CN103805710B

CN103805710B - 一种用于水稻干尖线虫lamp快速检测的引物组合物及其应用

Info

Publication number: CN103805710B
Application number: CN201410081273.3A
Authority: CN
Inventors: 王暄; 李红梅; 顾建锋; 魏洪岩
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-03-06
Filing date: 2014-03-06
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2034-03-06
Also published as: CN103805710A

Abstract

本发明公开了一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物及其应用。一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物，由以下引物组成：AB1-F3：SEQIDNO.2，AB1-B3：SEQIDNO.3，AB1-BIP：SEQIDNO.4，AB1-FIP：SEQIDNO.5，AB1-LF：SEQIDNO.6。利用该引物组合物进行水稻干尖线虫的LAMP快速检测，特异性强、灵敏度高，因此，本发明所述的引物组合物可在检测和/或鉴定水稻干尖线虫中应用。

Description

一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物及其应用。

背景技术

水稻干尖线虫（Aphelenchoidesbesseyi），又称贝西滑刃线虫，是水稻上重要的种传外寄生线虫，世界范围内各水稻产区均有发生^[1]，能引起水稻干尖或白尖病^[2]。水稻干尖线虫病于1915年在日本九州岛发现^[3]，大约20世纪40年代传入中国，曾被列为中国对内检疫对象^[4]，后因采取检疫及种子处理等措施，该病害在80年代得到控制。但是近年来，该病害的发生范围和危害程度在我国又开始加大，目前，广东、广西、湖南、湖北、浙江、江苏、安徽、山东、河北、上海、辽宁、陕西、贵州、四川、云南、台湾等地的主要稻区均有分布，局部地区发生和危害严重^[5]。为了阻止水稻干尖线虫病传播范围的不断扩大，对其进行快速、准确地检测鉴定尤为重要。

传统的水稻干尖线虫检测方法，主要以形态学鉴定为主，但由于线虫形态特征细微复杂，且常具有一定的变化，因此鉴定往往比较困难，需要专业人士操作，过程费时费力，且需要大量线虫样本，在单条线虫水平上难以准确鉴定。近年来随着分子生物学相关技术的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测水稻干尖线虫^[6]，尽管以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷，但由于检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统仪等昂贵的专业仪器设备，同时需要操作人员具有一定的分子生物学专业技能，并且只能在实验室条件下完成，需要较长的时间，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。

环介导等温扩增技术（Loop‐mediatedisothermalamplification,LAMP）是Notomi等开发的一种恒温扩增方法^[7]，该方法针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种具有链式置换活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，在恒温条件下(60℃左右)保温30‐90分钟，即可完成扩增反应。由于该反应过程中产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过颜色变化来判断，因此不需要专业的仪器设备，在普通水浴锅中或者其他稳定热源即可完成，具有简单、快速、高效、经济等特征。

凭借快速灵敏的优越性，LAMP技术已在松材线虫^[8]（Bursaphelenchuhxylophilus）、南方根结线虫^[9]（Meloidogyneincognita）、象耳豆根结线虫^[10]（Meloidogyneenterolobii）、香蕉穿孔线虫^[11]（Radopholussimilis）等植物寄生线虫快速检测中得到了应用，极大的提高了针对上述植物寄生线虫的鉴定效率和准确率，为进一步采取适宜的防控措施控制其危害提供了便利，但目前在水稻干尖线虫中尚无相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物。

本发明的另一目的是提供该引物组合物的应用。

本发明的又一目的是提供一种水稻干尖线虫LAMP快速检测方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物，由以下引物组成：AB1-F3：SEQIDNO.2，AB1-B3：SEQIDNO.3，AB1-BIP：SEQIDNO.4，AB1-FIP：SEQIDNO.5，AB1-LF：SEQIDNO.6。

本发明所述的引物组合物在检测和/或鉴定水稻干尖线虫中的应用。

本发明所述的引物组合物在制备水稻干尖线虫检测和/或鉴定试剂中的应用。

一种水稻干尖线虫检测试剂，包含本发明所述的引物组合物。

一种水稻干尖线虫LAMP快速检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待检样品DNA；

（2）以提取的DNA为模板，利用本发明所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增；

（3）LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：

1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，即可观察，扩增产物具有绿色荧光，表明含有水稻干尖线虫；

2)取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，EB染色，在紫外灯下观测，扩增产物呈梯形条带，表明含有水稻干尖线虫；

3)将反应后的离心管3000rpm离心30sec，管底观察到白色沉淀，表明含有水稻干尖线虫。

其中，步骤（2）所述LAMP扩增的反应体系优选为25μl，由

1）引物混合液：外引物AB1‐F3和AB1‐B3各0.2μmol/L，内引物AB1‐FIP和AB1‐BIP各0.8μmol/L,环引物AB1‐LF为0.4μmol/L；

2）反应混合液：0.8mmol/LdNTP，20mmol/LTris‐HCl(pH8.8)，10mmol/LKCl，5mmol/LMgCl₂，10mmol/L(NH4)₂SO₄，0.1%Tritonx‐100，0.2mol/L甜菜碱，8UBstDNA聚合酶大片段；

3）1μlDNA模板；

4）灭菌双蒸馏水组成。其中各成分的浓度均表示在反应体系中的终浓度。

步骤（2）所述LAMP扩增的反应条件优选：61～65℃保温30～90min，85℃保温10min。

所述的显色剂优选SYBRgreenI与PCR级DMSO以1：9体积比的混合物。

有益效果：

一、特异性强，所用的特异引物根据水稻干尖线虫的28S6个不同区域设计出5条引物，特异性明显强于常规PCR。

二、灵敏度高，对水稻干尖线虫的检测极限可达到1/10000条幼虫水平，比常规PCR检测水稻干尖线虫的检测灵敏度高100倍。

三、检测用时短，1小时左右可获得检测结果，比常规PCR节省2‐4h。

四、对仪器设备要求低，不需要任何PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅或者保温瓶就可以完成检测。

五、操作简单，结果容易辨别，通过不同颜色，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察，一般技术人员即可完成检测。

六、对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，减少环境污染。

综上所述，本发明具有比现有普通PCR技术检测水稻干尖线虫的方法具有更高的特异性、灵敏度和可操作性。该技术可应用于对水稻干尖线虫稻种检验检疫及田间植物上水稻干尖线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

附图说明

图1为水稻干尖线虫28S序列的LAMP引物设计示意图。

图2为水稻干尖线虫LAMP方法检测

A图为加入荧光染料检测结果，1：阳性结果，具有绿色荧光；2：阴性对照，为红褐色；

B图检测结果为电泳图，M：DL2000DNA标准分子量（Takara）；1：阳性结果，为LAMP扩增梯形条带；2：阴性对照，无扩增产物。

图3为水稻干尖线虫LAMP检测方法特异性检测结果图

A为LAMP加荧光染料检测结果图，1为阳性，2‐12为阴性；

B为LAMP检测结果电泳图；

C为常规PCR检测结果电泳图；

上述各图中1‐12泳道的DNA来源如表1所示。

图4为水稻干尖线虫灵敏度检测结果

A为LAMP加荧光染料检测结果图，1‐8分别为：10^‐1、10^‐2、10^‐3、10^‐4、10^‐5、10^‐6、10^‐7条线虫DNA和阴性对照；

B为LAMP检测结果电泳图，M：DL2000DNA标准分子量（Takara）；1‐8分别为：10^‐1、10^‐2、10^‐3、10^‐4、10^‐5、10^‐6、10^‐7条线虫DNA和阴性对照；

C为普通PCR法检测结果电泳图，M：DL2000DNA标准分子量（Takara）；1‐8分别为：10^‐1、10^‐2、10^‐3、10^‐4、10^‐5、10^‐6、、10^‐7条线虫DNA阴性对照。

图5颜色判定种子调运带病稻粒中水稻干尖线虫

1‐7为种子调运带病稻粒中的水稻干尖线虫扩增结果，呈现绿色，表明稻种中携带水稻干尖线虫；8为阴性对照，显红褐色，表明不携带水稻干尖线虫。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

所述试剂均为市售，主要试剂：TaqDNA聚合酶、DNAmarker购自TaKaRa公司；引物由上海英俊生物技术有限公司合成；pGEM‐TEasyVector购于美国promega；ProteinaseK（蛋白酶K）购自Roche公司；BstDNA聚合酶大片段购自NewEnglandBiolabs公司；SYBRgreenI购自Invitrogen公司。

实施例1水稻干尖线虫DNA的提取、rDNA28S扩增及序列分析

1.1水稻干尖线虫DNA的提取

挑取单条水稻干尖线虫或雌虫放入含有8μLddH₂O和1μL10×PCRBuffer(Mg²⁺free)的0.2mL离心管中，放入液氮中冷冻1min后，置于95℃下2min，重复4～5次；向PCR管中加入1μL10mg/ml蛋白酶K，然后将离心管在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。

1.2水稻干尖线虫rDNA28S扩增及序列分析

采用28S区的通用引物D2A(5’‐ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG‐3’,SEQIDNO.7)和D3B(5’‐TCGGAAGGAACCAGCTACTA‐3’,SEQIDNO.8)扩增水稻干尖线虫种群rDNA28S区片段。PCR扩增反应体系为10×Buffer(Mg²⁺free)2μl，10mmol/LdNTP2μl，10mmol/LMgCl₂2μl，引物TW81和AB28(2.5μmol/L)各2μl，Taq酶(5U/μl，Takara)0.5μl，模板DNA5μl，灭菌ddH₂O补足至25μl。PCR扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，40个循环；7℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观察并拍照，回收、克隆和测序如SEQIDNO.1，序列测定由上海英俊生物技术有限公司完成。

实施例2LAMP技术检测水稻干尖线虫方法的建立

2.1LAMP引物设计

根据水稻干尖线虫28S区扩增后测序结果，设计并筛选下列LAMP引物（见图1），引物交上海英俊生物技术有限公司合成。引物序列如下：

①AB1‐F3：5’‐ATTCCGCAAGGTTGTCTAGG‐3’(SEQIDNO.2)；

②AB1‐B3：5’‐CCGCAACCACAACTCACA‐3’(SEQIDNO.3)；

③AB1‐BIP：

5’‐CGAGAATCCTGTGCGTTCGGAATTCACCCGCACTCCACA‐3’(SEQIDNO.4)；

④AB1‐FIP：

5’‐AGCGACATCGACCCACTCGGAGTGTTGTTGTTGTGCTCGT‐3’(SEQIDNO.5)；

⑤AB1‐LF：5’‐CGCACGCAAATGCATCCA‐3’(SEQIDNO.6)；

2.2LAMP反应体系配置：

引物混合液：外引物AB1‐F3和AB1‐B3各0.2μmol/L，内引物AB1‐FIP和AB1‐BIP各0.8μmol/L,环引物AB1‐LF为0.4μmol/L；

反应混合液：0.8mmol/LdNTP，20mmol/LTris‐HCl(pH8.8)，10mmol/LKCl，5mmol/LMgCl₂，10mmol/L(NH4)₂SO₄，0.1%Tritonx‐100，0.2mol/L甜菜碱，8UBstDNA聚合酶大片段，1μlDNA模板，加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

2.3LAMP反应扩增条件：将以上混合液置于62℃恒温水浴中等温扩增60min，85℃保温10min，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后观察结果（图2A）。取2μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并拍照，可看到有LAMP特征性梯形带（图2B）。

实施例3水稻干尖线虫LAMP特异性检测

收集水稻干尖线虫，大连滑刃线虫，单性滑刃线虫，双尾滑刃线虫，腐烂茎线虫，松材线虫，拟松材线虫，阿苏里伞滑刃线虫，南方根结线虫，小麦孢囊线虫，大豆孢囊线虫，穿刺短体线虫（见表1），分别提取其DNA作为模板与水稻干尖线虫DNA模板一起进行LAMP检测，以检测水稻干尖线虫LAMP检测方法的特异性。同时以提取DNA为模板，以SCAR标记特异性引物（BSF:5’‐TCGATGAAGAACGCAGTGAATT‐3’(SEQIDNO.9)，BSR:5’‐AGATCAAAAGCCAATCGAATCAT‐3’(SEQIDNO.10)），进行常规PCR检测，体系如下：10×Buffer(Mg²⁺free)2.5μl，10mmol/LdNTP2μl，10mmol/LMgCl₂2μl，引物BSF和BSR(2.5μmol/L)各2μl，Taq酶(5U/μl，Takara)0.5μl，模板DNA1μl，灭菌ddH₂O补足至25μl，凝胶电泳观察结果。

表1供试的全部植物线虫群体样品代码及来源

编号	样品代码	群体种类	寄主植物	样本来源
					1	AspLYG	水稻干尖线虫	水稻	江苏连云港
2	AspDL	大连滑刃线虫	黑松	辽宁大连
					3	AspAV	单性滑刃线虫	未知	澳大利亚
4	AspDL	双尾滑刃线虫	马尾松	江苏宜兴
					5	DdXZ	腐烂茎线虫	甘薯	江苏徐州
6	BxLYG	松材线虫	黑松	江苏徐州
					7	BmNJ	拟松材线虫	马尾松	江苏南京
8	BaKOR	阿苏里伞滑刃线虫	马尾松	南非
					9	MiHN	南方根结线虫	番茄	海南海口
10	HaXZ	小麦孢囊线虫	小麦	江苏徐州
					11	HgBJ	大豆孢囊线虫	大豆	河北廊坊
12	PpTJ	穿刺短体线虫	玉米	山东莱阳

上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入1μl模板DNA，按照2.3的反应条件进行，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化，第1管为水稻干尖线虫DNA，可以观察到绿色荧光，其他管的线虫和阴性对照均为红褐色（如图3中A所示）。取2μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相（如图3中B所示），可看到第1泳道（水稻干尖线虫）有LAMP的特征性梯形带，其他泳道均未发现有扩增产物，而常规PCR引物BSF/BSR则除了在第1泳道有特异性扩张之外，在第6泳道（松材线虫）和第8泳道（阿苏里伞滑刃线虫）有中均有扩增（如图3中C所示），结果表明上述LAMP引物和反应体系在检测水稻干尖线虫时具有极高的特异性。

实施例4水稻干尖线虫LAMP灵敏度检测

将单条水稻干尖线虫DNA模板按10倍梯度稀释成1.0×10^‐1～1.0×10^‐7个浓度，各取1μlDNA做模板，将上述的引物混合液和反应混合液混合均匀后，按2.3反应条件进行，反应结束后加入1μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图4A所示)，1～4管均可以看到绿色荧光。取2μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相（如图4中B所示），可以看出1～4泳道均有LAMP的特征性梯形带，灵敏度能达到1/10000头线虫。同时以上述稀释DNA为模板，以SCAR标记特异性引物（BSF:5’‐TCGATGAAGAACGCAGTGAATT‐3’(SEQIDNO.9)，BSR:5’‐AGATCAAAAGCCAATCGAATCAT‐3’(SEQIDNO.10)），进行常规PCR检测，体系如下：10×Buffer(Mg²⁺free)2.5μl，10mmol/LdNTP2μl，10mmol/LMgCl₂2μl，引物BSF和BSR(2.5μmol/L)各2μl，Taq酶(5U/μl，Takara)0.5μl，模板DNA1μl，灭菌ddH₂O补足至25μl。采用无线虫DNA模板为阴性对照。凝胶电泳观察结果（如图4中C所示）。结果表明常规在单条线虫DNA稀释到10^‐2倍时，能够观察到扩增条带，继续稀释时观察不到扩增条带。

以上结果说明：上述LAMP检测体系能够检测到1/10000头水稻干尖线虫，具有极高的灵敏度，比常规PCR检测灵敏100倍。

实施例5从带病稻粒中检测水稻干尖线虫

1)稻粒中线虫的分离

取带病水稻稻粒20～200粒，将谷粒与颖壳剥离，一同用砂布或滤纸包裹，放入盛有无菌水的漏斗中，浸泡12～24小时后，取漏斗底部水样获得线虫悬浮液。

2)线虫DNA的提取

将线虫悬浮液移入1.5ml离心管，在6000r.min^‐1转速下离心3分钟，弃上清；加入16μLddH₂O和2μL10×PCRBuffer(Mg²⁺free)到离心管中，将线虫悬浮液转移至0.2mL离心管中，放入液氮中冷冻1min后，置于95℃下2min，重复4～5次；向PCR管中加入2μL10mg/ml蛋白酶K，然后将离心管在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP检测。

3)水稻线虫干尖线虫LAMP检测

取1μLDNA模板，加入实施例2所述的检测溶液，总体积25μL，反应程序为62℃60min；扩增结束后加入显色剂（SYBRgreenI与PCR级DMSO以1：9体积比的混合），反应体系呈现绿色，以此判断稻粒中含有水稻干尖线虫（图5）。

参考文献

1.SalarJ,EbrahimP,AlizadehA,FaramarzA.IncidenceanddistributionofAphelenchoidesbesseyiinriceareasinIran.JournalofAgriculturalTechnology(2006),2(2):337‐344.

2.王迪轩,龙霞.水稻干尖线虫病的识别与综合防治.农药市场信息,2013:44.

3.EdwardC.Mcgawley,M.C.Rush,J.P.Hollis.OccurrenceofAphelenchoidesbesseyiinLouisianaRiceSeedandItsInteractionwithSclerotiumoryzaeinSelectedCultivars.JouralofNematology.1984,16(1):65‐68.

4.段旭光,段玉玺,王胜君等.辽宁省水稻品种种子携带干尖线虫的调查.植物保护,2008,34(3):95‐98.

5.裴艳艳,骆爱丽,谢辉等.中国不同地区水稻干尖线虫种群的繁殖特性研究.西北农林科技大学学报,2010,38(6):165‐170.

6.崔汝强,葛建军,胡学难等.水稻干尖线虫快速分子检测技术研究.植物检疫,2010,24(1):10‐12.

7.NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,AminoN,HaseT.Loop‐MediatedIsothermalAmplificationofDNA.NucleicAcidsResearch,2000,28(12):e63.

8.KikuchiT,AikawaT,OedaY,KarimN,KanzakiN.ARapidandPreciseDiagnosticMethodforDetectingthePinewoodNematodeBursaphelenchusxylophilusbyLoop‐MediatedIsothermalAmplification.Phytopathology,2009,99(12):1365‐1369.

9.NiuJH,GuoQX,JianH,ChenCL,YangD,LiuQ,GuoYD.RapiddetectionofMeloidogynespp.byLAMPassayinsoilandroots.CropProtection,2011,30(8):1063‐1069.

10.NiuJH,JianH,GuoQX,ChenCL,WangXY,LiuQ,GuoYD.Evaluationofloop‐mediatedisothermalamplification(LAMP)assaysbasedon5SrDNA‐IGS2regionsfordetectingMeloidogyneenterolobii.PlantPathology,2012,61(4):809‐819.

11.PengH,PengDL,HuXQ,HeXF,WangQ,HuangWK,HeWT.Loop‐mediatedisothermalamplificationforrapidandprecisedetectionoftheburrowingnematode,Radopholussimilis,directlyfromdiseasedplanttissues.Nematology,2012,14(8):977‐986.

Claims

1.一种用于水稻干尖线虫LAMP快速检测的引物组合物，其特征在于：由以下引物组成：AB1-F3：SEQIDNO.2，AB1-B3：SEQIDNO.3，AB1-BIP：SEQIDNO.4，AB1-FIP：SEQIDNO.5及AB1-LF：SEQIDNO.6。

2.权利要求1所述的引物组合物在检测和/或鉴定水稻干尖线虫中的应用。

3.权利要求1所述的引物组合物在制备水稻干尖线虫检测和/或鉴定试剂中的应用。

4.一种水稻干尖线虫检测试剂，其特征在于包含权利要求1所述的引物组合物。

5.一种水稻干尖线虫LAMP快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）提取待检样品DNA；

（2）以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增；

（3）LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤（2）所述LAMP扩增的反应体系为25μl，由

1）引物混合液：外引物AB1-F3和AB1-B3各0.2μmol/L，内引物AB1-FIP和AB1-BIP各0.8μmol/L,环引物AB1-LF为0.4μmol/L；

2）反应混合液：0.8mmol/LdNTP，pH8.8的20mmol/LTris-HCl，10mmol/LKCl，5mmol/LMgCl₂，10mmol/L(NH4)₂SO₄，0.1%Tritonx-100，0.2mol/L甜菜碱，8UBstDNA聚合酶大片段；

3）1μlDNA模板；

4）灭菌双蒸馏水组成。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤（2）所述LAMP扩增的反应条件为：61～65℃保温30～90min，85℃保温10min。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述的显色剂为SYBRgreenI与PCR级DMSO以1：9体积比的混合物。