CN105112511A - 一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法 - Google Patents

一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法，特异性引物JF190和JR386的序列分别为：JF190：5’-CAGTTGGTTAGTACCCTTAGTACTCGG-3’；JR386：5’-GATCAACAGATGCTCCTCCATGGG-3’；具有以下优点：(1)种特异性引物对更加特异，只对具条实蝇具有扩增能力，可扩增出一条长度为197bp的特异条带，而对其近源种无扩增能力，扩增效率更高；(2)操作简单、快速、高效；(3)种特异性引物对有较高的灵敏度，具有较高的实用价值，可以快速、准确、特异性地检测出具条实蝇的各个虫态甚至残体，具有检测范围大的优点。

Description

一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法
技术领域
本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法。
背景技术
具条实蝇，拉丁学名为：Bactrocerascutellata(Hendel)，属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae果实蝇属Bactrocera，是一种重要的入侵检疫性害虫。目前，具条实蝇在世界范围的分布比较局限，主要分布在越南(龚秀泽，2003)、印度(梁日崇等，1985)、缅甸(邓裕亮等，2005)、老挝(邓裕亮等，2010)、日本(梁广勤等，1989；Miyatakeetal.，2000)及韩国(Munetal.,2000)等地。我国是具条实蝇世界上具条实蝇的主要分布地区之一，目前主要分布在台湾、广东、广西、福建、浙江、江西、海南、云南、贵州、四川、湖北和陕西(梁日崇等，1985；梁广勤等，1989)。
具条实蝇危害的植物寄主非常广泛，主要危害茄科植物及瓜类，包括南瓜、丝瓜、苦瓜、黄瓜、冬瓜、柑橘、柚、西瓜、木瓜、番茄、茄子、辣椒、番石榴、芒果等具有经济价值的果蔬。具条实蝇在植物组织内部生长发育，成虫只取食液态食物，幼虫植食性，在果实内部取食。由于其幼虫植食性，具条实蝇的经济重要性不仅能造成水果和蔬菜产量的直接锐减，增加了防治的费用，还影响水果蔬菜的进出口贸易和增加建立控制和根除具条实蝇的费用，因此我国也将具条实蝇列为检疫性害虫。近二十多年以来，具条实绳在我国的分布范围急剧扩大，对我国经济造成很大影响，因此，非常有必要研究具条实蝇快速鉴定的新方法，实现对具条实蝇的快速鉴定。
由于对具条实蝇的成虫形态鉴别远比对幼虫、卵或蛹的鉴别容易，因此，为了保证鉴定的准确性目前的检疫监管机构，通常采用的具条实蝇疫情的鉴别方法为形态学鉴别方法，即：首先将截获的实蝇幼虫、卵或蛹在室内饲养为成虫，然后通过观察成虫形态，而鉴别其是否为具条实蝇。该种鉴别方法存在的主要问题为：(1)将幼虫、卵或蛹饲养为成虫，需要花费较长的时间，严重影响了果蔬进出口贸易的通关速度；(2)如果截获果蔬中实蝇的头、胸、腹、翅、足等残体，由于无法将上述残体饲养为成虫，因此，无法准确识别所截获的残体是否为具条实蝇的残体，具有较大的鉴别局限性。
可见，现有技术中，为了防止检疫性具条实蝇传入以及扩散，迫切需要一种可克服形态学鉴别方法的不足、能够快速准确鉴定具条实蝇的鉴别方法。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法，能够快速准确的对截获的疑似具条实蝇的幼虫、卵、蛹，以及头、胸、翅、腹、足等残体进行鉴别。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对，包括上游引物JF190和下游引物JR386；
所述上游引物JF190的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；
所述下游引物JR386的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
本发明还提供一种用于快速鉴定具条实蝇的试剂盒，所述试剂盒包括以下引物：
上游引物JF190，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；
下游引物JR386，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
优选的，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液中的至少一种；所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供一种采用权利要求1所述的种特异性引物对快速鉴定具条实蝇的方法，包括以下步骤：
S1，设计具条实蝇的种特异性引物对；其中，所述具条实蝇的种特异性引物对包括上游引物JF190和下游引物JR386；
其中，上游引物JF190的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；下游引物JR386的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；
S2，提取被鉴定生物体的DNA；
S3，以S2提取的DNA为模板，使用S1得到的所述具条实蝇的种特异性引物对进行SS-PCR扩增反应；
S4，采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有197bp的特征条带，如果含有，则所述被鉴定生物体为具条实蝇种；反之，则所述被鉴定生物体不为具条实蝇种。
优选的，S1中，通过以下方法设计得到具条实蝇的种特异性引物对：
S1.1，选用具条实蝇的标本，采用试剂盒法从所述具条实蝇的标本中提取具条实蝇的基因组DNA。
优选的，S2中，所述被鉴定生物体的DNA具体为：来自卵生物形态的DNA、来自幼虫生物形态的DNA、来自蛹生物形态的DNA、来自生物残体的DNA；
其中，所述生物残体指头、胸、腹、翅或足；
此外，通过以下方法，提取被鉴定生物体的DNA：
选用整只具条实蝇、或具条实蝇的残体、或具条实蝇的卵、幼虫或蛹作为样本；将所选用的样本置于2ml离心管中，加入液氮充分研磨；然后，将研磨后的样本采用OMEGAE.Z.N.A.TMInsectDNAKit试剂盒法提取DNA，并将最终提取到的DNA保存于-20℃备用。
优选的，S3中，所述SS-PCR扩增的反应体系以25ul计，包括：
优选的，所述SS-PCR扩增的反应条件为：93～95℃预变性4～6min；93～95℃变性35～45s；退火温度50～60℃，25～35s；72℃延伸0.5～1.5min；20～30个循环，最后72℃延伸7～10min停止反应。
优选的，所述SS-PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s；退火温度55℃，30s；72℃延伸1min；30个循环，最后72℃延伸7min停止反应。
优选的，S4中，所述采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有197bp的特征条带，具体为：
S4.1，提取SS-PCR扩增后的5ulSS-PCR产物；
S4.2，在含DNA染色剂的1.5％的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上，对所述5ulSS-PCR产物120V电泳30min；
S4.3，利用凝胶成像分析仪检测电泳后是否扩增出197bp的特征条带。
SS-PCR产物测序：除了对SS-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查瓜实蝇特异引物扩增的特异片段是否与预期的一致外，本发明人还对特异引物的SS-PCR产物进行测序，测序结果如下：
5’-TAATTGATTAGTACCTTTAATACTCGGAGCCCCAGATATAGCCTTCCCACGAATAAATAATATAAGATTTTGACTACTGCCCCCTTCACTTACACTACTTTTAGTGAGCAGTATAGTAGAAAATGGGGCTGGAACAGGTTGAACTGTTTACCCCCCTCTTTCATCAATTATTGCCCATGGAGGAGCATCTGTTGATC-3’
本发明提供的用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法，具有以下优点：
(1)种特异性引物对更加特异，只对具条实蝇具有扩增能力，可扩增出一条长度为197bp的特异条带，而对其近源种无扩增能力，扩增效率更高，结果判断更加直观、便捷；
(2)PCR检测技术操作简单、快速、高效，一般可在8个小时内完成检测与鉴定，传统形态学鉴定中，需要饲养15天得到成虫再进行鉴定；可见，本发明大大缩短了具条实蝇的鉴定周期；
(3)本发明提供的种特异性引物对，具有较高的灵敏度，DNA浓度检出限为2.889×10-4ng/uL，具有较高的实用价值，可以快速、准确、特异性地检测出具条实蝇的各个虫态甚至残体，具有检测范围大的优点。
可见，本发明所建立的SS-PCR快速鉴定具条实蝇的方法，具有快速简便、特异性高、灵敏度高等优点，可以在8小时之内完成具条实蝇的鉴定，能够满足口岸检验检疫快速通关的要求。
附图说明
图1为比较例一提供的通用型引物LCO1490和HC02198对提取的实蝇DNA模板进行质量检测的结果图；
图2为比较例一提供的引物JF190和JR386的种特异性验证结果图；
图3为比较例三提供的引物JF190和JR386的种特异性验证结果图；
图4为试验例一提供的引物JF190和JR386的灵敏度验证结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明进行详细说明：
近年来，由于分子生物学技术能解决传统的形态学分类方法难以解决的问题且不受虫态的影响，越来越多的分子生物学技术被运用于昆虫的鉴定中(黄可辉等，2005；王振华等，2009)。种特异引物PCR(Species-specificPCR，SS-PCR)技术，即在设计目标物种的引物时必须充分考虑引物的特异性，使得在扩增未知模板时能够根据目标片段条带的有无，就能把目标种类与其他种类鉴别开来。本发明提供了一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法，能够快速可靠的对截获的疑似具条实蝇的幼虫、卵、蛹，以及头、胸、翅、足等残体进行鉴别。具有检测结果可靠、灵敏度高、对具条实蝇特异性高的优点。
以下通过具体的比较例或试验例，证明本发明提供的种特异性引物对的特异性、灵敏度和可靠性：
比较例一
本比较例用于考察本发明提供的种特异性引物对的种特异性：
(1)供试虫源：
本实验的供试实蝇均经过梁帆研究员、邓裕亮和张伟高级农艺师专家鉴定。供试实蝇有番石榴实蝇B.correcta(Bezzi)、桔小实蝇B.dorsalis(Hendel)、颜带实蝇B.cilifer(Hendel)、锈实蝇B.rubigina(Wang&Zhao)、瑞丽果实蝇B.ruiliensisWang,LongetZhang,sp.nov.、瘤胫实蝇B.tuberculata(Bezzi)、杨桃实蝇B.carambolaeDrew&Hancock、辣椒实蝇B.latifrons(Hendel)、瓜实蝇B.cucurbitae(Coquillett)、南瓜实蝇B.tau(Walker)、具条实蝇B.scutellata(Hendel)、近黑颜实蝇B.parater(Zhao&Lin)、黑膝实蝇B.scutellaris(Bezzi)、滇寡鬃实蝇、B.modica(Hardy)、何氏华实蝇B.hochii(Zia)、枣实蝇CarpomyavesuvianaCosta、瓜棍腹实蝇DacuslongicornisWiedemann、腿端黑实蝇B.atrifemurDrew&Hancock、黑颜实蝇B.diaphoraCoquillett、五指山实蝇B.wuzhishanaLinetYang,sp.nov.20种实蝇。
(2)DNA的提取和DNA质量检测
1)DNA提取：
采用OMEGAE.Z.N.A.TMInsectDNAKit试剂盒法提取DNA。
具体步骤为：选用整只实蝇或是实蝇部分身体(如若干条腿或是若干片翅膀)或是蛹、幼虫于2ml离心管中，加入适量液氮充分研磨，然后根据试剂盒的说明书操作步骤进行，最后将得到的DNA样品保存于-20℃备用。
2)DNA质量检测：
利用通用引物LCO1490和HCO2198进行实蝇样本DNA的质量检测，PCR反应在定量梯度PCR仪上进行，反应体系：2×EasyTaqPCRSuperMix(天根生化科技有限公司)12.5uL，引物各1uL，模板各2uL，加ddH2O至总体积25uL；反应条件为94℃/5min，94℃/40s，48℃/30s，72℃/1min，35个循环，最后延伸10min；分别提取5uLPCR产物在含DNA染色剂的1.5％的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳30min(120V)，利用凝胶成像分析仪检测是否扩增出预期大小的目标片段，拍摄并记录结果。通用型引物LCO1490和HCO2198的序列分别为：
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’；
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’；
3)DNA质量检测结果：
通用型引物LCO1490和HC02198对提取的实蝇DNA模板进行质量检测的结果如图1所示，在图1中，M：50bpDNALadder，1：番石榴实蝇B.correcta，2：桔小实蝇B.dorsalis，3：颜带实蝇B.cilifer，4：锈实蝇B.rubigina，5：瑞丽果实蝇B.ruiliensis，6：瘤胫实蝇B.tuberculata，7：杨桃实蝇B.carambolae，8：瓜实蝇B.cucurbitae，9：辣椒实蝇B.latifrons，10：南瓜实蝇B.tau，11：具条实蝇B.scutellata，12：近黑颜实蝇B.parater，13：黑膝实蝇B.scutellaris，14：滇寡鬃实蝇B.modica，15：何氏华实蝇B.hochii，16：枣实蝇Carpomyavesuviana，17：瓜棍腹实蝇Dacuslongicornis，18：腿端黑实蝇B.atrifemur，19：黑颜实蝇B.diaphora，20：五指山实蝇B.wuzhishana，21：空白对照ddH2O。
观察图1可以看出，所有的实蝇DNA均能扩增出单一且清晰的、长度约700bp的目标条带。
(3)引物的设计
通过NCBI数据库查找具条实蝇已公布的登录序列并进行比较分析，最后选定登录号KF660107，下载该登录号的FASTA格式，利用Primer-Premier5.0人工设计引物，再利用Oligo6.44对引物进行评价，最后利用NCBI数据库中提供的Primer-BLAST程序检查同源序列，筛选出最佳特异性引物。
通过筛选，最终选择的种特异性引物JF190和JR386。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。特异性引物JF190和JR386的序列分别为：
JF190：5’-CAGTTGGTTAGTACCCTTAGTACTCGG-3’；
JR386：5’-GATCAACAGATGCTCCTCCATGGG-3’。
(4)引物的种特异性的测试
1)测试过程
选用除具条实蝇除外的其它19种实蝇作为阴性对照，具条实蝇为阳性对照，验证本实验所设计引物的种特异性。
SS-PCR在定量梯度PCR仪上进行，反应体系：2×EasyTaqPCRSuperMix12.5uL，引物各1uL，模板各2uL，加ddH2O至总体积25uL；反应条件为94℃/5min，94℃/40s，52℃/30s，72℃/1min，30个循环，最后延伸7min；分别提取5uLPCR产物在含DNA染色剂的1.5％的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳30min(120V)，利用凝胶成像分析仪检测是否扩增出预期大小的目标片段，拍摄并记录结果。
2)测试结果
引物JF190和JR386的种特异性验证结果如图2所示，在图2中，M：100bpDNALadder，1：具条实蝇B.scutellata，2：番石榴实蝇B.correcta，3：桔小实蝇B.dorsalis，4：颜带实蝇B.cilifer，5：锈实蝇B.rubigina，6：瑞丽果实蝇B.ruiliensis，7：瘤胫实蝇B.tuberculata，8：杨桃实蝇B.carambolae，9：瓜实蝇B.cucurbitae，10：辣椒实蝇B.latifrons，11：南瓜实蝇B.tau，12：近黑颜实蝇B.parater，13：黑膝实蝇B.scutellaris，14：滇寡鬃实蝇B.modica，15：何氏华实蝇B.hochii，16：枣实蝇Carpomyavesuviana，17：瓜棍腹实蝇Dacuslongicornis，18：腿端黑实蝇B.atrifemur，19：黑颜实蝇B.diaphora，20：五指山实蝇B.wuzhishana，21：空白对照ddH2O。
观察图2可以看出，仅具条实蝇扩增出清晰且单一的约197bp的条带，其它实蝇种类均未出现目标条带。重复实验3次，结果均一致，表明该实验设计的种特异性引物JF190和JR386具有较强的特异性及稳定性。
将实验所得到的PCR产物送到英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，将所得到的序列提交NCBI数据库进行BLAST，结果表明该段序列与数据库中的具条实蝇序列具有100％的一致性。
本发明中，引物的特异性是本实验成功的关键，因为mtDNACOⅠ相对保守，容易被通用引物扩增同时又有足够的变异能够将不同物种区分开，所以选用mtDNACOⅠ作为标记基因。本实验选用番石榴实蝇、桔小实蝇、颜带实蝇、锈实蝇等19种实蝇(包括Bactrocera、Carpomya、Dacus三个属以及果实蝇属的Bactrocera、Zeugodacus、Sinodacus、Asiadacus4个亚属)作为阴性对照，具条实蝇作为阳性对照，利用本实验设计的引物JF190和JR386进行PCR扩增，仅具条实蝇能特异性并稳定性地扩增出长度约197bp的清晰且单一的目标条带，其它实蝇种类均无条带出现，进一步验证了本实验所设计引物JF190和JR386的特异性。
基于同样的检测方法，仅改变阳性对照样1，将阳性对照样1分别替换为：幼虫形态的具条实蝇、卵形态的具条实蝇、蛹形态的具条实蝇、具条实蝇的头部位、具条实蝇的胸部位、腹部位、具条实蝇的翅部位和具条实蝇的足部位，进行上述的鉴定试验，所得到的电泳检测图均与图2相同。
因此，通过本比较例，一方面，本发明提供的种特异性引物对，在实验涉及的实蝇种类范围内，能够特异性的鉴定具条实蝇，具有较强的特异性；另一方面，由于具条实蝇的各个虫态甚至残体均出现197bp的特征条带，说明本发明提供的种特异性引物对，可以快速、准确、特异性地检测出具条实蝇的各个虫态甚至残体，具有检测范围大的优点。
比较例二
本比较例与比较例一唯一的不同在于：
SS-PCR反应条件为：93℃预变性4min；95℃变性45s；退火温度50℃，25s；72℃延伸1.5min；20个循环，最后72℃延伸7min停止反应。
试验结果与比较例一相同，即：阴性对照样均没有出现197bp的特征条带。而阳性对照样出现197bp的特征条带。
比较例三
M：100bpDNALadder，1-20：具条实蝇B.scutellata，21：瓜实蝇B.cucurbitae，22：南瓜实蝇B.tau，23：空白对照ddH2O
采用以下20种不同虫态的具条实蝇，其中，样品1-样品4均为饲养后获得的成虫；样品5-样品8均为幼虫；样品9-样品12均为卵；样品13-样品16均为饲养后获得的蛹；样品17-样品20为成虫；
分别将样品1-样品20作为阳性对照，以瓜实蝇B.cucurbitae和南瓜实蝇B.tau作为阴性对照，然后，采用与比较例二相同的SS-PCR扩增和电泳检测方法，检测结果如图3所示。在图3中，M：100bpDNALadder，1-20：具条实蝇B.scutellata，21：瓜实蝇B.cucurbitae，22：南瓜实蝇B.tau，23：空白对照ddH2O。
观察图3可以看出，样品1-样品20均出现197bp的特征条带；而样品21-样品22均没有出现197bp的特征条带。因为，采用本发明提供的鉴定方法，鉴定结论为：样品1-20为不同虫态的具条实蝇。而样品21-样品22均不为具条实蝇的不同虫态。
将样品饲养为成虫，然后观察成虫的形态，结果表明，分子生物学鉴定结果与形态学鉴定结果一致，表明本发明提供的方法具有较好的稳定性，不受虫态的限制，可以应用于具条实蝇的实际鉴定工作。
试验例一
本试验例用于检测SS-PCR扩增反应的灵敏度。
选择条带最亮的DNA模板，利用核酸蛋白分析仪测试提取的具条实蝇DNA模板的浓度为28.89ng/uL，将其按10-1、10-2、10-3倍梯度稀释，取不同浓度的DNA模板进行最低检出阈值的测定，引物JF190和JR386的灵敏度验证结果如图4所示，在图4中，M：100bpDNALadder，1：100，2：10-1，3：10-2，4：10-3，5：空白对照ddH2O。
观察图4可以看出，随着模板浓度的降低，扩增出的条带逐渐减弱，在稀释10-3倍后仍有明显条带，说明该方法具有较高的灵敏度。
当口岸仅发现卵或是残体时，即只能提取到微量DNA时，SS-PCR检测鉴定方法的灵敏度就至关重要了，本实验所建立的方法具有较高的灵敏度，能检测到的DNA模板浓度可低至2.889×10-4ng/uL。同时该SS-PCR检测鉴定方法在实际检疫工作中也得到应用和验证。
综上所述，本发明所建立的SS-PCR快速鉴定具条实蝇的方法，具有快速简便、特异性高、灵敏度高等优点，可以在8小时之内完成具条实蝇的鉴定，能够满足口岸检验检疫快速通关的要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对，其特征在于，包括上游引物JF190和下游引物JR386；
所述上游引物JF190的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；
所述下游引物JR386的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
2.一种用于快速鉴定具条实蝇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下引物：
上游引物JF190，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；
下游引物JR386，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.根据权利要求2所述的用于快速鉴定具条实蝇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液中的至少一种；所述试剂盒还包括标准阳性模板。
4.一种采用权利要求1所述的种特异性引物对快速鉴定具条实蝇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，设计具条实蝇的种特异性引物对；其中，所述具条实蝇的种特异性引物对包括上游引物JF190和下游引物JR386；
其中，上游引物JF190的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；下游引物JR386的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；
S2，提取被鉴定生物体的DNA；
S3，以S2提取的DNA为模板，使用S1得到的所述具条实蝇的种特异性引物对进行SS-PCR扩增反应；
S4，采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有197bp的特征条带，如果含有，则所述被鉴定生物体为具条实蝇种；反之，则所述被鉴定生物体不为具条实蝇种。
5.根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定具条实蝇的方法，其特征在于，S1中，通过以下方法设计得到具条实蝇的种特异性引物对：
S1.1，选用具条实蝇的标本，采用试剂盒法从所述具条实蝇的标本中提取具条实蝇的基因组DNA。
6.根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定具条实蝇的方法，其特征在于，S2中，所述被鉴定生物体的DNA具体为：来自卵生物形态的DNA、来自幼虫生物形态的DNA、来自蛹生物形态的DNA、来自生物残体的DNA；
其中，所述生物残体指头、胸、腹、翅或足；
此外，通过以下方法，提取被鉴定生物体的DNA：
选用整只具条实蝇、或具条实蝇的残体、或具条实蝇的卵、幼虫或蛹作为样本；将所选用的样本置于2ml离心管中，加入液氮充分研磨；然后，将研磨后的样本采用OMEGAE.Z.N.A.TMInsectDNAKit试剂盒法提取DNA，并将最终提取到的DNA保存于-20℃备用。
7.根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定具条实蝇的方法，其特征在于，S3中，所述SS-PCR扩增的反应体系以25ul计，包括：
8.根据权利要求7所述的种特异性引物对快速鉴定具条实蝇的方法，其特征在于，所述SS-PCR扩增的反应条件为：93～95℃预变性4～6min；93～95℃变性35～45s；退火温度50～60℃，25～35s；72℃延伸0.5～1.5min；20～30个循环，最后72℃延伸7～10min停止反应。
9.根据权利要求8所述的种特异性引物对快速鉴定具条实蝇的方法，其特征在于，所述SS-PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s；退火温度55℃，30s；72℃延伸1min；30个循环，最后72℃延伸7min停止反应。
10.根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定具条实蝇的方法，其特征在于，S4中，所述采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有197bp的特征条带，具体为：
S4.1，提取SS-PCR扩增后的5ulSS-PCR产物；
S4.2，在含DNA染色剂的1.5%的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上，对所述5ulSS-PCR产物120V电泳30min；
S4.3，利用凝胶成像分析仪检测电泳后是否扩增出197bp的特征条带。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107904315A (zh) * 2017-11-22 2018-04-13 北京林业大学 锈色棕榈象甲特异性引物及快速分子检测方法
CN109402266A (zh) * 2018-10-18 2019-03-01 河南科技大学 一种快速鉴定巨尾阿丽蝇的方法
CN113817848A (zh) * 2021-10-28 2021-12-21 青岛农业大学 一种基于可视化lamp技术检测具条实蝇的方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101851675A (zh) * 2010-04-07 2010-10-06 中华人民共和国四川出入境检验检疫局 检测检疫性实蝇的探针组及检测方法
CN102517388A (zh) * 2011-12-20 2012-06-27 中国农业大学 一种鉴定实蝇的试剂盒及其专用引物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101851675A (zh) * 2010-04-07 2010-10-06 中华人民共和国四川出入境检验检疫局 检测检疫性实蝇的探针组及检测方法
CN102517388A (zh) * 2011-12-20 2012-06-27 中国农业大学 一种鉴定实蝇的试剂盒及其专用引物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F. JIANG,ET AL: "Rapid diagnosis of the economically important fruit fly, Bactrocera correcta (Diptera: Tephritidae) based on a species-specific barcoding cytochrome oxidase I marker", 《BULLETIN OF ENTOMOLOGICAL RESEARCH》 *
张红梅等: "陕西省常见四种实蝇的RAPD研究初报", 《昆虫分类学报》 *
黄振等: "应用种特异性PCR技术快速鉴定辣椒实蝇", 《昆虫学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107904315A (zh) * 2017-11-22 2018-04-13 北京林业大学 锈色棕榈象甲特异性引物及快速分子检测方法
CN107904315B (zh) * 2017-11-22 2021-01-15 北京林业大学 锈色棕榈象甲特异性引物及快速分子检测方法
CN109402266A (zh) * 2018-10-18 2019-03-01 河南科技大学 一种快速鉴定巨尾阿丽蝇的方法
CN109402266B (zh) * 2018-10-18 2021-12-17 河南科技大学 一种快速鉴定巨尾阿丽蝇的方法
CN113817848A (zh) * 2021-10-28 2021-12-21 青岛农业大学 一种基于可视化lamp技术检测具条实蝇的方法及应用

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