CN103911457B - 鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法 - Google Patents

鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法，涉及生物技术领域。鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物，由一个引物对和一个探针组成；所述引物对由SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:3所示。本发明鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物，可以快速、准确、高效、可靠地对成虫、蛹、幼虫和卵进行鉴定，判别是否为美国白蛾。本发明方法的特异性强，可以将美国白蛾与其他形态近似种区分开来。本发明方法灵敏度高，检出最低限可以达到0.25pg/μl总DNA。

Description

鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法。
背景技术
美国白蛾Hyphantriacunea(Drury)属鳞翅目灯蛾科，原产北美，广泛分布于美国北部，加拿大南部和墨西哥，后随交通工具传入欧洲、日本、朝鲜。1979年，在我国辽宁丹东首次发现美国白蛾，目前已蔓延至辽宁、陕西、河北、山东、天津、北京等省市。美国白蛾食性杂、食量大、繁殖力强、寄主范围极广，其寄主在美国、欧洲、日本、朝鲜超过600种，在我国的寄主植物已达49科108属175种，主要危害阔叶林木、果树、农作物，以幼虫取食树叶，造成严重的经济损失，是一种毁灭性害虫，也是《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》规定的检疫性害虫。
在形态上美国白蛾与灯蛾科杨雪毒蛾、红缘污灯蛾、八点灰灯蛾、人纹污灯蛾、净雪灯蛾、净白污灯蛾、星白雪灯蛾、稀点雪灯蛾、白雪灯蛾（如图1）等种类在成虫体色和形态上非常相似不易鉴别，幼虫、蛹、卵更难以区分。国家标准GB/T23474-2009《美国白蛾检疫技术规程》中详细阐述了美国白蛾各个虫态的形态学鉴定方法，并列举了类似美国白蛾的7种灯蛾科和毒蛾科雄成虫外生殖器检索表。美国白蛾成虫、幼虫、蛹都能随果品及包装材料而传播扩散，口岸截获后，如果采用形态学鉴定方法，鉴定时间过长，结果不够准确。
发明内容
本发明的目的是提供鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物，采用该组合物可以快速准确地鉴定美国白蛾。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物，由一个引物对和一个探针组成；所述引物对由SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
在本发明中，所述探针的5’末端标记有荧光报告基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团NFQ。
本发明还提供所述组合物在制备用于检测或辅助检测待测样品中是否为美国白蛾的试剂盒中的应用。
本发明还提供用于检测美国白蛾的试剂盒，包含所述引物对和探针。
本发明还提供所述组合物在检测或辅助检测待测样品是否为美国白蛾中的应用。
另外，本发明还提供检测或辅助检测待测样品是否为美国白蛾的方法，包括如下步骤：以待测样品中提取的总DNA为模板，采用所述组合物，或所述试剂盒进行实时荧光PCR检测，从而确定所述样品是否为美国白蛾。
在本发明中，所述引物对中的引物及探针的摩尔浓度之比为2:2:1。
在本发明中，所述PCR体系为：TaqManmix混合反应液10μl，上游引物为0.5μl，下游引物为0.5μl，探针为0.25μl，DNA模板1μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.1μl，加ddH2O补足到20μl。
在本发明中，所述反应程序为：50℃2min，95°C预变性10min；进入循环，95°C15s，60°C60s，共40个循环。
有益效果
通过对美国白蛾与其他形态相似蛾类的COI基因进行比对发现，设计了鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物。本发明鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物，可以快速、准确、高效、可靠地对成虫、蛹、幼虫和卵进行鉴定，判别是否为美国白蛾。本发明方法的特异性强，可以将美国白蛾与其他形态近似的杨雪毒蛾、红缘污灯蛾、八点灰灯蛾、人纹污灯蛾、净雪灯蛾、净白污灯蛾、星白雪灯蛾、稀点雪灯蛾、白雪灯蛾区分开来。本发明方法灵敏度高，检出最低限可以达到0.25pg/μl总DNA。本发明鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法对美国白蛾的口岸侦测、国内发生检测和控制，具有十分重要的意义与作用。
附图说明
图1虫样的形态图片。
图2美国白蛾及其近似种样品PCR扩增产物的电泳图（部分样品），其中M为Marker；1-12分别为编号为HC01、HC04、YX01、YX02、HY01、HY02、BDH01、RWW01、JX05、JX06、XB01、BX01的虫样的PCR扩增产物电泳图。
图3显示特异性引物探针位置示意图。
图4实时荧光PCR特异检测美国白蛾荧光图，其中基线上方曲线1-4分别为美国白蛾(HC01)、美国白蛾(HC02)、美国白蛾(HC03)、美国白蛾(HC04)的扩增曲线；基线下方的曲线5-24分别为杨雪毒蛾（YX01）、杨雪毒蛾（YX02）、杨雪毒蛾（YX03）、红缘污灯蛾（HY01）；、红缘污灯蛾（HY02）、红缘污灯蛾（HY03）、八点灰灯蛾（BDH01）、八点灰灯蛾（BDH02）、人纹污灯蛾（RWW01）、人纹污灯蛾（RWW02）、人纹污灯蛾（RWW03）、净雪灯蛾（JX05）、星白雪灯蛾（XB01）、星白雪灯蛾（XB02）、星白雪灯蛾（XB03）、净白污灯蛾（JX06）、净白污灯蛾（JX07）、稀点雪灯蛾（XD01）、白雪灯蛾（BX01）和阴性对照。
图5实时荧光PCR检测美国白蛾的灵敏度结果，其中扩增曲线1-2的模板浓度为2.5ng/μl，扩增曲线3-4的模板浓度为0.25ng/μl；扩增曲线5-6的模板浓度为:25pg/μl；扩增曲线7-8的模板浓度为2.5pg/μl；扩增曲线9-10的模板浓度为0.25pg/μl。
具体实施方式
TaqDNA聚合酶购自大连TaKaRa公司。
普通PCR扩增试剂购自大连TaKaRa公司。EpgradientS仪购自德国Eppendorf公司。
实时荧光PCR试剂（包括TaqManmix混合反应液）购自英潍捷基（上海）贸易有限公司。
GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒购自北京金麦格生物技术有限公司。
引物HC-F、HC-R和MGB探针由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
本发明所用虫样信息详见表1。
表1实验用虫样信息
编号 名称 拉丁名 采集地 采集时间 Genbank登录号
HC01 美国白蛾 Hyphantria cunea 青岛 2013 KJ562194
HC02 美国白蛾 Hyphantria cunea 青岛 2011 KJ562195
HC03 美国白蛾 Hyphantria cunea 连云港 2011 KJ562196
HC04 美国白蛾 Hyphantria cunea 口岸截获 2011 -
YX01 杨雪毒蛾 Stilpnotia candida 安徽黄山 2009 KJ562201
YX02 杨雪毒蛾 Stilpnotia candida 西安 2011 -
YX03 杨雪毒蛾 Stilpnotia candida 南京江浦 2009 KJ562202
HY01 红缘污灯蛾 Amsacta lactinea 南京江浦 2010 KJ562189
HY02 红缘污灯蛾 Amsacta lactinea 南京江浦 2010 KJ562190
HY03 红缘污灯蛾 Amsacta lactinea 浙江 2009 KJ562191
BDH01 八点灰灯蛾 Creatonotus transiens 南京江浦 2008 KJ562192
BDH02 八点灰灯蛾 Creatonotus transiens 南京江浦 2009 KJ562193
RWW01 人纹污灯蛾 Spilarctia subcarnea 南京江浦 2011 KJ562197
RWW02 人纹污灯蛾 Spilarctia subcarnea 南京江浦 2011 KJ562198
RWW03 人纹污灯蛾 Spilarctia subcarnea 江苏溧阳 2011 KJ562199
JX05 净雪灯蛾 Spilosoma album 安徽黄山 2008 KJ562203
JX06 净白污灯蛾 Spilarctia album 南京江浦 2009 KJ562204
JX07 净白污灯蛾 Spilarctia album 南京江浦 2009 -
XB01 星白雪灯蛾（黄腹型） Spilosoma menthastri 安徽黄山 2009 KJ562200
XB02 星白雪灯蛾（黄腹型） Spilosoma menthastri 安徽黄山 2009 -
XB03 星白雪灯蛾（红腹型） Spilosoma menthastri 浙江 2010 -
XD01 稀点雪灯蛾 Spilosoma urticae 河北保定 2012
BX01 白雪灯蛾 Spilosoma niveus 河北保定 2012 -
实施例1本发明鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物
使用鳞翅目通用引物LepF1/LepR1(Hebert,2003)扩增样品的COI基因片段并测序（部分登录到Genbank），序列运用MEGA5.02进行比对分析，根据差异位点设计美国白蛾特异性的引物HC-F/HC-R和MGB探针/HC-TZ。
提取总DNA
采用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒，采用如下方法提取虫样的总DNA：剪取供试标本足和胸部30~90mg放入试管，加小钢球，用MM400球磨仪以15r/s的频率研磨2min；加入540μLLysisBuffer和60μL蛋白酶K，24℃孵育3h，37℃孵育3h，13000r/min离心5min，取上清液300μL于1.5mL离心管中；加入300μLBindingBuffer和300μL无水乙醇，充分混匀，加入30μL磁珠，轻柔颠倒混匀15min，离心管置于磁力架，吸弃管内液体，保留磁珠；加入750μLWashBufferⅠ轻柔颠倒混匀2min置于磁力架，吸弃管内液体，加入750μLWashBufferⅡ洗涤两次（方法同WashBufferⅠ），离心管置于磁力架上；缓慢加入825μLWashBufferⅢ，1min后充分吸弃管内液体；加入ElutionBuffer100μL，50℃孵育10min洗脱磁珠上吸附的DNA，离心管置于磁力架上，吸取管内液体，作为虫样的总DNA，4℃储存备用。
扩增COI基因片段
用通用引物LepF1和LepR1(Hebert,2003)对供试样本进行PCR反应扩增COI基因并测序，同时检测其DNA模板是否完整。
普通PCR扩增在EpgradientS仪上进行。采用25μL标准反应体系：25mmol/L的MgCl2为2μL，10×反应缓冲液2.5μL，10mmol/L的dNTPs2μL，TaqDNA聚合酶1U，上游引物LepF1为0.5μL，下游引物LepR1为0.5μL（上海金斯瑞有限公司合成），虫样的总DNA模板1μL，后加ddH2O至终体积25μL。反应条件为：5个循环的预扩增；94℃变性40s，51℃退火40s，72℃延伸1min，循环35次；最后在72℃下延伸5min。5个循环的预扩增具体程序为：94℃预变性1min；94℃变性40s，45℃退火40s，72℃延伸1min，共循环5次。取5μLPCR产物，采用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析检测。将含有目的条带的PCR产物直接送到南京金斯瑞有限公司双向测序。
其中LepF1的序列为TCCACTAATCACAARGATATTGGTAC（SEQIDNO:4）；LepR1的序列为GAAAATCATAATGAAGGCATGAGC（SEQIDNO:5）。
扩增结果
用通用引物LepF1和LepR1(Hebert,2003)对供试样本进行PCR反应，扩增产物的电泳图如图2。从图2可以看出，各供试样本PCR产物在700bp左右均有条带出现。
申请人将各虫样COI基因进行比对，设计特异性引物（HC-F和HC-R）和MGB探针，其中HC-F的序列为GGGTCGAAAAATGATGTATTTAAATTTC（SEQIDNO:1），HC-R的序列为GGAATTACAGCTTTTCTATTACTTCTTTCTC（SEQIDNO:2）；MGB探针的核苷酸序列为AAGTATGGTAATAGCTC（SEQIDNO:3），5’末端标记有荧光报告基团FAM，3’末端标记有荧光淬灭基团NFQ。MGB探针位置示意图如图3所示。
实施例2本发明组合物用于鉴定美国白蛾的实时荧光PCR方法建立
1.提取美国白蛾的总DNA
按照实施例标题1中方法提取表1中各供试虫样的DNA。
实时荧光PCR反应体系的建立及优化
用引物HC-F、HC-R和MGB探针对美国白蛾进行实时荧光PCR检测。
PCR反应体系：总体积为20μl，组成如下：5U/μl的TaqDNA聚合酶0.1μl，6.75ng/μl模板DNA1μl，TaqManmix混合反应液10μl，上游引物HC-F浓度从100nmol/L到1000nmol/L（以50nmol/L递增），下游引物HC-R浓度从100nmol/L到1000nmol/L（以50nmol/L递增），MGB探针浓度从50nmol/L到500nmol/L（以25nmol/L递增），对引物和探针浓度进行不同的配比试验。根据Ct值和曲线形态，确定最佳浓度以及配比。
荧光PCR循环参数的优化
针对ABI7500型实时荧光定量PCR仪，对退火温度、循环参数进行了优化试验，以期达到最佳扩增效率。
结果
反应体系最终确定为：总体系20μl，各组分加入量分别为：TaqManmix混合反应液10μl，500nmol/L上游引物HC-F为0.5μl，500nmol/L下游引物HC-R为0.5μl，250nmol/LMGB探针为0.25μl，6.75ng/μl的模板1μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.1μl，加ddH2O补足到20μl。反应程序为：50℃2min，95°C预变性10min；进入循环，95°C15s，60°C60s，共40个循环。
实施例3本发明用于鉴定美国白蛾的实时荧光PCR方法的特异性
1.提取虫样总DNA
按照实施例标题1中方法提取表1中各供试虫样的DNA。
实时荧光PCR反应
以各供试虫样DNA为模板，进行实时荧光PCR反应。反应体系为：TaqManmix混合反应液10μl，500nmol/L上游引物HC-F为0.5μl，500nmol/L下游引物HC-R为0.5μl，250nmol/L探针HC-TZ为0.25μl，6.75ng/μl模板1μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.1μl，加ddH2O补足到20μl。反应程序为：50℃2min，95°C预变性10min；进入循环，95°C15s，60°C60s，共40个循环。
结果
结果见图4，美国白蛾的4个样本都出现了荧光信号，而杨雪毒蛾、红缘污灯蛾、八点灰灯蛾、人纹污灯蛾、净雪灯蛾、净白污灯蛾、星白雪灯蛾、稀点雪灯蛾、白雪灯蛾的DNA扩增产物没有荧光信号，表明该引物探针和荧光PCR方法能够对美国白蛾进行特异性的扩增。
实施例4本发明用于鉴定美国白蛾的实时荧光PCR方法的灵敏度
1.提取虫样总DNA
按照实施例标题1中方法提取美国白蛾的DNA。调整美国白蛾的DNA浓度依次为2.5ng/μl、0.25ng/μl、25pg/μl、2.5pg/μl和0.25pg/μl，分别加入到荧光PCR反应体系中，进行灵敏度检测。每个梯度做2个平行，3次重复试验。
结果
实时荧光PCR灵敏度检测结果见图5。美国白蛾的所有测试浓度都出现荧光检测信号，Ct值与DNA模板浓度相关。模板浓度为2.5ng/μl、0.25ng/μl、25pg/μl、2.5pg/μl、0.25pg/μl时，扩增的Ct值分别为18.1，21.8，25.4，29.2，32.9。在0.25pg/μl的浓度下荧光PCR扩增曲线明显，两个平行样间的Ct值分别为33.1和32.7，体现了良好重复性，表明该方法的检测下限在0.25pg/μl以下。上述结果说明，采用引物HC-F/HC-R和探针HC-TZ能够对0.25pg/μl以上浓度的样本进行稳定的扩增，重复性实验结果相一致，表明采用上述引物和探针对美国白蛾的检测灵敏度为0.25pg/μl。
SEQUENCELISTING
<110>江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
<120>鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法
<130>20140422
<160>5
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HC-F
<400>1
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<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>HC-R
<400>2
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<210>3
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<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>MGB探针的核苷酸序列
<400>3
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<210>4
<211>26
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<223>LepF1
<400>4
tccactaatcacaargatattggtac26
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<211>24
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>LepR1
<400>5
gaaaatcataatgaaggcatgagc24

Claims (9)

1.鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物，由一个引物对和一个探针组成；所述引物对由SEQIDNO:1所示DNA和SEQIDNO:2所示DNA组成；所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
2.根据权利要求1所述鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物，其特征在于所述探针的5’末端标记有荧光报告基团FAM，3’末端标记有荧光淬灭基团NFQ。
3.权利要求1-2中任一项所述组合物在制备用于检测或辅助检测待测样品是否为美国白蛾的试剂盒中的应用。
4.用于检测美国白蛾的试剂盒，包含权利要求1-2之一所述组合物。
5.权利要求1-2中任一项所述组合物在检测或辅助检测待测样品是否为美国白蛾中的应用。
6.检测或辅助检测待测样品是否为美国白蛾的方法，包括如下步骤：以待测样品中提取的总DNA为模板，采用权利要求1-2任一项所述组合物，或权利要求4所述试剂盒进行实时荧光PCR检测，从而确定待测样品是否为美国白蛾。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于PCR体系中，所述引物对中的引物与所述探针的摩尔浓度之比为2:2:1。
8.根据权利要求6或7所述方法，其特征于所述PCR体系为：TaqManmix混合反应液10μl，SEQIDNO:1的引物为0.5μl，SEQIDNO:2的引物为0.5μl，探针为0.25μl，DNA模板1μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.1μl，加ddH2O补足到20μl。
9.根据权利要求8所述方法，其特征于反应程序为：50℃2min，95°C预变性10min；进入循环，95°C15s，60°C60s，共40个循环。
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美国白蛾基因水平研究进展;吴晶等;《安徽农业科学》;20131231;13890-13892 *

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