CN104480205A - 一种基于全基因组str建立动物亲权鉴定系统的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及种质资源保护领域，特别涉及动物亲权鉴定领域，公开了一种基于全基因组STR建立动物亲权鉴定系统的方法，包括：1)全基因组STR位点查找；2)STR位点的初步筛选；3)引物设计；4)动物群体随机抽样并提取基因组DNA；5)STR位点群体多态性验证；6)对具有遗传多态性的STR位点进行哈迪-温伯格平衡检验，筛选出基因型频率分布满足哈迪-温伯格平衡的STR位点；7)STR位点的法医学学应用价值评价；8)建立STR亲权鉴定系统。该方法具有操作简便的优点，所构建亲权鉴定系统的非父排除率可达0.99以上，能准确进行动物亲权鉴定从而可用于指导珍稀物种的繁育及经济类物种的鉴别及育种。

Description

一种基于全基因组STR建立动物亲权鉴定系统的方法

技术领域

本发明涉及一种亲权鉴定系统的建立方法，特别涉及一种基于全基因组序列中STR位点建立用于动物亲权鉴定系统的方法。

背景技术

无论是对珍稀动物种质资源的保护，还是对具有较高经济价值动物的繁育，要求对动物个体识别与亲权鉴定的事件越来越多。例如，对大熊猫进行亲子鉴定和个体识别，有助于避免人工饲养繁殖中近亲繁殖的难题，对拯救大熊猫物种有重要意义。又如，在现代育马业及赛马业中，对一些优秀品种的马匹进行出生来源鉴定也备受重视。

DNA分子标记由于能直接反映遗传物质本身或基因组的变化差异等，且大多数呈中性突变，遗传较为稳定，符合孟德尔遗传规律，不受生理期和环境的影响，并在群体中具有高度多态性和较高的杂合度等，因此在动物个体识别和亲权鉴定方面有重要的应用前景。DNA分子标记主要包括限制性片段长度多态性、随机扩增DNA多态性、DNA指纹图、小卫星DNA、微卫星DNA标记和单核苷酸多态性分析等。

微卫星DNA，又称短串联重复序列(Short Tandem Repeat，STR)，是以1～6个碱基为核心而组成的短串联重复序列，广泛随机地分布于真核生物基因组中，在动物基因组DNA序列中，平均6～10kb就可能出现一个，其一般大小为100～350碱基。微卫星DNA比其他标记更具有检测方法简便、快速，分析材料广泛，重复性好，结果可靠等优点，因此被认为是进行个体识别与亲权鉴定的绝佳分子标记。

亲权鉴定的基本原理有两点：

1，在肯定子代的某个标记基因是来自生父，而假设父亲并不带有这个基因的情况下，可以排除它是该子代的父亲。由此可知，被检查的血型系统或DNA分子标记个数越多，假设父亲被排除的几率越大；

2，在肯定子代的某些标记基因是来自生父，而假定父亲也带有这些基因的情况下，不能排除它是该子代的生父。这时可以计算出它是该子代生父的概率，在使用多个遗传标记时，通常计算其累积排除概率：假设若干相互独立的标记个数排除概率分别为P₁、P₂……P_n，则n个相互独立的标记个数的累积排除概率为：

P_c＝(1-P₁)(1-P₂)……(1-P_n)

在动物育种及家畜问题引起的民事纠纷中，STR分型技术已经被用于多种动物的亲子鉴定，但是由于传统方法在开发和利用微卫星DNA标记的同时，必须首先通过克隆STR位点，测序得到其两侧特异的保守序列，并以此设计引物。该方法整个过程周期长，并且筛选通量低，从而给STR的应用带来了一定的困难和障碍。目前随着测序技术的发展和测序通量的不断提高，越来越多的全新物种基因组得到解码，可以通过STR查找软件非常方便的查找STR位点及其两侧序列。基于此，本发明开发了从基因组参考序列出发，建立动物STR亲权鉴定系统的方法。

经过文献检索，未见与本发明相同的公开报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在动物全基因组序列中筛选STR位点进而建立STR亲权鉴定系统的方法。

本发明建立了一套基于全基因组参考序列信息建立该物种STR亲权鉴定系统的整套方法。依据本发明中的方法，能够快速建立目标物种的STR亲权鉴定系统，该系统能够有效鉴定动物个体间的亲子关系及亲缘关系，因此能够为动物育种提供有力指导。

一种基于全基因组STR建立动物亲权鉴定系统的方法，包括以下步骤：

1)全基因组STR位点查找：通过串联重复序列查找软件Tandem RepeatFinder(TRF)在所研究物种全基因组寻找所有STR位点；

2)STR位点的初步筛选：统计出该物种全基因组参考序列中重复单位为4个碱基的STR位点，参考该物种群体遗传多态性高低情况，并从中随机选取50～300个STR位点；

3)引物设计：对于步骤2)中所选取的每一个STR位点，在串联重复序列前后两端200碱基长度的保守序列内，分别设计用于多核苷酸扩增反应的正向引物和反向引物；

4)动物群体随机抽样并提取基因组DNA：在所研究的动物群体中通过随机抽样的方式获得样本，并提取样本中所有个体的基因组DNA；

5)STR位点群体多态性验证：

①使用步骤3)中的引物分别扩增样本中所有个体的基因组DNA目标基因组区域；

②扩增产物经分离后进行基因分型；

③对于具有遗传多态性的STR位点，估算各等位基因频率；

6)采用皮尔森卡方检验对步骤5)中各STR位点的基因型分布频率进行哈迪-温伯格平衡检验，筛选出符合哈迪-温伯格平衡的STR位点；

①计算基因型分布频率的观察值；

②计算基因型分布频率的理论值；

③用皮尔森卡方检验判断每个STR位点基因型频率分布的观察值和理论值是否具有显著差异，如果二者具有显著差异p<0.05，则该位点不符合哈迪-温伯格平衡，在后续步骤中将该位点剔除；如果二者不具有显著差异p>0.05，则该位点符合哈迪-温伯格平衡；

7)STR位点的法医学学应用价值评价：对步骤6)中筛选出的各STR位点分别计算其法医学参数，如杂合度、个体识别率、多态信息量、非父排除率等；

8)建立STR亲权鉴定系统：综合以上参数，选取法医学应用价值高的若干独立位点，使得累积排除概率大于0.99，由这些位点及对应的引物组成该物种的STR亲权鉴定系统。

本发明的有益效果在于：

1)从全基因参考序列中筛选STR位点，与传统分子克隆方法相比，该方法周期短，筛选通量高；具有方便快速，成本低廉的优点。

2)该方法也可用于其他重复单元长度的STR。

3)该方法也可用于建立动物的STR个体识别系统。

4)该方法可以根据鉴定的精度需求，增加STR检测位点。

该方法具有操作简便的优点，所构建亲权鉴定系统的非父排除率可达0.99以上，能准确进行动物亲权鉴定从而可用于指导珍稀物种的繁育及经济类物种的鉴别及育种。

附图说明

图1是用STR亲权鉴定系统鉴定的一个四代家系家谱，以及家系中所有个体在各STR位点的基因型。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例：朱鹮STR亲权鉴定系统的建立

具体步骤：

1)定义重复单元为1～6bp并且总长度不少于15bp的串联重复序列为STR。

用串联重复序列查找软件Tandem Repeat Finder(TRF)在朱鹮基因组中寻找STR。查找程序参数设定如下：“Match＝2，Mismatch＝7，Delta＝7，PM＝80，PI＝10，Minscore＝30，Maxperiod＝6”。在朱鹮基因组中共发现至少82万个STR位点，其中4碱基重复的STR位点数约5万个。

2)从重复单元为4bp的STR位点中选取300个STR位点。

选取原则：ⅰ)该位点为非简并性STR位点；ⅱ)各位点独立遗传。

3)使用引物设计软件Primer Premier 5.0在STR两端200bp以内的保守序列中分别设计上游和下游引物。设计引物参数设定如下：引物长度18～22bp，产物长度160～400bp。

4)在陕西洋县4个不同的朱鹮亚群中，随机抽取105个个体构成样本，其中包括48个雄性和57个雌性。采用血液DNA抽提试剂盒E.Z.N.A.^TM Blood DNA Kit从朱鹮血液中提取基因组DNA。所得的DNA样本用试剂盒TIANamp Genemic DNAKit进行定量。所有步骤按照试剂盒说明书操作。

5)对于步骤2)中选取的位点，在步骤4)中抽取的样本中进行遗传多态性验证。具体操作方法包括：

①通过多核苷酸扩增反应方法对基因组中包含重复序列的目标区域进行扩增。反应在GeneAmp 9700多核苷酸扩增反应仪上进行。多核苷酸扩增反应程序：

95℃/5分钟

95℃/30秒-52℃/30秒-72℃/30秒，30个循环

72℃/10分钟

对上述扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据扩增产物片段大小挑选出等位基因数目最高的50个STR位点，对于长度重叠的位点使用不同的荧光标记，第一组用FAM(蓝色)标记，第二组用HEX(绿色)标记，第三组用TMR(黄色)标记。

②扩增产物通过ABI3730DNA Genetic Analyzer48-capillary array system分离后，根据扩增产物片段大小用软件Genemapper3.5进行基因分型；

③以片段大小作为等位基因，计算各位点等位基因频率，即计算各等位基因数量占该基因座全部等位基因总数的比率。

6)采用皮尔森卡方检验对各STR位点的基因型分布频率进行哈迪-温伯格平衡检验。基因型频率是指群体中某特定基因型个体数占全部个体数的比率，哈迪-温伯格平衡是指基因型频率分布的观察值和理论值无显著差异(p>0.05)。

①计算基因型分布频率的观察值：观察到的特定基因型个体数除以全部个体数。

②计算基因型分布频率的理论值：对于一个STR位点，假设有n个等位基因，用x_i代表该第i个等位基因的频率，则该位点的基因型分布频率的理论值计算公式为：

${\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{x}_i\right)}^2=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{x}_i^2+2\&CenterDot;\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\&Sigma;}}}(x_i\&CenterDot;\underset{j=i+1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{x}_j),(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{x}_i=1)(i,j\&Element;N)---\left(1\right)$

③用皮尔森卡方检验判断每个STR位点基因型频率分布的观察值和理论值是否具有显著差异。如果二者具有显著差异(p<0.05)，则该位点不符合哈迪-温伯格平衡，在后续步骤中将该位点剔除；如果二者不具有显著差异(p>0.05)，则该位点符合哈迪-温伯格平衡，可用于后续步骤。

7)对步骤6)中筛选出的符合哈迪-温伯格平衡的STR位点分别计算杂合度、个体识别率、多态信息量、非父排除率等法医学参数。

所述杂合度He由下式得到：

$\mathrm{He}=\frac{n}{n-1}(1-\underset{i=1}{\overset{N_A}{\mathrm{\&Sigma;}}}{P_i}^2)---\left(2\right)$

其中，n代表样本个数；P_i代表等位基因i的频率；N_A代表该基因座位的等位基因数目。

所述个体识别率DP由下式得到：

$\mathrm{Dp}=1-\underset{i=1}{\overset{N_G}{\mathrm{\&Sigma;}}}{G}_i^2---\left(3\right)$

其中，G_i代表基因型i的频率；N_G代表该基因座的基因型数。

所述多态信息量PIC由下式得到：

$\mathrm{PIC}=1-\underset{i=1}{\overset{N_A}{\mathrm{\&Sigma;}}}{P_i}^2-{\left(\underset{i=1}{\overset{N_A}{\mathrm{\&Sigma;}}}{P_i}^2\right)}^2+\underset{i=1}{\overset{N_A}{\mathrm{\&Sigma;}}}{P_i}^4---\left(4\right)$

其中，P_i代表等位基因i的频率；N_A代表该基因座的等位基因数。

所述非父排除率EP由下式得到：

EP＝He²·(1-2·(1-He)·He²)   (5)

其中，He代表该基因座的杂合度。

8)参照步骤7)中各参数考虑各位点的法医学价值，选取独立STR位点，要求这些位点的累积排除概率大于0.99。最终选做朱鹮的亲权关系鉴定的独立STR位点包括：22个常染色体位点和一个性染色体位点，其中性染色体位点仅用于做性别鉴定。表1给出这些位点的详细信息，所有这些位点及其对应的引物构成朱鹮这一物种的亲权鉴定系统。

表1：实施例中STR亲权鉴定系统各位点基本信息

应用朱鹮亲权鉴定系统，成功鉴定出四代家系中8只朱鹮个体间的亲权关系。图1中列出该家系谱系图及所有个体在22个常染色体STR位点的基因型，所有位点均符合孟德尔遗传定律。

实际应用表明：本方法简便易行，鉴定准确性高。

上述仅给出朱鹮的鉴定系统，本方法可拓宽到其他物种。本方法还可推广至其他重复单元长度的STR位点。

Claims (6)

1.一种基于全基因组STR建立动物亲权鉴定系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)全基因组STR位点查找：通过串联重复序列查找软件Tandem RepeatFinder(TRF)在所研究物种全基因组参考序列中寻找所有STR位点；

2)STR位点的初步筛选：统计出该物种全基因组参考序列中重复单位为4个碱基的STR位点，并从中随机选取50～300个STR位点；

3)引物设计：对于步骤2)中所选取的每一个STR位点，在串联重复序列前后两端200碱基长度的保守序列内，分别设计用于多核苷酸扩增反应的正向引物和反向引物；

4)动物群体随机抽样并提取基因组DNA：在所研究的动物群体中通过随机抽样的方式获得样本，并提取样本中所有个体的基因组DNA；

5)STR位点群体多态性验证：

①使用步骤3)中的引物分别扩增样本中所有个体的基因组DNA目标基因组区域；

②扩增产物经分离后进行基因分型；

③以片段大小作为等位基因，计算各STR位点等位基因分布频率；

6)采用皮尔森卡方检验对步骤5)中各STR位点的基因型分布频率进行哈迪-温伯格平衡检验，筛选出符合哈迪-温伯格平衡的STR位点；

7)STR位点的法医学学应用价值评价：对步骤6)中筛选出的符合哈迪-温伯格平衡的STR位点分别计算其法医学参数；

8)建立STR亲权鉴定系统：根据法医学参数，选取若干独立位点，使得累积排除概率大于0.99，由这些位点及对应的引物组成该物种的STR亲权鉴定系统。

2.根据权利要求1所述的基于全基因组STR建立动物亲权鉴定系统的方法，其特征在于，所述步骤5)-②中，扩增产物经分离后根据片段大小，利用软件Genemapper3.5进行基因分型。

3.根据权利要求1所述的基于全基因组STR建立动物亲权鉴定系统的方法，其特征在于，所述步骤5)-③中，计算各位点等位基因频率，即计算各等位基因数量占该基因座全部等位基因总数的比率。

4.根据权利要求1所述的基于全基因组STR建立动物亲权鉴定系统的方法，其特征在于，步骤6)中，采用皮尔森卡方检验对各STR位点的基因型分布频率进行哈迪-温伯格平衡检验，哈迪-温伯格平衡是指基因型频率分布的观察值和理论值无显著差异，具体为：

①计算基因型分布频率的观察值：观察到的特定基因型个体数除以全部个体数；

②计算基因型分布频率的理论值：对于一个STR位点，假设有n个等位基因，用x_i代表该第i个等位基因的频率，则该位点的基因型分布频率的理论值计算公式为：

${\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{x}_i\right)}^2=\underset{i=i}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{x}_i^2+2\&CenterDot;\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\&Sigma;}}}(x_i\&CenterDot;\underset{j=i+1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{x}_j),(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{x}_i=1)(i,j\&Element;N)$

③用皮尔森卡方检验判断每个STR位点基因型频率分布的观察值和理论值是否具有显著差异，如果二者具有显著差异p<0.05，则该位点不符合哈迪-温伯格平衡，在后续步骤中将该位点剔除；如果二者不具有显著差异p>0.05，则该位点符合哈迪-温伯格平衡。

5.根据权利要求4所述的基于全基因组STR建立动物亲权鉴定系统的方法，其特征在于，基因型频率分布的观察值是观察到的特定基因型个体数除以全部个体数。

6.根据权利要求1所述的基于全基因组STR建立动物亲权鉴定系统的方法，其特征在于，步骤7)中，分别计算其法医学参数包括杂合度、个体识别率、多态信息量和非父排除率。