KR101868209B1 - 곤충 이물 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식품에서 발견된 이물이 특정 곤충인지 여부를 원스탑으로 분석할 수 있는 유전자 분석 방법 및 유전자 분석용 키트에 대한 것이다.

Description

곤충 이물 분석 방법{ANALYSIS METHOD OF INSECT FOREIGN BODIES}
본 발명은 식품에서 발견된 곤충 이물의 분석 방법에 대한 것이다.
식품의 제조, 유통 및 판매와 관련하여, 식품 내 유입된 이물은 식품의 안전성을 위협할 뿐 아니라, 기업의 품질 신뢰도에 위해를 미치는 중요한 요소이다. 식품공전에서는 식품 이물의 종류를 동물성, 식물성, 광물성 이물로 분류하고 있으며, 식품위생법(HACCP)에서는 생물적, 화학적, 물리적 위해 요소로 분류하고 있다. 최근 주로 발생하여 신고되는 식품 내 이물로는 머리카락, 탄화물 및 금속류 등의 물리적 위해 요소와 작은 동물의 사체 및 곤충류의 생물학적 위해 요소가 있다. 특히 생물학적 위해 요소는 소비자의 혐오감을 불러일으킬 수 있으며 나아가 기업의 이미지 하락을 가져온다.
이 때문에 각 식품 관련 기업에서는 이물의 추적, 관리에 중점을 두고 있는데, 예컨대, 한국등록특허 10-1316702호에는 식품에서 발견된 곤충 이물에 대하여 사멸일로부터의 경과일을 계산하는 방법이 개시되어 있다.
한편, 식품은 생산 공장, 지점, 도매업소, 대형 또는 소형 판매점, 식당 등의 여러 단계를 거쳐 최종 소비자에게 도달하게 되며, 많은 경우 곤충 이물이 상당히 훼손된 상태로 발견되게 된다. 그러므로 발견된 이물이 어느 곤충인지 신속 정확하게 동정하기 어려운 문제점이 있다. 또한 곤충 이물이 훼손 될 경우 형태학적인 방법을 통한 동정은 거의 불가능 하며, 곤충에서 발생하는 효소 분석법 역시 비열처리 맥주와 같은 특정 종류의 식품들에는 적용하기 어렵기 때문에, 여러 식품에 보편적으로 적용 가능한 유적학적으로 동정할 수 있는 방법의 개발이 필요한 상황이다.
그러므로 곤충 이물을 유전학적으로 동정하고자 하는 분석법이 개발되었는데, 이는 생물체의 가장 정확한 고유 정보인 유전자 분석을 이용하는 방법으로, 생물종을 가장 빠르고 정확하게 식별할 수 있다. 그러나 종래 유전학적 동정 방법으로는 식품에서 발견된 이물이 곤충인지 여부만 확인할 수 있고, 어느 곤충인지 구체적으로 확인하기 위하여는 PCR 증폭 산물을 시퀀싱하여 대조군과의 염기서열을 비교하는 등의 추가적인 단계적 동정 및 분석이 필요한 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 신속 정확한 곤충 이물 분석 방법을 연구하던 중, 한국에서 식품에 가장 많이 유입되는 곤충들 중 6종의 곤충을 선별하고, 이들에 특이적인 프라이머 쌍들을 개발하여 곤충 이물을 곤충 여부 확인 후 대조군들과의 순차적 염기서열 확인의 단계적 PCR이 아닌, 1 단계 PCR 수행으로 한 번에 분석할 수 있는 방법을 완성하였다.
본 발명의 목표는 식품에서 발견된 곤충 이물의 종류를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 특정 프라이머 쌍들을 이용한 시료의 분석 방법 및 분석 키트를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 특정 프라이머 쌍들을 이용한 PCR을 수행함으로써 시료가 특정 곤충인지 여부를 원스탑 공정으로 확인할 수 있다.
도 1은 종래 프라이머쌍을 이용하여 시료의 DNA를 분석한 결과이다(도 1, 레인 M: 100bp DNA ladder, 레인 1:꿀벌 시료, 레인 2: 바퀴 시료, 레인 3: 초파리 시료, 레인 4: 집파리 시료, 레인 5: 모기 시료, 레인 6: 나방 시료, 레인 N: 음성 대조군).
도 2는 여러 개의 프라이머쌍들에 대하여 꿀벌의 타겟 유전자, 바퀴의 타겟 유전자 및 초파리의 타겟 유전자와의 반응성을 평가한 결과이다.
도 3은 여러 개의 프라이머쌍들에 대하여 집파리의 타겟 유전자, 모기의 타겟 유전자 및 나방의 타겟 유전자와의 반응성을 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 특정 곤충들에 대한 특이성을 확인한 결과이다(레인 M: 100bp DNA ladder, 레인 1: 꿀벌 시료, 레인 2: 바퀴 시료, 레인 3: 초파리 시료, 레인 4: 집파리 시료, 레인 5: 모기 시료, 레인 6: 나방 시료, 레인 N: 음성 대조군, (A): 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 이용, (B): 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍 이용, (C): 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍 이용, (D): 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍 이용, (E): 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍 이용, (F): 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍 이용).
도 5는 시료로부터 추출한 gDNA의 농도에 따른 본 발명의 프라이머 쌍들의 검출한계를 평가한 결과이다((A): 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 이용하여 꿀벌의 DNA 증폭, (B): 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍 이용하여 바퀴의 DNA 증폭, (C): 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍 이용하여 초파리의 DNA 증폭, (D): 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍 이용하여 집파리의 DNA 증폭, (E): 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍 이용하여 모기의 DNA 증폭, (F): 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍 이용하여 나방의 DNA 증폭).
도 6은 맥주에서 30일간 혼입된 시료로부터 추출한 DNA에 대하여, 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 분석한 결과이다(레인 M: 100bp DNA ladder, 레인 p: 양성 대조군, 레인 1: 꿀벌 시료, 레인 2: 바퀴 시료, 레인 3: 초파리 시료, 레인 4: 집파리 시료, 레인 5: 모기 시료, 레인 6: 나방 시료, 레인 N: 음성 대조군, (A): 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 이용, (B): 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍 이용, (C): 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍 이용, (D): 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍 이용, (E): 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍 이용, (F): 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍 이용).
본 발명은
시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
하기 (a) 내지 (f)의 프라이머 쌍들 중 하나 이상의 쌍을 이용하여 상기 DNA에 대하여 PCR을 수행하는 단계;
상기 PCR 결과를 확인하는 단계;및
상기 확인된 PCR 결과로부터 상기 시료의 종류를 확인하는 단계를 포함하는 시료의 분석 방법에 대한 것이다:
(a) 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍
(b) 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍
(c) 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍
(d) 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍
(e) 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍
(f) 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍.
또한 본 발명은
하기 (a) 내지 (f)의 프라이머 쌍들 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 시료의 유전자 분석용 키트에 대한 것이다:
(a) 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍
(b) 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍
(c) 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍
(d) 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍
(e) 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍
(f) 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
시료
본 발명의 시료는 식품 등에서 발견된 이물이다. 상기 이물은 곤충으로 생각되나, 사체가 훼손, 분해, 부패 등이 진행되어 정확한 곤충 종류의 확인이 육안으로 곤란한 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 시료는 시료로부터 gDNA의 추출이 가능한 것이 바람직하다.
상기 식품은 사람 또는 동물이 섭취하거나 섭취할 수 있는 일반적인 식품이면 되고 특별히 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 식품은 일반적으로 가공, 유통되는 식품이다. 예컨대 상기 식품은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료, 파우더 제제 및 비타민 복합제, 가공식품, 레토르트 식품, 건강기능식품, 건강보조식품, 인스턴트 식품, 음료수, 맥주, 소주 등의 주류 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 맥주, 소주 등의 주류이나 이에 제한되는 것은 아니다.
DNA 추출 단계
본 발명은 시료로부터 DNA를 추출하는 단계를 포함한다. 상기 DNA는 genomic DNA인 것이 바람직하다. 상기 DNA 추출은 공지의 방법을 적절히 수행하면 되고, DNA 추출 방법이 특별히 제한되는 것은 아니다.
프라이머 쌍을 이용한 PCR 수행 단계
본 발명은 하기 (a) 내지 (f)의 프라이머 쌍들 중 하나 이상의 쌍을 이용하여 시료로부터 추출한 DNA에 대하여 PCR을 수행하는 단계를 포함한다.
(a) 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍
(b) 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍
(c) 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍
(d) 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍
(e) 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍
(f) 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍.
상기 PCR은 상기 프라이머 쌍들 중 하나 이상을 이용하여 일반적인 PCR 방법으로 수행하면 되고, 특별히 방법이나 조건 등이 제한되는 것은 아니다. 이 때, 상기 시료가 벌인지 여부를 확인하기 위하여는 (a) 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 된다. 만약, 상기 시료가 바퀴인지 여부를 확인하기 위하여는 (b) 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 된다. 만약, 상기 시료가 초파리인지 여부를 확인하기 위하여는 (c) 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 된다. 만약, 상기 시료가 집파리인지 여부를 확인하기 위하여는 (d) 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 된다. 만약, 상기 시료가 모기인지 여부를 확인하기 위하여는 (e) 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 된다. 만약, 상기 시료가 나방인지 여부를 확인하기 위하여는 (f) 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 된다.
물론, 훼손되어 육안으로 종류를 판단하기 어려운 시료의 경우 대부분 상기 (a) 내지 (f)의 프라이머쌍 모두를 이용하여 각각에 대하여 PCR을 동시 다발적으로 수행하는 것이 시간 및 비용 대비 가장 효율이 높을 것이다. 이는 한국에서 식품에 가장 많이 혼입되는 곤충 종류가 상기 벌, 바퀴, 초파리, 집파리, 모기 및 나방이라는 점을 고려한 것이다.
PCR 결과 확인 단계
본 발명은 본 발명의 프라이머 쌍들을 이용하여 DNA를 PCR로 증폭시키고, 그 PCR 결과를 확인하는 단계를 포함한다. 상기 PCR 결과를 확인하는 단계는 PCR 증폭 결과를 전기영동을 통하여 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 PCR 결과의 확인으로, 시료의 DNA가 어느 프라이머 쌍을 이용 시 증폭되는지를 알 수 있다.
시료의 종류 확인 단계
본 발명은 상기 확인된 PCR 결과로부터 상기 시료의 종류를 확인하는 단계를 포함한다. 상기 시료의 종류 확인 단계는 시료가 꿀벌, 바퀴, 초파리, 집파리, 모기 및 나방으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인지 여부를 확인하는 단계일 수 있다. 즉, 상기 시료의 종류 확인 단계에서는 시료가 꿀벌인지, 바퀴인지, 초파리인지, 집파리인지, 모기인지, 나방인지, 아니면 상기 6개 곤충 어디에도 속하지 않는지 여부를 확인할 수 있다.
시료의 분석 방법
본 발명의 시료의 분석 방법은 한국에서 식품, 특히 맥주 내 유입 가능성이 높은 6종의 곤충(양봉꿀벌, 독일바퀴, 빨간집모기, 노랑초파리, 화랑곡나방, 독일바퀴)에 대한 유전학적 동정 분석법이다. 맥주 등의 식품, 음료에 혼입된 곤충 이물의 형태가 변형된 경우에도 본 발명의 분석 방법을 이용하여 곤충의 DNA를 유전학적으로 동정하고, 곤충 이물의 유입경로 등의 원인 파악을 위한 기초 자료로 활용할 수 있다.
본 발명의 시료의 분석 방법은 시료가 꿀벌, 바퀴, 초파리, 집파리, 모기 및 나방으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인지 여부를 확인하기 위하여, 상기 (a) 내지 (f)의 프라이머 쌍들을 이용한 PCR 외 추가적인 PCR이 필요하지 않다. 이는 본 발명의 큰 이점인데, 종래의 프라이머 쌍들을 이용하는 경우에는 1회 PCR 수행 시 시료가 곤충이라는 것까지는 확인이 가능했지만, 특정 곤충인지 또는 특정 곤충이 아닌지 여부는 추가적인 PCR을 단계적으로 수행하여야 했기 때문이다.
시료의 유전자 분석용 키트
본 발명은 하기 (a) 내지 (f)의 프라이머 쌍들 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 시료의 유전자 분석용 키트에 대한 것이다.
(a) 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍, (b) 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍
(c) 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍, (d) 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍
(e) 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍, (f) 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍.
상기 키트는 상기 시료가 꿀벌, 바퀴, 초파리, 집파리, 모기 및 나방으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인지 여부를 확인하기 위한 것이다. 즉, 본 발명의 키트를 이용하여, 상기 시료가 꿀벌인지, 바퀴인지, 초파리인지, 집파리인지, 모기인지, 나방인지, 아니면 상기 6개 곤충 어디에도 속하지 않는지 여부를 확인할 수 있다. 상기 시료는 식품에서 발견된 이물인 것이 바람직하다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
본 발명에서는 하기 6 종의 곤충(초파리, 집파리, 빨간집모기, 화랑곡나방, 독일바퀴 및 꿀벌)을 이용하여 시험을 수행하였다(표 1). 상기 곤충들은 서울대학교 농업생명공학부로부터 표준 시료로써 수득하였으며, 상기 표준 곤충은 온전한 성충의 형태로 입수하여 분해와 같은 성분 변화가 일어나지 않도록 급속동결한 후 시험에 이용하였다.
Figure 112015090261446-pat00001
MtCOI 유전자 정보 탐색 및 비교 분석
Mitochondrial Cytochrome C Oxidase I(mtCOI) 유전자는 종 간의 구별에 많이 쓰이는 유전자로 NCBI Genebank data를 토대로 각 곤충의 mtCOI 유전자 정보를 확보 하였다. 그리고 NCBI의 blast 유전자 정보 비교 분석 기능을 통해 유전자를 비교 하였다.
Genomic DNA 추출
모든 곤충의 genomic DNA는 Accuprep Genomic DNA Extraction kit (bioneer, Korea) 을 이용하여 추출하였으며, 추출방법은 제조사에서 제공한 실험방법과 동일한 방법을 사용하였다. 추출 전 분쇄과정은 곤충을 -60℃에서 급격히 냉동시킨 후 1.5ml tube에 넣어 멸균된 pestle을 이용하여 1차 분쇄하였다. 그 후 적정량의 1.0mm Zirconium oxide bead와 tissue lysis buffer 500㎕를 첨가한 후 조직파쇄기(Bullet Blender-24, NEXT ADVANCE社)를 이용하여 homogenizing을 10분간 수행하였다. 그리고 원심분리기로 spin down 후 상등액을 모두 취하여 Genomic DNA를 추출하였다. 최종적으로 column 내의 silica gel membrane에 흡착된 DNA는 증류수를 첨가하여 centrifuge (Micro17TR, Hanil science, Korea) 를 이용하여 13,000×g로 원심분리하여 column 내의 silica gel membrane에 결합된 genomic DNA를 분리하였다.
프라이머 제작
본 연구에서는 곤충의 DNA 중 가장 보존력이 우수한 단백질 코딩 유전자인 Mitochondrial Cytochrome C Oxidase I(mtCOI) 유전자 및 Cytochrome P450를 타겟으로 하여 프라이머(primer)를 제작하였다. Forward 및 reverse primer 쌍은 모두 20-mer의 올리고뉴클레오타이드로 구성되도록 제작하여 곤충의 특정 염기서열과 상보적으로 결합해 400 bp 미만의 증폭산물을 얻을 수 있도록 제작 하였다. forward primer와 reverse primer 쌍은 HPLC 정제를 하여 순도를 높였고, Bionics Company (Seoul, Korea) 로부터 합성되었다.
PCR
PCR은 T-Gradient thermoblock (Biometra, German) 장비로 수행하였다. PCR을 위한 혼합액의 총 량은 최종 25 ㎕이 되도록 하였고, 혼합액에는 DNA template 50 ng, 10×buffer (Solgent, Korea), 각각의 dNTP (Solgent, Korea)200 uM, h- Taq DNA polymerase (Solgent, Korea) 1 unit, 각 target에 따른 primer 쌍 10pM을 첨가하여 PCR을 진행하였다.
PCR 조건은 pre-incubation을 94 ℃ 에서 5 분간 진행하고 난 후 denaturation을 94 ℃ 에서 30초, annealing을 60 ℃ 에서 30초, extension 을 72 ℃ 에서 30초씩 각각 진행하여 총 40회 반복하였다. 그리고 마지막으로 terminal elongation 을 72 ℃ 에서 10분 동안 진행하여 수행하였다.
전기영동
PCR 증폭결과는 전기영동을 통하여 확인하였다. 전기영동 장비는 Mupid-21(Cosmo bio, Japan)를 사용하였으며, 3% agarose gel에 100V로 약 30분간 전기영동 하여 결과를 확인하였다.
<실험예 1> mtCOI 유전자 정보 탐색 및 비교 분석
초파리, 집파리, 빨간집모기, 화랑곡나방, 독일바퀴 및 꿀벌의 Mitochondrial Cytochrome C Oxidase I(mtCOI) 유전자에 대하여 염기 서열을 비교하였다.
그 결과, 바퀴벌레, 초파리, 집파리의 경우 서로 80% 이상의 상동성을 보여 유전적으로 상당히 가까우며, 이들의 구별이 쉽지 않을 것으로 판단되었으며, 벌, 모기, 나방의 경우 상대적으로 염기서열의 유사성이 낮았다(표 2).
Figure 112015090261446-pat00002
None: 유사성이 0%로, 유사한 염기서열이 전혀 없음.
<실험예 2> 종래 프라이머 쌍을 이용한 mtCOI 유전자의 증폭
Folmer et al.(DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome coxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates, Molecular Marine Biology and Biotechnology (1994) 3(5), 294-299)에 기재된 방법으로 초파리, 집파리, 빨간집모기, 화랑곡나방, 독일바퀴 및 꿀벌의 Mitochondrial Cytochrome C Oxidase I(mtCOI) 유전자를 증폭하였다.
구체적으로는 Folmer et al.에 기재된 mtCOI 유전자를 증폭시킬 수 있는 한 쌍의 프라이머(LCO1490, HCO2198, 표 3)인 "universal" DNA primers for polymerase chain reaction (PCR) amplification of a 710-bp fragment of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I gene (COI)”를 이용하여 mtCOI 유전자를 증폭시키고, 2차적으로 증폭산물의 DNA sequencing을 통해 곤충을 동정하였다. 상기 Folmer et al.에 의하면 상기 프라이머 쌍을 이용 시 약 700bp 가량의 증폭산물이 생성되게 되어 있다.
Figure 112015090261446-pat00003
그 결과, 각 곤충들에 대하여 약 650bp 가량의 mtcoI gene의 PCR 증폭산물들이 확인되었다. 그러나 재현성이 낮았으며, 타겟 사이즈 외 기타 미지의 증폭산물들이 동시에 발생되었다. 또한 곤충에 따라 적절한 PCR 조건이 상이하고, 동정을 위해서는 추가 시퀀싱(sequencing) 작업이 필요하여, 한 번의 시퀀싱으로는 곤충의 종류를 판별하기 곤란하였다. 그러므로 미지의 혼입 곤충에 적용 시 분석시간이 길고 곤충의 종류를 판별하기 위해서는 여러 단계에 걸쳐 여러 번 PCR을 수행하여야 할 것으로 판단되었다(도 1, Lane M: 100bp DNA ladder, 레인 1: 꿀벌 시료, 레인 2: 바퀴 시료, 레인 3: 초파리 시료, 레인 4: 집파리 시료, 레인 5: 모기 시료, 레인 6: 나방 시료, 레인 N: 음성 대조군). 이 때, 음성 대조군은 타겟 유전자의 DNA 대신 증류수를 넣은 것을 제외하고 그 외 프라이머, dNTP, Taq polymerase, 버퍼 등은 다른 실험군들과 동일하게 처리한 대조군이다.
<실험예 3> 프라이머 평가
초파리, 집파리, 빨간집모기, 화랑곡나방, 독일바퀴 및 꿀벌에 대하여 400 bp 이하의 증폭 산물을 생성할 수 있도록 복수 개의 프라이머 쌍들을 제작하여, 타겟 유전자와 반응성을 갖는 프라이머쌍을 선별하였다. 이 때, 집파리의 경우 초파리와 상동성이 높아 쉽게 구분할 수 있도록 곤충 체내에서 대사과정을 담당하는 단백질을 코딩하는 Cytochrome P450유전자를 mtCOI유전자와 함께 target 유전자로 선정하였으며, 그 외 5종에 대해서는 곤충의 세대가 지나도 크게 변화되지 않고 보존되는 mtCOI유전자를 타겟으로 하였다. 상기 프라이머의 제작 시 NCBI Genebank data에 나타난 각 곤충의 유전자의 염기서열 정보를 기초로 이용하였다(표 4).
Figure 112015090261446-pat00004
Figure 112015090261446-pat00005

PCR을 통해 제작한 사이즈와 상기 표 4의 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행한 증폭산물의 사이즈를 비교하여 일치하는지의 여부를 통해 곤충 별 프라이머들을 평가하였다. 그 결과, 꿀벌의 경우 4F 및 4R의 프라이머쌍이, 바퀴의 경우 1F 및 1R의 프라이머쌍이, 초파리의 경우 2F 및 2R의 프라이머쌍이 100bp DNA ladder와 일치하는 결과를 보였다 (도 2, 레인 M: 100bp DNA ladder). 또한 집파리의 경우 N5F 및 N5R의 프라이머쌍이, 모기의 경우 3F 및 3R의 프라이머쌍이, 그리고 나방의 경우 3F 및 3R의 프라이머쌍이 100bp DNA ladder와 일치하는 결과를 보였다(도 3, 레인 M: 100bp DNA ladder). 그러므로 상기 프라이머쌍들이 타겟 곤충 유전자에 유효한 것으로 나타났으며, 그 외 다른 프라이머쌍들은 타겟 곤충 유전자에 반응성을 나타내지 않았다.
<실험예 4> 프라이머 제작 및 확인
상기 실험예 3에서 타겟 유전자에 반응성을 갖는 것으로 나타난 프라이머쌍들에 대하여 곤충에 대한 특이성을 평가하였다. 즉, 모든 실험들에서 꿀벌, 바퀴, 초파리, 집파리, 모기 및 나방 순으로 각각 그것들의 genomic DNA를 사용하였다. 프라이머들은, 상기 표 4의 프라이머쌍들 중 꿀벌의 경우 4F 및 4R의 프라이머쌍, 바퀴의 경우 1F 및 1R의 프라이머쌍, 초파리의 경우 2F 및 2R의 프라이머쌍, 집파리의 경우 N5F 및 N5R의 프라이머쌍, 모기의 경우 1F 및 3R의 프라이머쌍, 그리고 나방의 경우 3F 및 3R의 프라이머쌍이 반응성을 보였는데, 이들 프라이머쌍들을 대상으로 곤충 별 특이성을 평가하였다(표 5).
이 때, 집파리의 경우 초파리와 상동성이 높아 쉽게 구분할 수 있도록 곤충 체내에서 대사과정을 담당하는 단백질을 코딩하는 Cytochrome P450유전자를 target 유전자로 선정하였으며, 그 외 5종에 대해서는 곤충의 세대가 지나도 크게 변화되지 않고 보존되는 mtCOI유전자를 타겟으로 하였다. 이는 각 곤충 별 NCBI의 유전정보를 토대로 제작한 각 타겟 유전자들의 증폭산물의 사이즈와 하기 표 5의 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행한 증폭산물의 사이즈가 일치하는지 여부를 통하여 곤충 별 프라이머들에 대한 특이성을 확인한 것이다. 하기 표 5의 프라이머 쌍들은 상기 실험예 3에서 곤충별로 반응성이 확인된 프라이머들인데, 본 실험예에서는 이들이 타겟 곤충이 아닌 비타겟 곤충의 DNA와 반응성이 있는지 여부, 즉 타겟 곤충에 대한 “특이성” 여부를 확인하였다. 이 때 “특이성”이란, 프라이머 쌍이 해당 타겟 곤충에서만 반응성을 나타내어, NCBI의 유전정보를 토대로 제작한 해당 타겟 곤충의 타겟 유전자의 증폭산물과 동일한 사이즈의 증폭 산물을 형성하는 것을 의미한다.
Figure 112015090261446-pat00006
그 결과, 타겟 유전자에서 디자인한 사이즈와 동일한 사이즈의 증폭산물을 확인하여 타겟 특이성을 확인하였다. 또한 비 타겟 유전자에서는 증폭산물을 생성하지 않아 비 타겟 특이성을 확인하였다. 또한 재현성 검증을 완료하여 각각의 프라이머들을 통한 PCR시 곤충의 동정이 가능한 것이 확인되었다(도 4, 레인 M: 100bp DNA ladder, 레인 1: 꿀벌 시료, 레인 2: 바퀴 시료, 레인 3: 초파리 시료, 레인 4: 집파리 시료, 레인 5: 모기 시료, 레인 6: 나방 시료, 레인 N: 음성 대조군, (A): 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 이용, (B): 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍 이용, (C): 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍 이용, (D): 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍 이용, (E): 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍 이용, (F): 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍 이용). 상기 표 5의 가장 오른쪽 사이즈가 곤충 유전자를 토대로 표 5의 프라이머 쌍들에 의하여 생기는 증폭 산물의 사이즈이다. 유전정보를 토대로 프라이머들을 제작한 것이므로 해당 곤충일 경우 정해진 사이즈의 증폭산물을 형성한다 그러므로, 도 4를 보면, 좌측에 DNA marker의 사이즈와 증폭산물의 사이즈를 비교해보면 각 곤충 별로 사이즈가 일치한다. 만약 사이즈가 일치 하지 않거나, 증폭이 이루어지지 않거나, 또는 타겟이 아닌 곤충의 DNA와 반응하여 증폭 산물을 형성한다면 이는 비 타겟 유전자부위가 증폭된 것으로서, 해당 프라이머 쌍이 특이성이 없다는 것을 의미하고, 이는 다시 말해 상기 프라이머 쌍이 해당 곤충의 구별을 위한 동정 분석에 사용할 수 없다는 것을 의미한다.
<실험예 5> 검출한계 평가
초파리, 집파리, 빨간집모기, 화랑곡나방, 독일바퀴 및 꿀벌에서 DNA를 추출하였다. 그리고 상기 gDNA들을 초기 농도에서 농도에서 10, 5, 3, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 ng/μl까지 희석하여 상기 표 5의 프라이머들의 LOD(Limit of Detection 검출한계)를 검증 하였다.
그 결과, 벌, 초파리, 집파리, 모기는 0.005 ng/μl 농도 까지 검출이 가능 하였으며, 바퀴벌레는 0.001 ng/μl, 나방은 0.05 ng/μl까지 검출이 가능한 것으로 확인되었다. 그러므로 상기 표 5의 프라이머들은 매우 낮은 농도의 DNA에서도 검출이 가능한 것으로 보아 검출한계가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다(도 5, (A): 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 이용하여 꿀벌의 DNA 증폭, (B): 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍 이용하여 바퀴의 DNA 증폭, (C): 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍 이용하여 초파리의 DNA 증폭, (D): 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍 이용하여 집파리의 DNA 증폭, (E): 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍 이용하여 모기의 DNA 증폭, (F): 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍 이용하여 나방의 DNA 증폭). 그러므로 혼입된 곤충 이물이 물리적으로 분리되어 극미량 존재하는 경우에도 본 발명의 방법으로 분석이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
<실험예 6>
본 발명의 분석 방법의 정확성을 검증하였다. 구체적인 방법은 하기와 같다. 각 곤충(초파리, 집파리, 빨간집모기, 화랑곡나방, 독일바퀴 및 꿀벌)을 1마리씩 맥주 500 ml 중병에 인위적으로 혼입시켜 타전 한 후에 30일간 방치하였다. 30일 경과 후 맥주 내에 존재하는 분해된 곤충으로부터 DNA를 무작위 추출하여, 표 5의 프라이머들을 적용하였다. 구체적으로는 각 곤충들의 DNA를 각각 상기 표 5의 6개의 프라이머 쌍들을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 때, 양성 대조군으로는 혼입되지 않고, 곤충 사후 즉시 채취한 DNA를 이용하였으며, 이를 표적 곤충과 비교하여 일치 여부를 확인하였다.
그 결과 양성 대조군(positive control) 과 30일 경과 후의 곤충에서 동일한 증폭 산물을 얻었으며, 표적이 아닌 기타 곤충에서는 증폭산물을 생성하지 않아, 맥주에 혼입된 곤충이 훼손, 분해되더라도 분석 결과가 상이하지 않다는 것을 확인하였다(도 6, 레인 M: 100bp DNA ladder, 레인 p: 양성 대조군, 레인 1: 꿀벌 시료, 레인 2: 바퀴 시료, 레인 3: 초파리 시료, 레인 4: 집파리 시료, 레인 5: 모기 시료, 레인 6: 나방 시료, 레인 N: 음성 대조군, (A): 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 이용, (B): 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍 이용, (C): 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍 이용, (D): 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍 이용, (E): 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍 이용, (F): 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍 이용). 그러므로 곤충이 식품에 유입되어 일정 시간 동안 유통된 경우에도 본 발명의 방법으로 분석이 가능하다는 것이 확인되었다.
<110> HITEJINRO <120> ANALYSIS METHOD OF INSECT FOREIGN BODIES <130> DNP150350 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> LCO1490 (Forward primer) <400> 1 ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> HCO2198 (Reverse primer) <400> 2 taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Bee-4 mtCOI Forward primer <400> 3 tcattcttca ccttcagtag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Bee-4 mtCOI Reverse primer <400> 4 ccagctaata caggtaatga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Blattella-1 mtCOI Forward primer <400> 5 cggagcttga tctggaatag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Blattella-1 mtCOI Reverse primer <400> 6 tacacctgca agatgtaatg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Fruit fly-2 mtCOI Forward primer <400> 7 gactactacc tcctgctctt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Fruit fly-2 mtCOI Reverse primer <400> 8 tcctgctagt actggaagtg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> House fly-N5 Cytochrome P450 Forward primer <400> 9 tgccgatgag agcaaggatt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> House fly-N5 Cytochrome P450 Reverse primer <400> 10 tactggcacc agaacaggag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Mosquito-1/3 mtCOI Forward primer <400> 11 aggtattcga tcaagagtaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Mosquito-1/3 mtCOI Reverse primer <400> 12 gctcatgctg gagcttcagt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Moth-3 mtCOI Forward primer <400> 13 ttgagctgtt ggtattactg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Moth-3 mtCOI Reverse primer <400> 14 ctccaccacc agcaggatca 20

Claims (18)

  1. 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    하기 (a) 내지 (f)의 프라이머 쌍들을 이용하여 상기 DNA에 대하여 PCR을 수행하는 단계;
    (a) 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍
    (b) 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍
    (c) 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍
    (d) 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍
    (e) 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍
    (f) 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍

    상기 PCR 결과를 확인하는 단계;및
    상기 확인된 PCR 결과로부터 상기 시료가 꿀벌, 바퀴, 초파리, 집파리, 모기 및 나방으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인지 여부를 확인하는, 시료의 종류를 확인하는 단계
    를 포함하는 시료의 분석 방법으로,
    이때 상기 시료의 분석 방법은, 시료가 꿀벌, 바퀴, 초파리, 집파리, 모기 및 나방으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 곤충인지 여부를 확인하기 위한 것인 시료의 분석 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 시료는 식품에서 발견된 이물인 것을 특징으로 하는 시료의 분석 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 시료의 분석 방법은 추가적인 PCR이 필요하지 않은 것을 특징으로 하는 시료의 분석 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 PCR 결과를 확인하는 단계는 PCR 증폭 결과를 전기영동을 통하여 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료의 분석 방법.
  5. 하기 (a) 내지 (f)의 프라이머 쌍들을 포함하는 시료의 유전자 분석용 키트로,
    상기 유전자 분석용 키트는 시료가 꿀벌, 바퀴, 초파리, 집파리, 모기 및 나방으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 곤충인지 여부를 확인하기 위한 것인, 시료의 유전자 분석용 키트:
    (a) 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍
    (b) 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍
    (c) 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍
    (d) 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍
    (e) 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍
    (f) 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 시료는 식품에서 발견된 이물인 것을 특징으로 하는 시료의 유전자 분석용 키트.

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