排除子代与无关的假设父母对是亲子关系的排除概率为：
其中，n代表每个标记的等位基因数，pi代表第i个等位基因的频率。
m个标记的累积排除概率计算公式为：
m代表标记位点的个数，Pj代表第j个位点的排除率。
在上述三种不同情况下，根据以上计算公式分别得出CPE。通过计算每个候选亲本在所有检测位点排除概率，即可知道候选亲本为子代真实亲本的可能性大小，从而可对亲子对之间的亲缘关系做出判断。根据人类亲子鉴定的经验，如果累积排除概率＞0.99，子代所检测的标记基因型与候选父亲完全一致，可确定其为子代的生物学父亲；如果累积排除概率＞0.99，子代所检测的标记基因型与候选父亲存在2个或以上基因型不遵循遗传规律，可排除其为子代的生物学父亲。
个体识别率(Power of discrimination,DP)是指在生物群体中随机抽取两个个体，二者的遗传标记表型不相同的概率。当只使用一个标记位点时，个体识别率的公式表达如下：
在实践中往往需要使用多个遗传标记来提高鉴定的准确性，此时，多个标记的累积个体识别概率计算公式为：
其中，n代表每个遗传标记的基因型数，pi代表第i个基因型的频率。
本发明的有益效果为：本发明针对牦牛群体的特点，筛选出一组适用于检测牦牛亲子关系的STR标记，共包括14个STR标记，这些标记多态性高、标记间不连锁且片段大小间隔适当，易于检测。本发明利用多重荧光PCR和毛细管电泳技术，通过优化实验体系，建立了基于上述14个STR标记准确、高效的基因分型方法。利用此标记组合鉴定牦牛亲子关系和个体识别时，在三种不同情况下的累积排除概率CPE(1)、CPE(2)、CPE(3)分别达到0.998490、0.999693和0.999999，而个体识别率TDP更是达到了1.000000。本发明的STR标记组合可用于牦牛的个体识别和亲权鉴定，进而用于牦牛完整、准确的系谱鉴定，可提高牦牛育种准确性，加快其育种进程，具有良好的应用前景和经济效益。
附图说明
图1显示为本发明第一组STR位点基因分型典型图。
图2显示为本发明第二组STR位点基因分型典型图。
图3显示为本发明第三组STR位点基因分型典型图。
图4显示为本发明第四组STR位点基因分型典型图。
图5显示为本发明第五组STR位点基因分型典型图。
具体实施方式
实施例1：
牦牛亲子关系鉴定STR标记的筛选与确定：
1.STR标记位点的选择与分组
选择267头无亲缘关系的牦牛，提取检测其静脉血DNA。根据文献研究相关报道，选择普通牛和牦牛彼此之间没有连锁关系、多态信息含量较高的36个STR基因座，对文献中报道的引物与牦牛相应位点进行序列分析，对存在错配、引物二聚体、退火温度相差较大等不合适的引物进行重新设计。另外，在牦牛基因组上搜索4个STR位点(CH28AC、CHX2TG、CHX3TA、CHX6AT)(见表7)，针对各个STR位点和其两端的序列，设计引物对相应位点进行扩增、电泳检测。
表7 40对牦牛STR普通引物信息
注：1.“新”代表根据牦牛基因序列重新设计的引物，“原”代表直接使用文献中的引物；2.“退火温度”指能够得到较为理想目的片段的扩增退火温度；3.“引物可用”是指经普通PCR扩增后目的条带清晰、得率高、特异性好的引物。
选择扩增条件清晰、亮度较高、特异性较好的21对引物(BM720、BM2113、BM2943、CH28AC、CHX2TG、CSSM033、CSSM036、CSSME070、HAUT24、HEL6、ILSTS006、ILSTS008、INRA037、INRA063、MM12、RM099、SPS115、TGLA57、TGLA227、YAK07、YAK08)。将这些引物分别加上荧光标签，扩增相应位点，进行毛细电泳检测，将扩增产物进行测序，以确定扩增产物是目的条带。选择具有丰富的等位基因、高度多态性、重复性好、无哑等位基因(Null Allele)的引物作为最终牦牛亲子鉴定的引物。最终确定了14个STR位点的引物可以作为亲子鉴定引物，详细信息见表8。
表8 可用牦牛亲子鉴定的14对STR荧光引物信息
注：1.“新”代表根据牦牛基因序列重新设计的引物，“原”代表直接使用文献中的引物。
为降低STR基因分型的检测成本，根据STR标记引物间的相融性将引物标记不同的荧光基团。为避免同一组中出现非特异性条带干扰，每组中荧光颜色不同。在本实施例中，将14个STR标记分为5组，标记组合及其所带荧光基团见表8。
2.STR标记基因型分型
采用多重荧光PCR结合ABI 3730自动测序仪荧光电泳技术对267头牦牛的14个STR标记进行了基因分型。将14个STR标记分成5组，利用各组引物混合液和最适退火温度进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系及反应条件分别见表2和表3。分组混合的PCR产物经ABI 3730自动测序仪电泳检测后，采用GeneMapper V4.0软件对STR基因型进行判定。
3.STR标记的群体遗传学分析
应用Cervus 3.0.7软件统计14个STR标记遗传多态性参数，包括等位基因数、期望杂合度、估计无效等位基因频率、多态信息含量的统计结果见表9。所选择的14个STR位点等位基因数为4-14个；各位点的观察杂合度在0.449-0.825之间，期望杂合度在0.445-0.842之间，且每个STR标记的观察杂合度和期望杂合度差值不大，在0.001-0.079之间，说明各STR标记的等位基因分布合理，能够准确的反映群体的遗传结构；各位点的多态信息含量在0.372-0.826之间，说明这14个STR标记在牦牛群体中具有较高的使用价值。
表9 14个STR基因座的遗传多态性
4、STR标记组合的排除概率分析
根据各STR基因座的等位基因频率，计算各位点的非亲排除概率和个体排除率。由表10可知，CH28AC位点的排除概率最高，ILSTS006位点的排除概率最低。通过计算它们的排除概率和累积排除概率，由表10可知，这14个STR标记的四种累积排除概率数值分别高达0.998490、0.999693、0.999999和1.000000，说明这14个STR标记组合的亲子鉴定和个体识别的效力极高。
表10 14个STR基因座的排除概率
位点名称 非亲排除概率1 非亲排除概率2 非亲排除概率3 个体排除率
BM720 0.188 0.352 0.531 0.782
BM2113 0.261 0.440 0.637 0.848
CH28AC 0.532 0.698 0.875 0.960
CSSM036 0.285 0.458 0.646 0.860
CSSME070 0.138 0.220 0.331 0.661
HAUT24 0.219 0.376 0.551 0.804
HEL6 0.369 0.550 0.745 0.908
ILSTS006 0.099 0.201 0.315 0.619
ILSTS008 0.152 0.250 0.375 0.693
INRA037 0.373 0.551 0.733 0.910
SPS115 0.450 0.626 0.813 0.937
TGLA227 0.199 0.336 0.493 0.774
YAK07 0.228 0.410 0.613 0.823
YAK08 0.244 0.402 0.568 0.829
合计 0.998490 0.999693 0.999999 1.000000
注：非亲排除概率1：当另一亲本信息未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率；非亲排除概率2：当另一亲本信息已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率；非亲排除概率3：排除子代与无关的假设父母对是亲子关系的排除概率；个体排除率：排除一个体与无关个体亲缘关系的排除概率。
实施例2：
14个STR标记在牦牛三联体亲子关系鉴定中的应用：
从牦牛亲子群体中选择了一对母子关系明确的母牦牛和子代牦牛，再选择两个可疑为父亲的公牦牛的精液，用本发明的试剂盒进行亲子关系检验。
1.样本：
(1)子代牦牛的编号为B1007004，血样管号为V111417；
(2)母本牦牛的编号为B3916076，血样管号为Y72372214；
(3)候选父本牦牛1的编号为C1011029，冻精标号为237246；
(4)候选父本牦牛2的编号为C2311097，冻精标号为237247。
2.提取各血液样品和精液样品的DNA，使用本发明中的试剂盒对各个样品进行荧光引物扩增和毛细管电泳检测。
3.检验及结果
根据以上毛细管电泳中各扩增产物荧光信号的不同，对14个STR位点的扩增产物长度进行读取，并将产物长度转变为STR位点的重复数，结果见表11。
表11 牦牛三联体亲子关系鉴定的基因分型
注：方框内的基因型为不符合亲缘关系的基因型。
4.鉴定结论
在被检测的14个STR标记中，子代牦牛和候选父本牦牛1的所有STR基因位点都符合孟德尔遗传方式(亲权系数大于0.9999)，而子代牦牛和候选父本牦牛2有6个位点不符合孟德尔遗传方式(表11)，故排除候选父本牦牛2为子代牦牛的生物学父亲，而确定候选父本牦牛1为子代牦牛的生物学父亲。
实施例3：
14个STR标记在牦牛精液鉴定中的应用：
两批保存的冷冻精液可疑采自同一个牦牛种公牛，取牦牛种公牛的血液样品和两批冷冻精液样品，用本发明的试剂盒进行个体识别检验。
1.样本：
(1)牦牛种公牛的编号为C0811069，
(2)冷冻精液1的标号为237369；
(3)冷冻精液2的标号为237381。
2.提取牦牛种公牛血液样品和两批牦牛精液样品的基因组DNA，使用本发明中的试剂盒对各个样品进行荧光引物扩增和毛细管电泳检测。
3.检验及结果
根据以上毛细管电泳中各扩增产物荧光信号的不同，对14个STR位点的扩增产物长度进行读取，并将产物长度转变为STR位点的重复数，结果见表12。
表12 两个牦牛个体识别鉴定的基因分型
注：方框内的基因型为不符合亲缘关系的基因型。
4.鉴定结论
在被检测的14个STR标记中，牦牛种公牛和冷冻精液1有11个位点的基因型不相同，而牦牛种公牛和冷冻精液2的14个STR基因位点的基因型都相同(表12)，它们遗传一致性的几率大于99.9999％，说明冷冻精液2为牦牛种公牛的精液，而冻精液1不是。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于牦牛亲子鉴定和个体识别的STR标记检测系统，其特征在于，所述STR标记检测系统中包括有以下14个STR基因座：BM720、BM2113、CH28AC、CSSM036、CSSME070、HAUT24、HEL6、ILSTS006、ILSTS008、INRA037、SPS115、TGLA227、YAK07和YAK08。
2.对权利要求1所述STR标记检测系统上14个STR基因座同时进行基因分型的复合PCR扩增系统，其特征在于，所述14个STR基因座分为五组，其组合方式与相应的PCR扩增引物如下：
第一组的3个基因座为CSSM036、HEL6、CSSME070，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示；CSSM036、HEL6和CSSME070分别采用FAM、HEX和TAMRA荧光素进行标记；
第二组的3个基因座为BM720、YAK07、SPS115，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.7至SEQ ID No.12所示；BM720、YAK07和SPS115分别采用FAM、HEX和TAMRA荧光素进行标记；
第三组的3个基因座为CH28AC、INRA037、HAUT24，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.13至SEQ ID No.18所示；CH28AC、INRA037和HAUT24分别采用FAM、HEX和TAMRA荧光素进行标记；
第四组的3个基因座为ILSTS006、YAK08、TGLA227，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.19至SEQ ID No.24所示；ILSTS006、YAK08和TGLA227分别采用FAM、HEX和TAMRA荧光素进行标记；
第五组的2个基因座为BM2113、ILSTS008，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.25至SEQ ID No.28所示；BM2113和ILSTS008分别采用FAM和HEX荧光素进行标记。
3.根据权利要求2所述的复合PCR扩增系统，其特征在于，
第一组STR基因座CSSM036、HEL6、CSSME070的PCR扩增引物组成第一组引物混合液，其各自的浓度依次为5.6μmol/L、7.9μmol/L和9.2μmol/L；
第二组STR基因座BM720、YAK07、SPS115的PCR扩增引物组成第二组引物混合液，其各自的浓度依次为6.3μmol/L、6.8μmol/L和9.1μmol/L；
第三组STR基因座CH28AC、INRA037、HAUT24的PCR扩增引物组成第三组引物混合液，其各自的浓度依次为5.7μmol/L、7.3μmol/L和9.4μmol/L；
第四组STR基因座ILSTS006、YAK08、TGLA227的PCR扩增引物组成第四组引物混合液，其各自的浓度依次为6.2μmol/L、7.5μmol/L和9.7μmol/L；
第五组STR基因座BM2113、ILSTS008的PCR扩增引物组成第五组引物混合液，其各自的浓度依次为5.9μmol/L和7.6μmol/L。
4.一种用于分析DNA样品14个STR基因座基因分型的非诊断方法，其特征在于，使用权利要求2或3所述的复合PCR扩增系统检测牦牛DNA样本，所述牦牛DNA样本选自牦牛血液、组织样品或精液样品中的一种或多种。
5.一种用于对牦牛亲子鉴定和个体识别的STR标记检测系统上14个STR基因座进行基因分型检测的试剂盒，其特征在于，所述14个STR基因座分别为：BM720、BM2113、CH28AC、CSSM036、CSSME070、HAUT24、HEL6、ILSTS006、ILSTS008、INRA037、SPS115、TGLA227、YAK07和YAK08。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，包含有80ng/μL的STR标准品50μL，10×PCR反应缓冲液200μL，如权利要求3所述5组引物混合液各10μL，ddH2O 1000μL×2管；其中，所述引物混合液包括引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.28的组合物；10×PCR反应缓冲液包括Taq DNA聚合酶0.5U/μL，Tris 150mmol/L，MgCl2 25mmol/L，KCl 350mmol/L，dNTP12mmol/L，按体积比计为0.9％的Nonidet P40，25℃pH值为8.6。
7.一种如权利要求6所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取牦牛基因组DNA，基因组DNA浓度为20-500ng/μL；
2)多重荧光PCR扩增：总反应体系为20μL，反应体系组成如下：
模板DNA0.5μL，10×PCR反应缓冲液2.0μL，引物混合液0.5μL，ddH2O 17μL；
3)PCR反应条件如下：
第一组，95℃预变性5分钟，95℃30秒、56.3℃30秒、72℃30秒，共35个循环，72℃保温6分钟；
第二组，95℃预变性5分钟，95℃30秒、55.6℃30秒、72℃30秒，共35个循环，72℃保温6分钟；
第三组，95℃预变性5分钟，95℃30秒、56.5℃30秒、72℃30秒，共35个循环，72℃保温6分钟；
第四组，95℃预变性5分钟，95℃30秒、56.0℃30秒、72℃30秒，共35个循环，72℃保温6分钟；
第五组，95℃预变性5分钟，95℃30秒、55.5℃30秒、72℃30秒，共35个循环，72℃保温6分钟；
4)将得到的每组PCR产物加入样品板，再将样品板装入遗传分析仪进行毛细管电泳；
5)利用GeneMapperTM 4.0软件分析电泳数据，得到实际样品的基因分型数据；
所述方法为非诊断用途。
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