CN101928779B - 油菜茎基溃疡病菌实时荧光pcr分子检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
油菜茎基溃疡病菌实时荧光pcr分子检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101928779B CN101928779B CN2010190260633A CN201019026063A CN101928779B CN 101928779 B CN101928779 B CN 101928779B CN 2010190260633 A CN2010190260633 A CN 2010190260633A CN 201019026063 A CN201019026063 A CN 201019026063A CN 101928779 B CN101928779 B CN 101928779B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- real
- time fluorescence
- fluorescence pcr
- probe
- foot ulcer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR分子检测试剂盒，包含基因表达通用混合试剂、ddH2O、探针与引物混合物及阳性对照。探针与引物混合物包含5μmol·L-1的LMpro探针、18μmol·L-1的LMf上游引物和18μmol·L-1的LMr下游引物；阳性对照为浓度为100ng/μL的油菜茎基溃疡病菌DNA溶液。本试剂盒可直接对油菜籽或植株病残体检测，快速、灵敏、准确、重复性好，尤其可用于检测病原菌含量较低的样品，特别适合对进出境油菜籽等十字花科作物的种子、植株及病残体中油菜茎基溃疡病菌的快速检测，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans(Desm.)Ces.& de Not.实时荧光PCR(或称Real-time PCR)分子检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
油菜茎基溃疡病Leptosphaeria maculans(Desm.)Ces.& de Not.是油菜(Brassicanapus Linn)生产过程中的一种毁灭性病害。该病原菌的主要自然寄主为油菜，甘蓝，大白菜等十字花科的作物。该病害在田间可造成幼苗的死亡，成株倒伏、早衰，严重危害着大田作物油菜籽的产量和品质。该病可以在多种气候条件、不同栽培措施下发生和流行，一般年份产量损失大约在10-20％，重灾年份的损失可达30-50％。在加拿大，即使采取了严格的控制措施，该病害每年仍造成了该国油菜籽3亿多美元的损失；在英国每年的损失达5600万欧元。据统计，每年由于该病原菌造成的损失在澳大利亚、欧洲及北美等世界主要油菜产区，所造成的经济损失每年要高达9亿美元左右。
该病原菌目前在世界范围油菜主产区如加拿大、澳大利亚、美国等油菜籽主要生产国广泛分布。目前，我国只有油菜黑胫病(L.biglobosa)的发生报道，尚无油菜茎基溃疡病的发生和分布。
油菜茎基溃疡病菌可随感病的植株、病残体及种子进行远距离传播。种子的带菌率通常为0.1-5％，由此导致田间植株发病率为0.1-19％。该病原菌可以假囊壳和菌丝的形式在病残体中越冬和越夏，也可以休眠菌丝的形式藏在种皮内。在田间，该病原菌主要通过子囊孢子和分生孢子进行扩散。
油菜是我国主要油料作物，种植面积约800万公顷，占全国油料作物总面积的40％以上，油菜籽的产量占全国油料总产量的30％以上，居世界首位。油菜在中国广泛种植，且气候条件与该病原菌发生地的气候条件相似，因此，作为油菜茎基溃疡病菌的主要自然寄主，其病原菌传入、定殖和扩散的可能性都很大，我国已将该病菌列入“中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录”。目前，检疫口岸多利用传统的形态学方法和常规PCR技术来检测该病原菌，检测不够灵敏、快速。
发明内容
本发明的目的是提供一种适宜于检疫口岸快速检测使用的油菜茎基溃疡病菌Real-time PCR分子检测的试剂盒，以便于快速、灵敏、准确地对口岸进口的油菜籽进行油菜茎基溃疡病菌的检测。
本发明油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR分子检测试剂盒，包括如下试剂：
基因表达通用混合试剂；
ddH2O；
探针与引物混合物，包含5μmol·L-1的LMpro探针、18μmol·L-1的LMf上游引物和18μmol·L-1的LMr下游引物；
阳性对照：浓度为100ng/μL的油菜茎基溃疡病菌DNA溶液；
所说的LMf上游引物序列为5’-GTTTCCTTGGTGGGCTTGC-3’，
所说的LMr下游引物序列为5’-TGTTACTGACGCTGACTGCAATT-3’，
所说的LMpro探针序列为5’FAM-ATTGGATCCCCTAAAACC-NFQ-MGB3’，
其中，FAM为荧光报告基团，NFQ(Non-Fluorescent Quencher)为非荧光淬灭基团，MGB(Minor Groove Binder)为修饰基团。
本试剂盒中的基因表达通用混合试剂采用
Gene Expression Master Mix(美国应用生物系统公司产品)，包含超纯AmpliTaq
DNA聚合酶，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)，带有脱氧尿嘧啶核苷酸(dUTP)的脱氧核糖核苷酸(dNTP)，ROXTM内参染料以及优化的PCR缓冲液。
利用本发明油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR分子检测试剂盒检测油菜茎基溃疡病菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)实时荧光PCR反应：
以所得样品DNA为模板，进行实时荧光PCR反应；实时荧光PCR反应体系含有：10μL的基因表达通用混合试剂，1μL探针与引物的混合物，2μL样品DNA，7μL的ddH2O，反应总体积为20μL；实时荧光PCR的反应条件为：95℃反应10min；95℃反应15sec，60℃反应60sec，共40个循环；
(3)结果分析：
实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR仪分析软件，对扩增的图谱进行分析，当初始循环数(CT)≤35时，判定实时荧光PCR反应为阳性，表示所检测的样品中含有油菜茎基溃疡病菌。
本发明试剂盒用于油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测，可针对该病原菌以种子或病残体传播的特点，直接对油菜籽或植株病残体进行检测，与传统的形态学鉴定方法和常规PCR方法相比，具有快速、灵敏、准确、重复性好等优点，尤其可准确检出样品中含量较低的病原菌，特别适合对进出境对油菜籽等十字花科作物的种子、植株及病残体中油菜茎基溃疡病菌的快速检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是油菜茎基溃疡病菌Realtime PCR扩增曲线。
图2是油菜茎基溃疡病菌Realtime PCR特异性反应扩增曲线。
图3是油菜茎基溃疡病菌Realtime PCR灵敏度检测扩增曲线。
图4是油菜茎基溃疡病菌Realtime PCR灵敏度检测标准曲线。
具体实施方式
实施例1油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR分子检测试剂盒
组成为：
阳性对照为100ng/μL的油菜茎基溃疡病菌DNA溶液(菌株：200782，美国菌种保藏中心ATCC)；
上述油菜茎基溃疡病菌MGB探针与引物的设计和合成：
通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)油菜茎基溃疡病菌核糖体RNA(r RNA)基因(基因登录号：DQ133891、AJ550889、AJ550885)和其近似种油菜黑胫病菌B型种(L.biglobosa)r RNA基因(NCBI基因登录号：FJ172238、AM410082、DQ133893、AJ550871)进行比对后，根据油菜茎基溃疡病菌r RNA内转录间隔区(ITS：internal transcriptionspacer 1)ITS1基因的保守序列，设计如下一对寡核苷酸引物和
MGB探针：
上游引物LMf序列为5’-GTTTCCTTGGTGGGCTTGC-3’；
下游引物LMr序列为5’-TGTTACTGACGCTGACTGCAATT-3’；
探针LMpro序列为5’FAM-ATTGGATCCCCTAAAACC-NFQ-MGB3’，
其中，FAM为荧光报告基团，NFQ(Non-Fluorescent Quencher)为非荧光淬灭基团，MGB(Minor Groove Binder)为修饰基团。
其预期的扩增产物大小为72bp；以上
MGB探针与PCR引物由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)合成。
实施例2油菜茎基溃疡病菌的检测
1、用于检测的油菜茎基溃疡病菌菌株样品(共七个样品)，分别为：
200782(美国菌种保藏中心ATCC)、J-2、J-4、J-9、J-11(从加拿大油菜籽中分离到的油菜茎基溃疡病菌)、A-7(从澳大利亚油菜籽中分离到的油菜茎基溃疡病菌)、UK-20(英国油菜茎基溃疡病菌，安徽省农科院作物研究所惠赠)。
2、油菜茎基溃疡病菌DNA的制备：
取各样品培养的油菜茎基溃疡病菌菌丝或菌丝块少量，分别加入液氮充分研磨成粉状物后，利用真菌DNA提取试剂盒(
plant mini kit，QIAGEN公司产品)制备各菌株的DNA。
3.实时荧光PCR反应
荧光PCR反应体系共20μL，包括：
Gene Expression Master Mix 10μL，
MGB探针及引物Mix 1μL，DNA模板2μL和ddH2O 7μL，进行实时荧光PCR反应，反应条件为：95℃反应10min；95℃反应15sec，60℃反应60sec，40个循环。
4.结果分析
实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光7500FAST PCR仪分析软件，对扩增的图谱进行分析，当初始循环数(CT)≤35时，判定实时荧光PCR反应为阳性。检测结果的扩增图谱如图1。图1表明，参试的七个油菜茎基溃疡病菌菌株均有良好的扩增曲线，CT值从左到右分别为16.9(200782)、20.23(J-9)、21.84(J-4)、22.36(J-11)、22.94(J-2)、24.32(A-7)和25.77(UK-20)，表示实时荧光PCR反应结果均为阳性。
实施例3油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR反应的特异性试验
1.参试菌株
近似种油菜黑胫病菌(L.biglobosa)菌株6个，其中2-2、9-4、12-2、19-3四个菌株均为安徽省农科院作物研究所李强生老师惠赠；CK6和CK8为从加拿大油菜籽中分离到的油菜黑胫病菌(L.biglobosa)；一个近似种草茎点病菌(Phoma herbarum)和一个种腐病菌(Phomopsis longicolla)；从加拿大油菜籽中分离到的其他病菌5株，分别为CK3(Leptosphaerulina chartarum)、CK7(Alternaria alternata)、CK9(Alternariaoregonenis)、CK12(芸苔交链孢菌Alternaria brassicae)和CK13(串孢镰刀菌Fusarium proliferatum)；另外，阳性对照为油菜茎基溃疡病菌(ATCC：200782)；总共14个菌株。
2.制备参试菌株的DNA
取少量培养的参试菌株菌丝或菌丝块，加入液氮充分研磨成粉状物后，利用真菌DNA提取试剂盒(
plant mini kit，QIAGEN公司产品)制备菌株DNA。
3.用实施例2相同的方法对共14个菌株的实时荧光PCR反应
4.结果分析
实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR仪分析软件(7500FAST 2.0)，对扩增的图谱进行分析，当初始循环数(CT)≤35时，判定实时荧光PCR反应为阳性。测试结果的扩增的图谱如图2。图2表明，参试的14个菌株中只有阳性对照油菜茎基溃疡病菌(ATCC 200782)有良好的扩增曲线，其CT值为12.67；其余13个近似种及菌株均无扩增反应，表明用本试剂及其建立的实时荧光PCR方法对油菜茎基溃疡病菌的检测具有良好的特异性。
实施例4油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR检测的灵敏度试验
1、参试菌株
油菜茎基溃疡病菌标准菌株(ATCC编号；200782)。
2、油菜茎基溃疡病菌DNA的制备
取少量培养的油菜茎基溃疡病菌菌丝，加入液氮充分研磨成粉状物后，利用真菌DNA提取试剂盒(
plant mini kit，QIAGEN公司产品)制备菌株DNA。将菌丝DNA的浓度分别定量至100ng/μL，然后用EASY DILUTION(TaKaRa公司产品)分别稀释到如下浓度：
5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL、5fg/μL和0.5fg/μL。
3、实时荧光PCR反应
用实施例2相同的方法对各浓度的菌株DNA进行实时荧光PCR反应，每个浓度设置三次重复试验。
4、结果分析
实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光7500FAST PCR仪分析软件，对扩增的图谱进行分析，当初始循环数(CT)≤35时，判定实时荧光PCR反应为阳性。
扩增的图谱如图3。图3表明，菌丝DNA的浓度从5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL均有良好的扩增曲线，CT平均值从小到大依次为16.2、19.89、23.54、27.29、30.87、34.44、34.48和36.99，因此，所建立的油菜茎基溃疡病菌real-timePCR检测的灵敏度可达10fg的菌丝DNA。并且，图4可见，菌丝DNA的浓度在5ng/μL～50fg/μL范围内，real-time PCR具有良好的线性关系，在此范围内，可对未知的油菜茎基溃疡病菌DNA进行定量分析。
SEQUENCE LISTING
<110>江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
<120>油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR分子检测试剂盒及其检测方法
<130>20100102
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>LMf
<400>1
gtttccttgg tgggcttgc 19
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>LMr
<400>2
tgttactgac gctgactgca att 23
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>LMpro
<400>3
attggatccc ctaaaacc 18
Claims (2)
1.一种油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR分子检测试剂盒，其特征是包括如下试剂：
基因表达通用混合试剂，
ddH2O；
探针与引物的混合物，由5μmol·L-1的LMpro探针、18μmol·L-1的LMf上游引物和18μmol·L-1 LMr的下游引物组成；
阳性对照：浓度为100ng/μL的油菜茎基溃疡病菌DNA溶液；
所说的LMf上游引物序列为5’-GTTTCCTTGGTGGGCTTGC-3’，
所说的LMr下游引物序列为5’-TGTTACTGACGCTGACTGCAATT-3’，
所说的LMpro探针序列为5’FAM-ATTGGATCCCCTAAAACC-NFQ-MGB3’，
其中，FAM为荧光报告基团，NFQ(Non-Fluorescent Quencher)为非荧光淬灭基团，MGB(Minor Groove Binder)为修饰基团。
2.用权利要求1的试剂盒检测油菜茎基溃疡病菌的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)实时荧光PCR反应：
以所得样品DNA为模板，进行实时荧光PCR反应；实时荧光PCR反应体系含有：10μL的基因表达通用混合试剂，1μL探针与引物的混合物，2μL样品DNA，7μL的ddH2O，反应总体积为20μL；实时荧光PCR的反应条件为：95℃反应10min；95℃反应15sec，60℃反应60sec，共40个循环；
(3)结果分析：
实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR仪分析软件，对扩增的图谱进行分析，当初始循环数(CT)≤35时，判定实时荧光PCR反应为阳性，表示所检测的样品中含有油菜茎基溃疡病菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010190260633A CN101928779B (zh) | 2010-02-08 | 2010-02-08 | 油菜茎基溃疡病菌实时荧光pcr分子检测试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010190260633A CN101928779B (zh) | 2010-02-08 | 2010-02-08 | 油菜茎基溃疡病菌实时荧光pcr分子检测试剂盒及其检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101928779A CN101928779A (zh) | 2010-12-29 |
| CN101928779B true CN101928779B (zh) | 2012-11-14 |
Family
ID=43368208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010190260633A Expired - Fee Related CN101928779B (zh) | 2010-02-08 | 2010-02-08 | 油菜茎基溃疡病菌实时荧光pcr分子检测试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101928779B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102277430A (zh) * | 2011-08-02 | 2011-12-14 | 李鑫 | 油菜茎基溃疡病菌分子标准样品及其制备方法 |
| CN103255207A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-08-21 | 内蒙古农牧业科学院 | 一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法 |
| CN104818339B (zh) * | 2015-05-29 | 2017-12-08 | 舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心 | 一种油菜茎基溃疡病菌的检测方法 |
| CN109371164B (zh) * | 2018-12-21 | 2020-04-10 | 华中农业大学 | 油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用 |
| CN112680538B (zh) * | 2020-12-25 | 2023-08-18 | 重庆海关技术中心 | 十字花科蔬菜黑胫病菌独行菜变种实时荧光pcr检测用引物、试剂盒及检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1824801A (zh) * | 2005-12-29 | 2006-08-30 | 重庆大学 | 柑桔溃疡病菌实时荧光pcr检测引物、探针、固相化试剂盒及其检测方法 |
-
2010
- 2010-02-08 CN CN2010190260633A patent/CN101928779B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1824801A (zh) * | 2005-12-29 | 2006-08-30 | 重庆大学 | 柑桔溃疡病菌实时荧光pcr检测引物、探针、固相化试剂盒及其检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| B.D.L. Fitt et al..World-wide importance of phoma stem canker (Leptosphaeria maculansand L. biglobosa) on oilseed rape (Brassica napus).《European Journal of Plant Pathology》.2006,第114卷(第1期),3-15. * |
| M.-H. BALESDENT et al..Quantification of Leptosphaeria maculans Growth in Cotyledons of Brassicanapus Using ELISA.《Journal of Phytopathology》.2008,第143卷(第2期),65-73. * |
| 吴兴海等.番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测方法研究.《江西农业学报》.2007,第19卷(第3期),34-36. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101928779A (zh) | 2010-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bai et al. | Analysis of the community compositions of rhizosphere fungi in soybeans continuous cropping fields | |
| Kluber et al. | Distinctive fungal and bacterial communities are associated with mats formed by ectomycorrhizal fungi | |
| CN101974650B (zh) | 一种检测尖孢镰刀菌的pcr方法及试剂盒 | |
| CN101928779B (zh) | 油菜茎基溃疡病菌实时荧光pcr分子检测试剂盒及其检测方法 | |
| Martín et al. | Real-time PCR detection of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum | |
| CN104774955B (zh) | 一种葡萄座腔菌的检测方法 | |
| CN105063761A (zh) | 一种用dna条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法 | |
| CN104593502A (zh) | 一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用 | |
| CN104232782A (zh) | 一种检测烟草土传真菌病原物的pcr引物及应用与方法 | |
| Zhenyan et al. | Simultaneous detection of four pathogens in Dendrobium officinale by nested multiplex PCR assay | |
| Chowdappa et al. | Existence of two genetically distinct populations of Colletotrichum gloeosporioides Penz in mango from India | |
| CN101086015B (zh) | 一种香菇45菌种的分子特异标记及其获得方法与应用 | |
| CN102134602A (zh) | 转Xa21基因水稻或其制品检测用引物和探针、试剂盒及方法 | |
| CN104293957B (zh) | 一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法 | |
| CN105462971A (zh) | 水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记及其专用引物 | |
| CN101086017B (zh) | 一种香菇507菌种的分子标记及其获得方法与应用 | |
| Kotba et al. | Morphological and phylogenetic diversity of Rhizoctoniasolani Kühn (Cantharellales: Ceratobasidiaceae) isolates affecting different hosts plants in Morocco | |
| CN114645096A (zh) | 一种用于检测腐皮镰孢菌的微滴式数字pcr试剂盒 | |
| CN103290000B (zh) | 生防绿木霉的scar标记及其应用和定量检测方法 | |
| CN103911457A (zh) | 鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法 | |
| Schulze et al. | Identification techniques for Armillaria spp. and Heterobasidion annosum root and butt rot diseases: A critical review | |
| Faedda et al. | Development of a Real-Time PCR Assay for the Early Detection of the Eucalyptus Pathogen Quambalaria eucalypti | |
| CN104017875B (zh) | 用于检测毒麦的引物对、探针及其检测方法 | |
| Deng et al. | First specific detection and validation of tomato wilt caused by Fusarium brachygibbosum using a PCR assay | |
| CN103215374A (zh) | 鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121114 Termination date: 20130208 |