CN104450892A

CN104450892A - 松材线虫及其近似种的通用检测引物及dna条形码分子鉴定方法

Info

Publication number: CN104450892A
Application number: CN201410656385.7A
Authority: CN
Inventors: 顾建锋; 何洁; 陈先锋
Original assignee: Ningbo Institute of Inspection and Quarantine Science Technology
Current assignee: Ningbo Institute of Inspection and Quarantine Science Technology
Priority date: 2014-11-18
Filing date: 2014-11-18
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明公开了松材线虫及其近似种的通用检测引物及DNA条形码分子鉴定方法，正向引物为AGT ACC GTG AGG GAA AGT TGA，反向引物为GCT ACT AGA TGG TTC GAT TAG TCT，该通用引物可针对线虫核糖体28S基因中的D2/D3进行扩增，然后将扩增产物测序，将测得的序列与建立的松材线虫及其近似种的序列标准数据库比对，根据28S基因DNA序列的差异，可以快速准确鉴定松材线虫及其近似种，在出入境植物检疫、国内林木检疫及森林线虫病害调查等方面都有广泛应用价值。

Description

松材线虫及其近似种的通用检测引物及DNA条形码分子鉴定方法

技术领域

本发明涉及松材线虫及其近似种的鉴定，具体涉及松材线虫及其近似种的通用检测引物及DNA条形码分子鉴定方法。

背景技术

松材线虫B. xylophilus（Steiner & Buhrer，1934）Nickle，1970是全球松林最具毁灭性的有害生物。该线虫起源于北美，在20世纪初通过从美国大量进境松木产品而传入日本，造成日本大量松树死亡。此后，该线虫于1982年传入我国，1988年传入韩国，1999年传入葡萄牙，2011年传入西班牙，均造成了巨大危害，引起了世界各国的高度重视。2000年前，人们知道的松材线虫及其近似种仅有3种，即松材线虫、拟松材线虫和伪伞滑刃线虫。目前松材线虫及其近似种至少已有14种：⑴松材线虫B. xylophilus（Steiner & Buhrer，1934）Nickle，1970；⑵伪伞滑刃线虫B. fraudulentus Rühm，1956（J. B. Goodey，1960）；⑶拟松材线虫B. mucronatus Mamiya & Enda，1979；⑷锥尾伞滑刃线虫B. conicaudatus Kanzaki，Tsuda & Futai，2000；⑸鲍嘉伞滑刃线虫B. baujardi Walia，Negi，Bajaj & Kalia，2003；⑹灰黄锦天牛伞滑刃线虫B. luxuriosae Kanzaki & Futai，2003；⑺豆伞滑刃线虫B. doui Braasch，Gu，Burgermeister & Zhang，2004；⑻新加坡伞滑刃线虫B. singaporensis Gu，Zhang，Braasch & Burgermeister，2005；⑼大尖尾伞滑刃线虫B. macromucronatus Gu，Zheng，Braasch & Burgermeister，2008；⑽杨伞滑刃线虫B. populi Tomalak & Filipiak，2010；⑾拟灰黄锦天牛伞滑刃线虫B. paraluxuriosae Gu,Wang,Braasch,2012；⑿日本冷杉伞滑刃线虫B. firmae Kanzaki等，2012；⒀韩国伞滑刃线虫B. koreanus，Gu等，2013；⒁吉拉尼伞滑刃线虫B. gillanii Schönfeld等，2013，除鲍嘉伞滑刃线虫尚没有分子生物学研究外，其它13种都有研究。随着人类认知的不断发展，松材线虫近似种不断被发现，之前关于松材线虫及其近似种的形态学和经典分子生物学方法，由于其适用范围小、需要丰富的鉴定经验已不能适应鉴定需要。公开号为CN101586160的发明专利申请，虽然公开了松材线虫的特异检测引物，但其只能对松材线虫进行DNA分子学鉴定，不能鉴别已知的其他松材线虫近似种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对松材线虫及其近似种进行快速、有效的鉴定的通用检测引物，也提供了快速、准确的松材线虫及其近似种DNA条形码鉴定方法。

本发明的技术方案如下：松材线虫及其近似种的通用检测引物，正向引物为5′-AGT ACC GTG AGG GAA AGT TGA-3′，反向引物为5′-GCT ACT AGA TGG TTC GAT TAG TCT-3′。引物是根据线虫核糖体28S基因，设计、筛选、验证得到。

利用上述通用检测引物用DNA条形码分子鉴定松材线虫及其近似种的方法，步骤如下：

a、DNA模板提取：将待测线虫放入内有10µL双蒸水和5µL 10×PCR缓冲液的PCR管中，液氮中放置1 mi n，取出后立即85℃加热2 min，然后向PCR管中加入浓度1 mg/mL的蛋白酶K1µL，56℃加热30 min，95℃加热10 min，得到DNA模板；

b、PCR扩增：50µL反应体系为10×PCR缓冲液 5µL，MgCl₂ 5µL，浓度10 mmol/L的dNTP液4µL，浓度40µmol/L的上游引物3µL，浓度40µmol/L的下游引物3µL，浓度5 U/µL的Taq聚合酶液0.6µL，DNA模板 5µL，ddH₂O 19.4µL；扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 S，55℃退火40 S，72℃延伸1 min，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸8 min，得到PCR产物；

c、电泳和测序：对PCR产物进行琼脂糖电泳分离，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，若条带清晰无杂，PCR产物的条带为770 bp左右，则测序；

d、鉴定：将测序结果用Mega生物软件将序列导入，将引物剪切后DNA片段组装，然后跟序列表中SEQ ID NO.3～ SEQ ID NO.16进行比对，如果所述DNA片段与序列表中SEQ ID NO.3～ SEQ IDNO.16中其中之一的序列同源性在98.2％以上，即可判断待测线虫即为同源性序列的该种线虫。

本发明的优点是松材线虫及其近似种的通用检测引物及DNA条形码分子鉴定方法，正向引物为AGT ACC GTG AGG GAA AGT TGA，反向引物为GCT ACT AGA TGG TTC GAT TAG TCT，该通用引物可扩增出线虫核糖体28S基因中的D2/D3区，然后将扩增产物测序，将测得的序列与建立的松材线虫及其近似种的序列标准数据库比对，根据该基因DNA序列的差异，从而达到快速、准确鉴定松材线虫及其近似种的目的，在出入境植物检疫、国内林木检疫及森林线虫病害调查等方面都有广泛应用价值。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

1. 木材或木质包装中线虫分离：将松木或木质包装样品（分别为样品1~6）锯成长约5-10 cm的木段，劈成宽约0.5 cm的木片。每批样品制样完成后对砧板、锯子、斧子等进行清扫，防止不同批次木质包装相互感染。将制备好的木片置改良线虫分离器中，加入适量清水，使水面浸没木片（如果木片杂质很多，可用水冲洗后浸泡；如果木片明显上浮，可用重物压一下）。25℃左右静置24 h，使线虫游离木片并逐渐沉到漏斗底部。然后用凹面皿接取线虫分离液约5-10 mL，静置20 min左右后置透射光解剖镜下检查。

2. 单条线虫DNA提取：挑取单条线虫样品（分别为样品1~6）放入200 µL PCR管中（已加有10µL双蒸水和5µL 10×PCR缓冲液），液氮中放置1 min （或-70℃放置0.5 h），取出后立即85℃加热2 min。然后向PCR管中加入1µL 1 mg/mL蛋白酶K，56℃加热30 min以上，95℃加热10 min，得到DNA模板。

3. 28S基因PCR扩增：正向引物为AGT ACC GTG AGG GAA AGT TGA，反向引物为GCT ACT AGA TGG TTC GAT TAG TCT。50µL反应体系为10×PCR-buffer 5µL，MgCl₂ 5µL，dNTP（10 mmol/L) 4µL，上游引物（40µmol/L）3µL，下游引物（40µmol/L）3µL，线虫DNA模板 5µL，Taq聚合酶（5 U/µL） 0.6µL，ddH₂O 19.4µL。扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 S，55℃退火40 S，72℃延伸1 min，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸8 min。

4. 电泳和测序：琼脂糖电泳验证PCR结果。如获得的PCR产物片段长度约为770 bp，且条带清晰无杂质，则表明PCR结果正常，可直接送生物测序公司进行测序。

5. 测序结果序列拼接：将测序结果用Mega生物软件将序列导入，将引物剪切后将序列组装，然后分别跟SEQ ID NO.3～ SEQ ID NO.16进行比对。样品1与SEQ ID NO.3同源率99.2％，为松材线虫；样品2与SEQ ID NO.5同源率98.7％，为拟松材线虫东亚亚种；样品3与SEQ ID NO.7同源率99.8％，为锥尾伞滑刃线虫；样品4与SEQ ID NO.9同源率99.9％，为豆伞滑刃线虫；样品5与SEQ ID NO.12同源率100％，为杨伞滑刃线虫；样品6与SEQ ID NO.6同源率99.9％，为拟松材线虫欧洲亚种。

本发明所阐述的实施例并不是对本发明的限定，依上述实施例也可以测出伪伞滑刃线虫、灰黄锦天牛伞滑刃线虫、新加坡伞滑刃线虫、大尖尾伞滑刃线虫、拟灰黄锦天牛伞滑刃线虫、日本冷杉伞滑刃线虫、韩国伞滑刃线虫、吉拉尼伞滑刃线虫，在此不一一列举。

<110> 宁波检验检疫科学技术研究院

<120> 松材线虫及其近似种的通用检测引物及DNA条形码分子鉴定方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

AGTACCGTGA GGGAAAGTTG A 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GCTACTAGAT GGTTCGATTA GTCT 24

<210>3

<211> 743

<212> DNA

<213> 松材线虫

<400> 3

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCCTT CTGGGCGCGT 100 GATTGGTGTT TGTGCATTGC CGCAAGGTGT GCCTGGCGCT ATTGTCGCGT 150 GTTCGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTTGT 200 CGGACGATGC GCGTTTAGAG GACCCGGGCT TCGGCGCTGG GAACCCTGGG 250 CGTGTGGAGT TCGGTTGGCG CTGCGCAGCT TTGTGGAGAC GTGGGTTTTT 300 CGCGTGCCGC GGTGTCGACA GGCTCGGTTC GGGTGGTACA CATGTGTGCA 350 GCCCTTATGG GGTCGGTCGG TGTTGTGGTG TGCTCTGCGT TCTTCCCGGT 400 GTTCAGTCGG TGACCCATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTT 450 TATGGTATGC GCAAGTCATT GGGTTTGTCG AAGCCTAAAG GCGTAATGAA 500 AGTGAGACAT TACTTGTCTG AACGTGACTG GGTGCGGCAT TCGTGCGGCC 550 CAAGCAACGT TGCCCCGTTT CGAGGACTTG TCCTGATGCG GAGGTTGAGC 600 GTATGCTATG AGACCCGAAA GATGGTGAAC TATGCCTGAA CAGGACGAAG 650 CCAGAGGAAA CTCTGGTGGA AGTCCGAAGC GGTTCTGACG TGCAAATCGA 700 TCGTCTGATT TTGGTATAGG GGCGCAAGAC TAATCGAACC ATC 743

<210> 4

<211> 743

<212> DNA

<213> 伪伞滑刃线虫

<400> 4

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCTGT CCGTTCGTGC 100 GATTGGGGTT TGTGCATTTC CGCAAGGTGT GTCTGGCCCC AGTGTCGTGC 150 GGTCGGTCGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTTGT 200 CGGACGAGGC GTGCTTAGAG GACCCGGGCT TCGGCGCTGG GAACCCTGGG 250 CGCGTGGAGT TCGGTTGGTG CTGCGCAGCT TTGTGGAGAC GTGGGCGTTG 300 CGCGTGCCGC GGTGTCGGTG GGCTCGGTTC GGGTGGTACA CATGTGTGCA 350 GCCCTTATGG GGTCGGTCGA TGTTGTGGTG TGCTCCGCGT TCTTCCCGGT 400 GTATAGTCGG TGACCCATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTT 450 TATGGTATGC GCAAGTCATT GGGTTTGTCG AAGCCTAAAG GCGTAATGAA 500 AGTGAGACAT TACTTGTCTG AACGTGACTG GGTGCGGCAC TCGTGCGGCC 550 CAAGCAACGT TGCCCCGTTT CGAGGACTTG TCCTGTTGCG GAGGTTGAGC 600 GTATGCTATG AGACCCGAAA GATGGTGAAC TATGCCTGAA CAGGACGAAG 650 CCAGAGGAAA CTCTGGTGGA AGTCCGAAGC GGTTCTGACG TGCAAATCGA 700 TCGTCTGATT TTGGTATAGG GGCGCAAGAC TAATCGAACC ATC 743

<210> 5

<211> 743

<212> DNA

<213> 拟松材线虫东亚亚种

<400> 5

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCCTT CTGGGCGTAC 100 GATTGGGGTT TGTGCATTTC CGCAAGGTGT GCCGGGTCCT ATTGTCGTGC 150 GTTCGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTTGT 200 CGGACGATGC GTGTTTAGAG GACCCGGGCT TCGGCGCTGG GAACCCTGGG 250 CGTGCGGAGT TCGGTTGGCG CTGCGCAGCT TTGTGGAGAC GTGGGTTTTT 300 CGCGTGCTGC GGTGTCGGCA GGCTCGGTTT GGGTGGTACA CATGTGTGCA 350 GCCCTTATCG GGTGGGTCGG TGTTGTGGTG TGCTCTACGT TCTTCCCGGT 400

GTTCAGTCGG TGACCCATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTT 450 TATGGTATGC GCAAGTCATT GGGTTTGTCG AAGCCTAAAG GCGTAATGAA 500 AGTGAGACAT TACTTGTCTG AACGTGACTG GGTGCGGCAC TCGTGCGGCC 550 CAAGCAACGT TGCCCCGTTT CGAGGACTTG TCCTGATGCG GAGGTTGAGC 600 GTATGCTATG AGACCCGAAA GATGGTGAAC TATGCCTGAA CAGGACGAAG 650 CCAGAGGAAA CTCTGGTGGA AGTCCGAAGC GGTTCTGACG TGCAAATCGA 700 TCGTCTGATT TTGGTATAGG GGCGCAAGAC TAATCGAACC ATC 743

<210> 6

<211> 743

<212> DNA

<213> 拟松材线虫欧洲亚种

<400> 6

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCCTT CTGGGCGTGC 100 GATTGGGGTT TGTGCATTTC CGCAAGGTGT GCCTGGCCTT ATTGTCGTGC 150 GTTCGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTTGT 200 CGGACGATGC GCGTTTAGAG GACCCGGGCT TCGGCGCTGG GAACCCTGGG 250 CGTGCGGAGT TCGGTTGGCG CTGCGCAGCT TTGTGGAGAC GTGGGTTTTT 300 CGCGTGCCGC GGTGTCGACA GGCTCGGTTC GGGTGGTACA CATGTGTGCA 350 GCCCTTATGG GGTCGGTCGG TGTTGTGGTG TGCTCTACGT TCTTCCCGGT 400 GTTCAGTCGG TGACCCATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTT 450 TATGGTATGC GCAAGTCATT GGGTTTGTCG AAGCCTAAAG GCGTAATGAA 500 AGTGAGACAT TACTTGTCTG AACGTGACTG GGTGCGGCAT TCGTGCGGCC 550 CAAGCAACGT TGCCCCGTTT CGAGGACTTG TCCTGATGCG GAGGTTGAGC 600 GTATGCTATG AGACCCGAAA GATGGTGAAC TATGCCTGAA CAGGACGAAG 650 CCAGAGGAAA CTCTGGTGGA AGTCCGAAGC GGTTCTGACG TGCAAATCGA 700 TCGTCTGATT TTGGTATAGG GGCGCAAGAC TAATCGAACC ATC 743

<210> 7

<211> 742

<212> DNA

<213> 锥尾伞滑刃线虫

<400>7

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGTCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCTTT CGGGCCGTGC 100 GATTGGGGCT TGTGCATTTC CGCAAGGTGT GCCTGGTTTC ATTGTCGTGC 150 GGTCGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTCGT 200 CGGACGAAGC GTGTTTAGAG GACCCGGCCT TCGGGCTGGG AACCCTGGGC 250 GCGTGGAGTT CGGTTGGCGC TGCGCAGCTT TGTGGAGACG TGGGTTTTTC 300 GCGCGCCGCG GTGTCGGTTG GCTCGGTTCG GGTGGTACAC ATGTGTGCAG 350 CCCTTATGGG GTCGGTCGGT GTTGTGGTGT GCTCTGCGTT CTTCCCGGTG 400

TATAGTCGGT GACCCATTCG ACCCGTCTTG AAACACGGAC CAAGGAGTTT 450 ATGGTATGCG CAAGTCATTG GGTTTGTCGA AGCCTAAAGG CGTAATGAAA 500 GTGAGACCGT ATTGGTCTGA ACGTGACTGG GTGCGGCATT CGTGCGGCCC 550 AAGCAACGTT GCCCCGTTTC GAGGACTTGT CCTGTTGCGG AGGTTGAGCG 600 TATGCTATGA GACCCGAAAG ATGGTGAACT ATGCCTGAAC AGGACGAAGC 650 CAGAGGAAAC TCTGGTGGAA GTCCGAAGCG GTTCTGACGT GCAAATCGAT 700 CGTCTGATTT TGGTATAGGG GCGCAAGACT AATCGAACCA TC 742

<210> 8

<211> 741

<212> DNA

<213> 灰黄锦天牛伞滑刃线虫

<400> 8

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCTTT TCGTTCGGTC 100 GATTGAGAGC AGTGTATTTC CGCAAGGTGT GCCTGTTTTT ATTGTCGGCT 150

GTTCGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTCGT 200 CGTGCGAAGC TCGTTTAGAG GACCCGGACT TCGGTTTGGG AACCCTGGGC 250 GGGTGGAGTT CGGTTGGTGC TGCGCAGCTT TGTGGAGACG TGGGTTTTTC 300 GCGTGCCGCG GTGTCGATTG GTCAGGTTTG GTTGGTTACA CATGTGTGCC 350 GGCCTTCTCG GGCTAGTCGG TGTTGTGGTG TGCTCTGCGT TCTTCCCGGT 400

GTATAGTCGG TGACCCATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTT 450 TATGGTATGC GCAAGTCATT GGGTTTTGAA GCCTAAAGGC GTAATGAAAG 500 TGAGACATTA CTTGTCTGAA CGTGACTGGG TGCGGCATTC GTGCGGCCCA 550 AGCAACGTTG CCCCGTTTCG AGGACTTGTC CTGATGCGGA GGTTGAGCGT 600 ATGCTATGAG ACCCGAAAGA TGGTGAACTA TGCCTGAACA GGACGAAGCC 650 AGAGGAAACT CTGGTGGAAG TCCGAAGCGG TTCTGACGTG CAAATCGATC 700 GTCTGATTTT GGTATAGGGG CGCAAGACTA ATCGAACCAT C 741

<210> 9

<211> 742

<212> DNA

<213> 豆伞滑刃线虫

<400> 9

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCAAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAACTTT CCGTTGGCGT 100 GATTGGGGTT TGTGCATTTC CGCAAGGTGT GCCTGGCTTC ATTGTCGCGT 150

CTTCGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTTGT 200 CGGACGAAGC GTGCGAAGAG GACCCGGCCT TCGGGTTGGG AACCCTGCGA 250 GCGTGGAGTT CGGTTGGCGC TGCGCAGCGT TGTGGAGACG TGGGTTTTTC 300 GCGTGCTGCG GTGTCGAGCG GTCCGGTTCG GGTGGTACAC ATGTGTGCAG 350 CCCTTATGGG ATTGGTCGGT GTTGTGGTGT GCTCTGCGTT CTTCCCGGTG 400

TATAGTCGGT GACCCATTCG ACCCGTCTTG AAACACGGAC CAAGGAGTTT 450 ATGGTATGCG CAAGTCATTG GGTTTGTCGA AGCCTAAAGG CGTAATGAAA 500 GTGAGACCTT ACTGGTCTGA ACGTGACTGG GTGCGGCATT CGTGCGGCCC 550 AAGCAACGTT GCCCCGTTTC GAGGACTTGT CCTGTTGCGG AGGTTGAGCG 600 TATGCTATGA GACCCGAAAG ATGGTGAACT ATGCCTGAAC AGGACGAAGC 650 CAGAGGAAAC TCTGGTGGAA GTCCGAAGCG GTTCTGACGT GCAAATCGAT 700 CGTCTGATTT TGGTATAGGG GCGCAAGACT AATCGAACCA TC 742

<210> 10

<211> 741

<212> DNA

<213> 新加坡伞滑刃线虫

<400> 10

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCCTT CTGGGCATGC 100

GATTGGGGTT CGTGTATTTC CGCAAGGTGT GCCGGGTCTT ATTGTCGTGT 150

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TCCTTATCGG GTTAGTCGGT GTTGTGGTGT GCTCTGCGTT CTTCCCGGTG 400

TATAGTCGGT GACCCATTCG ACCCGTCTTG AAACACGGAC CAAGGAGTTT 450 ATGGTATGCG CAAGTCATTG GGTTTGTCGA AGCCTAAAGG CGTAATGAAA 500 GTGAGACATT ACTTGTCTGA ACGTGATTGG GTGCGGCATT CGTGCGGCCC 550 GAGCAACGTT GCCCCGTTTC GAGGACTTGT CCTGATGCGG AGGTTGAGCG 600 TATGCTATGA GACCCGAAAG ATGGTGAACT ATGCCTGAAC AGGACGAAGC 650 CAGAGGAAAC TCTGGTGGAA GTCCGAAGCG GTTCTGACGT GCAAATCGAT 700 CGTCTGATTT TGATATAGGG CGCAAGACTA ATCGAACCAT C 741

<210> 11

<211> 740

<212> DNA

<213> 大尖尾伞滑刃线虫

<400> 11

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCCTT CTGGGCGTGC 100

GATTGGGGTT TGTGTATTTC CGCAAGGTGT ACCTGGCTTC ATTGTCGTGC 150

GTTCGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GTCGGGTCGT GTGGTGTTGT 200 CGGACGAAGC GTTTTTAGAG GACCCGGGTT TCGGCTTGGG AACCCTGAGG 250 GCGTGGAGTT CGGTTGGCGC TGCGCGGCTT TGTGGAGACG TGGGTTTTTC 300 GCGTGCCGCG GTGTCGATTG GCTCGGTTTT GGTGGTACAC ATGTGTGCAG 350 CCATTATGGG GTTTGTCGGT GTTGTGGCGT GCTCTGCGTT CTTCCCGATG 400

TATAGTCGGT GACCCATTCG ACCCGTCTTG AAACACGGAC CAAGGAGTTT 450 ATGGTATGCG CGAGTCATTG GGTTTTGAAG CCTAAAGGCG TAATGAAAGT 500 GAGACATTAC TTGTCTGAAC GTGACTGGGT GCGGCATTCG TGCGGCCCAA 550 GCAACGTTGC CCCGTTTCGA GGACTTGTCC TGATGCGGAG GTTGAGCGTA 600 TGCTATGAGA CCCGAAAGAT GGTGAACTAT GCCTGAACAG GACGAAGCCA 650 GAGGAAACTC TGGTGGAAGT CCGAAGCGGT TCTGACGTGC AAATCGATCG 700 TCTGATTTTG GTATAGGGGC GCAAGACTAA TCGAACCATC 740

<210> 12

<211> 742

<212> DNA

<213> 杨伞滑刃线虫

<400> 12

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCTTT CAGGCCATTC 100

GATTGGGGTT TGTGCATTTC CGCAAGGTGT GCCTGGCTTC ATTGTCGTGT 150

GGTCGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTCGT 200 CGGACGAAGC GTGCTTAGAG GACCCGGACT TCGGTTTGGG AACCCTGGTC 250 GCGTGTAGTT CGGTTGGTGC TGCGCAGCTT TGTGGAGACG TGGGTTAGTC 300 GCGTGCCGCG GTGTCGGTCG GTCCGGTTCG GGTGGTACAC ATGTGTGCAG 350 CCCTTATGGG GACGGTCGGT GTTGTGGTGT GCTCTGCGTT CTTCCCGGTG 400

TATAGTCGGT GACCCATTCG ACCCGTCTTG AAACACGGAC CAAGGAGTTT 450 ATGGTATGCG CAAGTCATTG GGTTTGTCGA AGCCTAAAGG CGCAATGAAA 500 GTGAGACATT ACTTGTCTGA ACGTGACTGG GTGCGGCATT CGTGCGGCCC 550 ATGCAACGTT GCCCCGTTTC GAAGATTCGT CTTGTTGCGG AGGTTGAGCG 600

TATGCTATGA GACCCGAAAG ATGGTGAACT ATGCCTGAAC AGGACGAAGC 650 CAGAGGAAAC TCTGGTGGAA GTCCGAAGCG GTTCTGACGT GCAAATCGAT 700 CGTCTGATTT TGGTATAGGG GCGCAAGACT AATCGAACCA TC 742

<210> 13

<211> 742

<212> DNA

<213> 拟灰黄锦天牛伞滑刃线虫

<400> 13

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCCTT TCGGGCAGTC 100 GATTGGGGGT TGTGCATTTC CGCAAGGTGT GCCTGCTTTC ATTGTCGGCG 150

GTCTGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTTGT 200 CGTGCGAAGC TGGTTTAGAG GACCCGAACT TCGGTTTGGG AACCCTGAGC 250 TGGTGGAGTT CGGTTGGTGC TGCGCAGCTT TGTGGAGACG TGGGTTTTTC 300 GCGTGCCGCG GTGTCGATTA GTCAGGTTTG GTTGGTACAC ATGTGTGCCG 350 GCCTTCTCGG GCTGGTCGGT GTTGTGGTGT GCTCTGCGTT CTTCCCGGTG 400

TATAGTCGGT GACCCATTCG ACCCGTCTTG AAACACGGAC CAAGGAGTTT 450 ATGGTATGCG CAAGTCATTG GGTTTGTCGA AGCCTAAAGG CGTAATGAAA 500 GTGAGACATT ACTTGTCTGA ACGTGACTGG GTGCGGCATT CGTGCGGCCC 550 AAGCAACGTT GCCCCGTTTC GAGAACTTGT TCTGATGCGG AGGTTGAGCG 600 TATGCTATGA GACCCGAAAG ATGGTGAACT ATGCCTGAAC AGGACGAAGC 650 CAGAGGAAAC TCTGGTGGAA GTCCGAAGCG GTTCTGACGT GCAAATCGAT 700 CGTCTGATTT TGGTATAGGG GCGCAAGACT AATCGAACCA TC 742

<210> 14

<211> 743

<212> DNA

<213> 日本冷杉伞滑刃线虫

<400> 14

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50

AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCCTT CTGGGCGGGT 100

GATTGAGGTT TGTGCATTTC CGCAAGGTGT GCCTGGCTTC ATTGTCGCAC 150

GTTCGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTTGT 200 CGGACGAGGC GCGTCTAGAG GACCCGGGCT TCGGCGCTGG GAACCCTGGG 250 CGTGTGGAGT TCGGTTGGCG CTGCGCAGCT TTGTGGAGAC GTGGGTTTTT 300 CGCGTGCCGC GGTGTCGACA CGCTCGGTTC GGGTGGTACA CATGTGTGCA 350 GCCCTTATGG TGTGGGTCGG TGTTGTGGTG TGCTCTACGT TCTTCCCGGT 400

GTTCAGTCGG TGACCCATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTT 450 TATGGTATGC GCAAGTCATT GGGTTTGTCG AAGCCTAAAG GCGTAATGAA 500 AGTGAGACAT TACTTGTCTG AACGTGACTG GGTGCGGCAT TCGTGCGGCC 550 CAAGCAACGT TGCCCCGTTT CGAGGACTTG TCCTGATGCG GAGGTTGAGC 600 GTATGCTATG AGACCCGAAA GATGGTGAAC TATGCCTGAA CAGGACGAAG 650 CCAGAGGAAA CTCTGGTGGA AGTCCGAAGC GGTTCTGACG TGCAAATCGA 700 TCGTCTGATT TTGGTATAGG GGCGCAAGAC TAATCGAACC ATC 743

<210> 15

<211> 742

<212> DNA

<213> 韩国伞滑刃线虫

<400> 15

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCCTT TTGGGCGCTC 100 GATTGGGGGC AGTGTATTTC CGCAAGGTGT GCCTGTCTTC TATGTCGGGT 150

GTTTGATTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTCGT 200 CGTGCGAGAC TTGTTTAGAG GACCCGGGCT TCGGTTTGGG AACCCTGAGC 250 GGGTGGAGTT CGGTTGGTGC TGCGCAGCTT TGTGGAGACG TGGGTTTTTC 300 GCGTGCCGCG GTGTCGGCTG GTTCGGTTTG GTTGGTACAC ATGTGTGCCG 350 GCCGTCTTGG GCCGGTCGGT GTTGTGGTGT GCTCTGCGTT CTTCCCGGTG 400

TATAGTCGGT GACCCATTCG ACCCGTCTTG AAACACGGAC CAAGGAGTTT 450 ATGGTATGCG CGAGTCATTG GGTTTGTCGA AGCCTAAAGG CGGAATGAAA 500 GTGAGACATT ACTTGTCTGA ACGTGACTGG GTGCAGCATT CGTGCGGCCC 550 AAGCAACGTT GCCCCGTTTC GAGGACTTGT CCTGATGCGG AGGTTGAGCG 600 TATGCTATGA GACCCGAAAG ATGGTGAACT ATGCCTGAAC AGGACGAAGC 650 CAGAGGAAAC TCTGGTGGAA GTCCGAAGCG GTTCTGACGT GCAAATCGAT 700 CGTCTGATTT TGGTATAGGG GCGCAAGACT AATCGAACCA TC 742

<210> 16

<211> 743

<212> DNA

<213> 吉拉尼伞滑刃线虫

<400> 16

AAAAGTACTT TGAAAAGAGA GTGCAAGAGA ACGTGAAACC GGTGTAATGG 50 AAGCGAATGG AGCCGACGTA TCTAGTGCGT ATTCAGCCGG CGGGGCGTGC 100 GATTGGGGTT TGTGTACTTC CGCAAGGTGT GCCGGGCCCT ATTGTCGTGC 150 GTTCGGTTGG TGCATTTGCG TACGGAGTGC GCCGGGTTGT GTGGTGTTGT 200 CGGACGATGC GCGTTTAGAG GACCCGGGCT TCGGCGCTGG GAACCCTGGA 250 CGTGTGGAGT TCGGTTGGCG CTGCGTAGCT TTGTGGAGAC GTGGGTTTTT 300 CGCGTACCGC GGTGTCGGCA GGCTCGGTTT GGGTGGTACA CATGTGTGCA 350 GCCCTTATGG GGTCGGTCGG TGTTGTGGTA TGCTCTACGT TCTTCCCGGT 400

GTGTAGTCGG TGACCCATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTT 450 TATGGTATGC GCAAGTCATT GGGTTTATCG AAACCTAAAG GCGTAATGAA 500

AGTGAGACAT TACTTGTCTT AACGTGACTG GGTGCGGCAT TCGTGCGGCC 550 CAAGCAACGT TGCCCCGTTT CGAGGACTTG TCCTGATGCG GAGGTTGAGC 600 GTATGCTATG AGACCCGAAA GATGGTGAAC TATGCCTGAA CAGGACGAAG 650 CCAGAGGAAA CTCTGGTGGA AGTCCGAAGC GGTTCTGACG TGCAAATCGA 700 TCGTCTGATT TTGGTATAGG GGCGCAAGAC TAATCGAACC ATC 743

Claims

1.松材线虫及其近似种的通用检测引物，其特征在于正向引物为AGT ACC GTG AGG GAA AGT TGA，反向引物为GCT ACT AGA TGG TTC GAT TAG TCT。

2.利用权利要求1所述的松材线虫及其近似种的通用检测引物，用DNA条形码分子鉴定松材线虫及其近似种的方法，其特征在于步骤如下：

a、DNA模板提取：将待测线虫放入内有10µL双蒸水和5µL 10×PCR缓冲液的PCR管中，液氮中放置1 mi n，取出后立即85℃加热2 min，然后向PCR管中加入浓度1 mg/mL蛋白酶K1µL，56℃加热30 min，95℃加热10 min，得到DNA模板；

b、PCR扩增：50µL反应体系为10×PCR-缓冲液 5µL，MgCl₂ 5µL，浓度10 mmol/L的dNTP液4µL，浓度40 µmol/L的上游引物 3µL，浓度40 µmol/L的下游引物3µL，浓度5 U/µL 的Taq聚合酶液0.6µL，DNA模板 5µL，ddH₂O 19.4µL；扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 S，55℃退火40 S，72℃延伸1 min，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸8 min，得到PCR产物；

d、鉴定：将测序结果用Mega生物软件将序列导入，将引物剪切后DNA片段组装，然后跟序列表中SEQ ID NO.3～ SEQ ID NO.16进行比对，如果所述DNA片段与序列表中SEQ ID NO.3～ SEQ IDNO.16中其中之一的序列同源性在98.2％以上，即可判断待测线虫即为该种线虫。